HaCaT-rakud – naha bioloogia ja haiguste uurimine
HaCaT-rakud on saadud inimese epidermise keratinotsüütidest ja neid kasutatakse tavaliselt epidermise homöostaasi ja sellega seotud patoloogiate uurimiseks. Neid rakke peetakse spontaanselt immortaliseeritud inimese keratinotsüütideks, mis on märkimisväärne, kuna need on saadud normaalsetest nahakeratinotsüütidest ilma kriisi või kasvu aeglustumiseta. See unikaalne päritolu annab HaCaT-rakkudele geneetilised ja kasvomadused, mis erinevad teistest rakuliinidest. Hoolimata sellest, et HaCaT-rakuliin näitab in vitro transformunud fenotüüpi kloonivõimega agaril või plastil, jääb see mittetuumorigeeniliseks. Olles esimene stabiilne epiteelrakkude liin täiskasvanud inimese nahast, mis näitab normaalset diferentseerumist, on HaCaT-rakud väärtuslikuks vahendiks keratinisatsiooni regulatsiooni uurimisel inimrakkudes. Nendel rakkudel on laiaulatuslikud rakendused tänu nende võimele in vitro efektiivselt paljuneda ja diferentseeruda.
- Kasvukeskkond
- Vaata tootelehte
- Kaksikordistumisaeg
- Vaata tootelehte
- Kasvutüüp
- Adherent
- Bioloogiline ohutustase
- BSL-1
- Saadaval
- Cytion — Telli HaCaT
- HaCaT-rakkude omadused
- HaCaT-rakkude geneetilised omadused ja päritolu
- Kuidas HaCaT-rakke 5 lihtsas sammus koguda
- HaCaT-rakkude rakendused
- Soovitatavad videod: HaCaT-rakkude maailma avastamine
HaCaT-rakkude omadused
HaCaT-rakke saab kasvatada madala kaltsiumitasemega tingimustes ja need on spindlikujulised ning neil puuduvad rakkudevahelised tihedad ühendused, nagu samades tingimustes kasvatatavatel primaarrakkudel. Normaalses epidermis arenevad keratinotsüüdid välja tüvirakkudest basaalkihis ning liiguvad edasi okas- ja terakihist, enne kui jõuavad sarvkihini ja kooruvad keskkonda. See rangelt reguleeritud tasakaal proliferatsiooni ja koorumise vahel toob kaasa täieliku uuenemise või muutuse iga 28 päeva järel – see on keeruline protsess, mida nimetatakse keratinisatsiooniks. See protsess on rangelt reguleeritud ja hõlmab märkimisväärseid muutusi geeniekspressioonis, struktuuris ja ensüümiaktiivsuses. In vitro ja in vivo analüüside jaoks peavad HaCaT-rakud säilitama inimese epidermise diferentseerunud kihtidele iseloomulikke epidermaalseid keratiine, mis on hädavajalikud naha struktuurilise terviklikkuse ja vastupidavuse säilitamiseks. Kuigi HaCaT-rakkudes võivad esineda järjestikused kromosoomimuutused, ei pruugi need olla seotud oluliste diferentseerumisprobleemidega, vaid näitavad hoopis inimese täiskasvanud keratinotsüütide spontaanset transformatsiooni in vitro.
HaCaT-rakkude geneetilised omadused ja päritolu
HaCaT-rakud on spontaanselt surematuks muutunud inimese keratinotsüütide rakuliin, mis pärineb täiskasvanud nahast ja esindab unikaalset evolutsioonilist arenguteed. Nendel rakkudel esinevad mutatsioonid p53-geeni mõlemas alleelis, mis on tüüpiline UV-kiirguse poolt indutseeritud mutatsioonidele [3,4]. Lisaks eeldatakse, et HaCaT-rakud on tekkinud p53-tuumorisupressorgeeni mutatsioonide tagajärjel, millele järgnes vananemisgeenide kadu [5].
Tuumori supressorgeen p53, mis on tuntud oma rolli poolest DNA parandamisel ja genoomi kaitsjana, indutseerib inimese naha reaktsiooni DNA kahjustustele [4]. On täheldatud, et HaCaT-rakud on osaliselt kaotanud oma kaitsemehhanismi DNA-kahjustuste vastu p53-geeni in vivo mutatsiooni tõttu, mis muudab nad vastuvõtlikuks tsütogeneetiliste muutuste kuhjumisele vastusena kõrgendatud kultiveerimistemperatuuridele. Teine HaCaT-rakkude surematust tagav mehhanism hõlmab telomeraasi ensüümi aktiivsuse suurenemist [7]. Normaalsetes rakkudes lühenevad telomeerid iga rakkude jagunemise järel pidevalt, kuni saavutatakse rakkude vananemine. Telomeraas on spetsialiseeritud rakuensüümikompleks, millel on pöördtranskriptaasi aktiivsus ja mis hoiab telomeeride pikkust stabiilsena. Seevastu HaCaT-rakkudel on telomeraasi aktiivsus märkimisväärselt suurenenud, mille tulemusena säilib telomeeride pikkus hästi. Need tähelepanekud kinnitavad telomeraasi rolli HaCaT-rakkude surematumaks muutumise protsessis.
On tuvastatud kolm spetsiifilist kromosoomide translokatsiooni, mille tulemuseks on kromosoomide 3p, 4p ja 9p ühe koopia kadu, 9q juurdekasv ja isokromosoomi moodustumine. Kromosoomi 3p lühikese haru kadu võib viia vananemisgeenide kadumiseni ja HaCaT-rakkude surematuseni [8]. HaCaT-rakud on hüpodiploidsed ja neil on selged ja stabiilsed markerkromosoomid, mis näitavad nende monoklonaalset päritolu. HaCaT-rakuliini omadused ja päritolu kinnitati DNA-sõrmejälgede analüüsi abil hüpervariabelsete minisatelliitmarkerite abil [3–6].
Kuidas koguda HaCaT-rakke 5 lihtsas sammus
- Eemaldage kasvukeskkond ja loputage adheseerunud rakke 3–5 ml kaltsiumi- ja magneesiumivaba PBS-ga T25-kolvide puhul või 5–10 ml T75-kolvide puhul.
- Lisage 1–2 ml värskelt valmistatud 0,05% EDTA lahust T25 kolbi kohta või 2,5 ml T75 kolbi kohta, tagades, et kogu rakukile on kaetud, ja inkubeerige 37 °C juures 10 minutit.
- Lisage 1 ml värskelt valmistatud trüpsiini/EDTA (0,05%/0,025%) lahust T25 kolbi kohta või 2,5 ml T75 kolbi kohta, tagades taas rakukihi täieliku katmise. Rakud peaksid eralduma 1–2 minuti jooksul.
- Peatage trüpsiini toime, lisades FBS-i sisaldavat rakukultuurikeskkonna.
- Jaotage rakud uutesse kolbidesse, mis sisaldavad värsket rakukultuurikeskkonna.
HaCaT-rakkude rakendused
HaCaT-rakud on väärtuslik vahend keratinotsüütide uurimiseks [9]. Need surematud rakud toimivad preneoplastiliste rakkudena ja võivad anda ülevaate muutustest, mis on seotud pahaloomulise ja neoplastilise transformatsiooniga [10]. HaCaT-rakkude ühekihilised kultuurid on hädavajalikud rakkude toksilisuse ja in vitro haavade paranemise analüüsimisel. HaCaT-rakke saab kasutada ka erinevate ainete põhjustatud nahatoksilisuse ning neoplastiliste või põletikuliste protsesside hindamiseks. Neid saab kasutada nahaliste allergiliste reaktsioonide erinevate mehhanismide, reaktiivsete hapnikuühendite mõju ja UV-kiirguse analüüsimiseks. Stimuleerimisel võivad HaCaT-rakud diferentseeruda ja ekspresseerida spetsiifilisi diferentseerumismarkereid, nagu involucrin, K14 ja K10. HaCaT-rakke kasutatakse sageli ka mudelina epidermise homöostaasi patofüsioloogia uurimiseks [6].
HaCaT-rakud säilitavad pärast siirdamist võime taastada in vivo struktureeritud epidermis, mille tulemuseks on kihiline epidermise struktuur, mida saab keskkonna kaltsiumikontsentratsiooni muutmise abil viia tagasi nii basaalseks kui ka diferentseerunud seisundiks. Need rakud võimaldavad ka mitmete bioloogiliste protsesside iseloomustamist, näiteks kasutamist D-vitamiini mudelisüsteemina ja ainevahetuse uurimist nahas. Kuna HaCaT-rakud ei ole geneetiliselt muundatud, annavad nad erapooletu ülevaate inimese naha esialgsete geneetiliste protsesside laia spektrist.
Soovitatavad videod: HaCaT-rakkude maailma avastamine
„HaCaT-rakkude ränne”: See video tutvustab HaCaT-rakkude ränneprotsessi. Rakkude ränne on oluline protsess mitmesuguste bioloogiliste protsesside puhul, nagu haavade paranemine ja vähi metastaasid. Video näitab HaCaT-rakkude liikumist mikroskoobi all, pakkudes visuaalset ülevaadet sellest, kuidas need rakud rändavad. Rakke jälgitakse, kui nad liiguvad ühest kohast teise, ning video illustreerib selgelt muutusi, mis rakkudes selle protsessi käigus toimuvad.
„HaCaT-rakkudel läbi viidud kriimustustest”: See video näitab HaCaT-rakkudel läbi viidud kriimustustesti. Kriimustustest on laialt kasutatav meetod rakkude rändamise uurimiseks ning käesoleval juhul kasutatakse seda HaCaT-rakkude rändamise analüüsimiseks. Video näitab kriimustuse tegemist rakukultuuri kausi pinnale, mida seejärel jälgitakse mikroskoobi all, kui HaCaT-rakud aja jooksul rändavad ja sulgevad tekkinud lünga.
„HaCaT-keratinotsüütide rakukasv haavade paranemise katsete jaoks”: See video näitab HaCaT-keratinotsüütide rakukasvu protsessi haavade paranemise katsete jaoks. HaCaT-keratinotsüüdid on haavade paranemise uuringutes laialt kasutatav rakuliin.
„HaCaT-rakkude diferentseerumine”: See video tutvustab HaCaT-rakkude diferentseerumiseks vajalikke samme. HaCaT-rakud võivad diferentseeruda erinevat tüüpi naharakkudeks. Video näitab HaCaT-rakkude muutusi diferentseerumise käigus, kujutades visuaalselt erinevaid diferentseerumise markereid ja omadusi. Diferentseerumisprotsess on normaalse naha toimimise seisukohalt kriitilise tähtsusega ning video toob esile erinevad etapid, mida HaCaT-rakud diferentseerumise käigus läbivad.
Viited
- Angel P ja Karin M: Jun, Fos ja AP-1 kompleksi roll rakkude proliferatsioonis ja transformatsioonis. Biochim Biophys Acta 1072:129-157, 1991 Argyris TS: Epidermise hüperplastilise kasvu regulatsioon. Crit Rev Toxicol 9:151-200, 1981
- Baden HP, Kubilus J, Kvedar JC, Steinberg ML, Wolman SR: Spontaanselt tekkinud pikaealise inimkeratinotsüütide liini (NM-1) isoleerimine ja iseloomustamine. In Vitro Cell Dev Biol 23(3):205-13, 1987
- Lehmann TA, Modali R, Boukamp P, Stanek J, Bennett WP, Welsh JA, Metcalf RA, Stampfer MR, Fusenig NE, Rogan EM, Harriss CC: p53 mutatsioonid inimese surematute epiteelirakkude liinides. Carcinogenesis 14:833-839, 1993
- Ziegler A-M, Leffell DJ, Kunala S, Sharma HW, Gailani M, Simon JA, Halperin AJ, Baden HP, Shapiro PE, Bale AE, Brash DE: Päikesevalguse põhjustatud mutatsioonide levikukohad p53-geenis mitte-melanoomse nahavähi puhul. Proc Natl Acad Sci USA 90:4216-4220, 1993
- Fusenig NE, Boukamp P. Inimese naha keratinotsüütide immortaliseerumise, pahaloomulise transformatsiooni ja kasvaja progresseerumise mitmed etapid ja geneetilised muutused. Mol Carcinog. 1998;23(3):144-158.
- Harle-Bachor C, Boukamp P: Telomeraasi aktiivsus inimese naha epidermise regeneratiivses basaalkihis ning surematutes ja kartsinoomist pärinevates nahakeratinotsüütides. Proc Natl Acad Sci USA 93:6476-81, 1996
- Colombo I, Sangiovanni E, Maggio R jt. HaCaT-rakud kui usaldusväärne in vitro diferentseerumismudel inimese keratinotsüütide põletikulise/parandusreaktsiooni analüüsimiseks. Mediators Inflamm. 2017;2017:7435621.
- Boukamp, P. jt. Normaalne keratinisatsioon spontaanselt surematuks muudetud aneuploidses inimese keratinotsüütide rakuliinis. J. Cell Biol. 106, 1996, 761–771.
- Gibbs, Graham: Kvalitatiivsete andmete analüüs. Sage kvalitatiivse uurimise komplekt. London: Sage 978-0-7619-4980-0.
- Hedrick TE, Bickman L, Rog DJ. 1993. Rakendusuuringute kavandamine: praktiline juhend. Sage: London
- Boukamp P. Petrussevska R. T. Breitkreutz D. Hornung J. Markham A. Fusenig N. E. Normaalne keratinisatsioon spontaanselt surematuks muudetud aneuploidses inimese keratinotsüütide rakuliinis. Cell Biol. (1988); 106:761–771.