HaCaT rakud - naha bioloogia ja haiguste uurimine

2.haCaT rakkude geneetilised omadused ja päritolu

HaCaT rakud on täiskasvanud nahast pärit spontaanselt immortaliseeritud inimese keratinotsüütide rakuliin, mis esindab ainulaadset evolutsioonilist teed. Nendel rakkudel on mutatsioonid p53 geeni mõlemas alleelis, mis on tüüpiline UV-kiirguse poolt esilekutsutud mutatsioonidele [3,4]. Lisaks eeldatakse, et HaCaT rakud on tekkinud p53 kasvajasupressorgeeni mutatsioonide tulemusena, millele järgneb vananemisgeenide kadumine [5].

Kasvaja supressorgeen p53, mis on tuntud oma rolli poolest DNA parandamisel ja genoomi valvurina, kutsub esile inimese naha reaktsiooni DNA kahjustusele [4]. On täheldatud, et HaCaT rakud on osaliselt kaotanud oma kaitsemehhanismi DNA-kahjustuste eest p53 geeni in vivo mutatsiooni tõttu, mistõttu on nad vastuvõtlikud tsütogeneetiliste muutuste akumuleerumisele vastuseks kõrgendatud kultuuritemperatuuridele. Teine HaCaT rakkude immortaliseerimise mehhanism hõlmab telomeraasi ensüümi aktiivsuse suurenemist [7]. Normaalsetes rakkudes lühenevad telomeerid pidevalt iga rakkude jagunemisega, kuni rakkude vananemine saavutatakse. Telomeraas on spetsiaalne raku ensüümikompleks, millel on pöördtranskriptaasi aktiivsus, mis säilitab telomeeri stabiilset pikkust. Seevastu HaCaT rakkudel on telomeraasi aktiivsus märkimisväärselt suurenenud, mille tulemuseks on telomeeride pikkuse säilimine. Need tähelepanekud kinnitavad telomeraasi rolli HaCaT-rakkude immortaliseerimisprotsessis.

On tuvastatud kolm spetsiifilist kromosomaalset translokatsiooni, mille tulemuseks on kromosoomivarte 3p, 4p ja 9p ühe koopia kaotamine, 9q suurenemine ja isokromosoomi moodustumine. Kromosoomi 3p lühikese haru kaotus võib viia vananemisgeenide kadumiseni ja HaCaT-rakkude immortaliseerumiseni [8]. HaCaT rakud on hüpodiploidsed ja neil on erinevad ja stabiilsed markerkromosoomid, mis esindavad nende monokloonset päritolu. HaCaT rakuliini omadused ja pea kinnitati, kasutades DNA sõrmejälge hüpervariaablite minisatelliitmarkeritega [3-6].

3.kuidas koristada HaCaT rakke 5 lihtsa sammuga

4. Eemaldage kultuurikeskkond ja loputage kleepunud rakud, kasutades 3-5 ml PBS-i ilma kaltsiumi ja magneesiumita T25 kolbide puhul või 5-10 ml T75 kolbide puhul.
5. Lisage 1-2 ml värskelt valmistatud 0,05% EDTA lahust T25 kolbi kohta või 2,5 ml T75 kolbi kohta, tagades, et kogu rakukile on kaetud, ja inkubeerige 10 minutit 37 °C juures.
6. Lisage 1 ml värskelt valmistatud trüpsiini/EDTA (0,05%/0,025%) lahust T25 kolvi kohta või 2,5 ml T75 kolvi kohta, tagades jällegi rakukile täieliku katvuse. Rakud peaksid eralduma 1-2 minuti jooksul.
7. Trüpsiini aktiivsus peatatakse FBS-i sisaldava rakukultuurikeskkonna lisamisega.
8. Doseerige rakud uutesse kolvidesse, mis sisaldavad värsket rakukultuurikeskkonda.

4. HaCaT rakkude kasutamine

HaCaT rakud on väärtuslik vahend keratinotsüütide uurimiseks [9]. Need surematud rakud toimivad preneoplastiliste rakkudena ja võivad anda ülevaate muutustest, mis on seotud pahaloomulise ja neoplastilise transformatsiooniga [10]. Monokihilised HaCaT rakukultuurid on olulised rakutoksilisuse ja in vitro haavaparanemise analüüsi rakenduste jaoks. HaCaT rakke saab kasutada ka erinevate ainete ja neoplastiliste või põletikuliste protsesside põhjustatud naha toksilisuse hindamiseks. Neid saab kasutada nahaaluste allergiliste reaktsioonide erinevate mehhanismide, reaktiivsete hapnikuliikide mõju ja UV-kiirguse mõju analüüsimiseks. Stimulatsiooni korral võivad HaCaT-rakud diferentseeruda ja ekspresseerida spetsiifilisi diferentseerumise markereid, nagu involukriin, K14 ja K10. HaCaT rakke kasutatakse tavaliselt ka mudelina epidermise homöostaasi patofüsioloogia uurimiseks [6].

HaCaT-rakud säilitavad pärast siirdamist in vivo oma võime taastada struktureeritud epidermis, mille tulemuseks on kihiline epidermise struktuur, mida saab muutustega kaltsiumikontsentratsioonis keskkonnas muuta basaalse ja diferentseeritud seisundi vahel. Need rakud võimaldavad ka mitmete bioloogiliste protsesside iseloomustamist, näiteks nende kasutamist D-vitamiini mudelisüsteemina ja ainevahetust nahas. Kuna HaCaT rakud ei ole geneetiliselt muundatud, annavad nad erapooletu ülevaate inimese naha algsete geneetiliste sündmuste laiast spektrist.

5. Esile tõstetud videod: HaCaT rakkude maailma uurimine

"HaCaT rakkude ränne": See video tutvustab rakkude migratsiooni protsessi HaCaT rakkudes. Rakkude ränne on oluline protsess erinevate bioloogiliste protsesside, näiteks haavade paranemise ja vähi metastaaside tekkimise jaoks. Video demonstreerib HaCaT rakkude liikumist mikroskoobi all, andes visuaalse ülevaate nende rakkude rände toimimisest. Rakkude aktiivsust jälgitakse nende liikumisel ühest kohast teise ning video illustreerib selgelt muutusi, mis rakkudes selle protsessi käigus toimuvad.

"HaCaT-rakkudel teostatud Scratch Assay": Selles videos näidatakse HaCaT-rakkudel teostatud Scratch Assay't. Scratch Assay on laialdaselt kasutatav meetod rakkude migratsiooni uurimiseks ning antud juhul kasutatakse seda HaCaT rakkude migratsiooni analüüsimiseks. Video näitab, kuidas tekitatakse rakukultuuri tassi pinnale kriimustus, mida seejärel jälgitakse mikroskoobi all, kui HaCaT rakud migreeruvad ja sulgevad aja jooksul lõhe.

"HaCaT keratinotsüütide rakkude kasvamine haavade paranemise katsete jaoks": See video demonstreerib HaCaT-keratinotsüütide rakkude kasvu protsessi haavade paranemise katsete jaoks. HaCaT keratinotsüüdid on haava paranemise uuringutes sageli kasutatav rakuliin.

"HaCaT rakkude diferentseerimine": See video tutvustab HaCaT rakkude diferentseerimiseks vajalikke samme. HaCaT rakud võivad diferentseeruda erinevat tüüpi naharakkudeks. Video demonstreerib HaCaT-rakkude muutusi diferentseerumise käigus, esitades visuaalselt erinevaid diferentseerumise markereid ja omadusi. Diferentseerumisprotsess on naha normaalseks toimimiseks kriitilise tähtsusega ja video toob esile erinevad diferentseerumise etapid, mida HaCaT-rakud läbivad.

Viited

1. Angel P ja Karin M: Jun, Fos ja AP-1 kompleksi roll rakkude proliferatsioonis ja transformatsioonis. Biochim Biophys Acta 1072:129-157, 1991 Argyris TS: The regulation of epidermal hyperplastic growth. Crit Rev Toxicol 9:151-200, 1981
2. Baden HP, Kubilus J, Kvedar JC, Steinberg ML, Wolman SR: Inimese keratinotsüütide spontaanselt tekkiva pikaealise liini (NM-1) isoleerimine ja iseloomustamine. In Vitro Cell Dev Biol 23(3):205-13, 1987
3. Lehmann TA, Modali R, Boukamp P, Stanek J, Bennett WP, Welsh JA, Metcalf RA, Stampfer MR, Fusenig NE, Rogan EM, Harriss CC: p53 mutations in human immortalized epithelial cell lines. Carcinogenesis 14:833-839, 1993
4. Ziegler A-M, Leffell DJ, Kunala S, Sharma HW, Gailani M, Simon JA, Halperin AJ, Baden HP, Shapiro PE, Bale AE, Brash DE: Päikesevalgusest tingitud mutatsiooni hotspotid p53 geenis mittemelanoomiaga nahavähi korral. Proc Natl Acad Sci USA 90:4216-4220, 1993
5. Fusenig NE, Boukamp P. Inimese naha keratinotsüütide immortaliseerumise, pahaloomulise transformatsiooni ja kasvaja progresseerumise mitu etappi ja geneetilised muutused. Mol Carcinog. 1998;23(3):144-158.
6. Harle-Bachor C, Boukamp P: Telomeraasi aktiivsus inimese naha epidermise regeneratiivses basaalkihis ning surematutes ja kartsinoomsetest nahakeratinotsüütides. Proc Natl Acad Sci USA 93:6476-81, 1996
7. Colombo I, Sangiovanni E, Maggio R, et al. HaCaT rakud kui usaldusväärne in vitro diferentseerumismudel inimese keratinotsüütide põletikulise/remondivastuse lahtimõtestamiseks. Mediators Inflamm. 2017;2017:7435621.
8. Boukamp, P. et al. Normaalne keratiniseerumine spontaanselt immortaliseeritud aneuploidse inimese keratinotsüütide rakuliinis. J. Cell Biol. 106, 1996, 761-771.
9. Gibbs, Graham: Kvalitatiivsete andmete analüüsimine. The Sage qualitative research kit. London: Sage 978-0-7619-4980-0.
10. Hedrick TE, Bickman L, Rog DJ. 1993. Rakendusuuringute kavandamine: praktiline juhend. Sage: London
11. Boukamp P. Petrussevska R. T. Breitkreutz D. Hornung J. Markham A. Fusenig N. E. Normal keratinization in a spontaneously immortalized aneuploid human keratinocyte cell line. Cell Biol.(1988);106:761-771.