HEK293T rakud: Potentsiaali avamine transfektsiooniuuringutes
HEK293T rakud on inimese embrüonaalsed neerurakud, mida kasutatakse laialdaselt tööstuslikus biotehnoloogias, toksikoloogias ja vähiuuringutes. Neid immortaliseeritud rakke kasutatakse ka mitmesuguste terapeutiliste valkude ja viiruste tootmiseks.
HEK293T rakkude üldised omadused ja päritolu
Selles artikli osas käsitletakse HEK293T rakuliini päritolu ja üldist teavet selle kohta.
- HEK293T rakuliin pärineb inimese embrüonaalsetest neerurakkudest, mida on kasvatatud laboris. Teadlased töötasid need rakud välja 1970. aastate alguses, transfekteerides embrüonaalseid neerurakke lõigatud adenoviiruse 5. tüüpi DNA-fragmentidega. Teadlased lõid HEK293T rakuliini, viies simian virus 40 (SV40) suure T-antigeeni HEK293 rakkude genoomi. See modifikatsioon võimaldas teadlastel hõlpsasti transfekteerida 293 rakke ja muutis need sobivaks valkude tootmiseks ja geeniekspressiooni uuringuteks [1].
- HEK293T rakkudel on epiteelilaadne morfoloogia. Nad on pikliku ja lapiku kujuga, millel on kindel rakupiir.
- HEK293T rakkude suurus on 11-15 µm läbimõõduga.
- SV40 large-t antigeeniga HEK293T rakkudel on keeruline karüotüüp. Need rakud on hüpotriploidsed, sisaldades 3 korda vähem kromosoomi kui haploidne sugurakk, ja nende modaalne kromosoomide arv on 64.
Mis on HEK293T ja HEK293 erinevus?
Nii HEK293 kui ka HEK293T rakuliinid on inimpäritolu. HEK293T on HEK293 rakuliini populaarne tuletis. Teadlased arendasid need rakud välja algsetest inimese embrüonaalsetest 293 rakkudest, transfekteerides neid SV40 suure T antigeeniga, samas kui nad lõid immortaliseeritud HEK293 rakud, transformeerides ja kultiveerides inimese embrüonaalseid neerurakke lõigatud inimese adenoviiruse 5 DNA-fragmentidega.
Rakutehnoloogiad ja HEK293T rakkude biomeditsiinilised rakendused
Rakkude kasvatamine ja pangandus HEK293T uuringutes
HEK293T rakke, mis on saadud inimese embrüonaalsetest 293 neerurakkudest, kasutatakse rakukultuuris laialdaselt nende tugeva kasvu ja lihtsa transfektsiooni tõttu. Nende rakkudega töötamiseks peavad teadlased seadma esikohale rakupanganduse, mis hõlmab rakkude säilitamist pikemaajaliseks uurimis- ja terapeutiliseks kasutamiseks. Nad peavad kasutama rakupanganduse astmelist lähenemist, et säilitada rakkude omadused ja tagada rakkude pikaajaline elujõulisus. Rakupankade loomine nõuab heade tootmistavade eeskirjade järgimist, et tagada rakkude elujõulisus ja terviklikkus terapeutilisteks rakendusteks.
Head tootmistavad on olulised HEK293T rakupankade tootmisel, mis on nii teadusuuringute kui ka terapeutiliste rakenduste jaoks hädavajalikud. Põhirakupank on võrdluspunktiks kõigile järgnevatele rakutoodetele. Nende rakkude valmistamisel terapeutilisteks rakendusteks, näiteks geeniteraapia jaoks lentiviiruste tootmiseks, järgitakse rangeid regulatiivseid standardeid, et tagada lõpptoodete ohutus ja tõhusus.
Protokollid ja analüüsid, milles kasutatakse HEK293T-d
Tsütotehnoloogias on HEK293T rakkude omaduste hindamiseks ette nähtud konkreetsed protokollid ja katsed. Need hõlmavad geeniteraapia vektorite tõhususe hindamist ja raku suhtlemist rakuvälise maatriksiga tassis või suspensioonikultuuris. HEK293T-rakkude terviklikkuse säilitamiseks valivad teadlased transfektsiooniks vajalikud reaktiivid täpselt ja läbivad tooraine suhtes ranged kvaliteedikontrolli testid.
HEK293T rakuliini teadusuuringute rakendused
- Vaktsiini väljatöötamine: HEK293T rakuliini on kasutatud viiruste uurimiseks ja viirusvektoripõhiste vaktsiinide tootmiseks, et võidelda mitmesuguste viirusnakkuste vastu. Ühes uuringus kasutati seda embrüonaalset neerurakuliini, et uurida COVID-19 viiruse rakku sisenemise struktuurilisi ja funktsionaalseid aluseid inimese angiotensiini konverteeriva ensüümi 2 (ACE2) kaudu [3]. Lisaks kasutati hiljutises uuringus HEK93T rakke SARS-CoV-2 spike-pseudotüüpi lentiviiruse osakeste genereerimiseks [4].
- Toksikoloogilised uuringud: Seda inimese embrüonaalset neerurakuliini kasutatakse laialdaselt ravimite toksilisuse ja tõhususe testimiseks. 2022. aastal tehtud uuringutes kasutati HEK293T-d kui normaalset inimrakuliini, et valideerida Caladium lindenii ekstraktide tsütotoksilist potentsiaali maksavähi rakuliini HepG2 suhtes [5].
- Geeniekspressiooni uuringud: SV40 suure T antigeeni HEK293T rakuliin on transfektsioonile väga hästi alluv, seega sobib see geeniekspressiooni uuringuteks. Ühes uuringus kasutati HEK293T rakke, et uurida pika mittekodeeriva RNA SNHG16 rolli trofoblastide funktsioonide reguleerimisel. Uuring näitas, et LncRNA SNHG16 suhtleb nende mõjude vahendamiseks miR-218-5p/LASP1 teljega [6].
Rakuteraapia uuendused, kasutades HEK293T rakke
Rakuteraapia edusammud HEK293T-rakkudega
HEK293T rakud annavad olulise panuse rakuteraapia maastikul, eriti geeniteraapia viirusvektorite loomisel. Need rakud on olulised tootmisprotsessides, mis järgivad hea tootmistava eeskirju, kuna need tagavad kvaliteetsete geeniteraapiatoodete tootmise. Tootmistöötajate koolitus keskendub ka HEK293T rakkude ainulaadsete omaduste käsitlemisele ja nendest rakkudest saadud ravimite kõrge standardi säilitamisele.
HEK293T rakud kliinilistes uuringutes ja geeniteraapias
HEK293T rakuliinil on keskne roll geeniteraapiatoodete väljatöötamisel ja see on lahutamatu osa kliinilistes uuringutes, mille eesmärk on tuua turule uusi rakuteraapiaid. See hõlmab rakuliini suure transfektiivsuse kasutamist geenide edastamiseks, kasutades vektoreid, nagu lentiviiruse pakendivektorid, kus integraasi D64V mutatsioon on olnud märkimisväärne edasiminek ohutuse suurendamiseks.
Innovatiivsed tehnikad HEK293T rakukultuuris
HEK293T rakkude mitmekülgsus toetab uuenduslikke tehnikaid nii kahemõõtmelistes kui ka keerulisemates rakukultuurides. See kohanemisvõime on võtmetähtsusega rakutoodete uurimisel erinevat tüüpi biomeditsiiniuuringute jaoks, sealhulgas vähiuuringute jaoks, kus neid rakke kasutatakse kasvajaliste protsesside ja ravimite testimise uurimiseks. Lisaks sellele on HEK293T liin oluline lentiviiruse osakeste tootmisel, mis on kriitilise tähtsusega nii teadusuuringute kui ka ravivektorite tootmisprotsesside jaoks.
HEK293 rakkude ostmine teie teadusuuringuteks
Parandage oma teadusuuringuid meie HEK293 rakkudega, mis on tuntud oma kohanemisvõime poolest geeniekspressiooni uuringutes ja vaktsiinide tootmisel. Meie pakkumised hõlmavad mitmekülgseid derivaate, nagu HEK293T, HEK293 suspensiooniga adapteeritud liin, HEK293T/17, AAV-293 ja 2V6.11. Tutvuge meie ulatusliku valikuga, et toetada ja edendada oma eksperimentaalset tööd.
Teave rakuliini HEK293T kasvatamise kohta
HEK293T rakke kasvatatakse teaduslaboratooriumides laialdaselt. Enne HEK293T rakukultuuri arendamist peate teadma: Milline on HEK293T rakkude kahekordistumisaeg? Milline on HEK293T-keskkond? Milline on HEK293T külvikutihedus?
HEK293T rakkude kasvatamise põhipunktid
|
Kordistumisaeg: |
HEK293T rakkude kahekordistumisaeg on 30 tundi. |
|
Adherentselt või suspensioonis: |
HEK293T on adherentne rakuliin. |
|
Külvikutihedus: |
HEK293T rakke külvatakse tihedusega 1 x104 rakku/cm2. Sellise külvitiheduse korral moodustavad rakud umbes 4 päevaga konfluentse monokihi. Külvamiseks eraldatakse adherentsed rakud akutaasi dissotsiatsioonilahuse abil. Eemaldatud rakud tsentrifuugitakse ja seejärel resuspendeeritakse ettevaatlikult, kasutades kasvukeskkonda. Seejärel jaotatakse rakud kasvatamiseks uutesse kolvidesse. |
|
Kasvukeskkond: |
HEK293T rakke kasvatatakse EMEMis (Eagle's minimal essential medium), mis sisaldab 1,0 g/L L-glükoosi, 2,2 g/L NaHCO3, 2,0 mM L-glutamiini ja 10% veiste loote seerumit. Keskkonda tuleb vahetada kaks korda nädalas. |
|
Kasvutingimused: |
HEK293T rakukultuure hoitakse 37 °C juures niisutatud inkubaatoris, kus on 5% CO2-lisand. |
|
Säilitamine: |
Inimese embrüonaalse neeru HEK293T rakke hoitakse kauem vedela lämmastiku aurufaasis või ata temperatuuril alla -150°C. |
|
Külmutamisprotsess ja keskkond: |
HEK293 rakke võib külmutada CM-1 või CM-ACF külmutuskeskkonnas. HEK293T rakkude elujõulisuse kaitsmiseks soovitatakse aeglast külmutamist, mis võimaldab temperatuuri järkjärgulist langust 1 °C võrra. |
|
Sulatamisprotsess: |
Külmutatud rakkude viaali segatakse kiiresti veevannis (37 °C), kuni alles jääb väike jääklomp. Rakud resuspenseeritakse meediumis ja tsentrifuugitakse, et eemaldada külmutuskeskkonna komponendid. Seejärel kasvatatakse tagasi saadud rakke uutes kasvukeskkonda sisaldavates kolbides. |
|
Bioturvalisuse tase: |
HEK293T rakukultuuride käitlemiseks ja hooldamiseks on vajalik 1. bioloogilise ohutuse taseme laboratoorium. |
HEK293T rakuliin: Eelised ja piirangud
Inimese embrüonaalsete neerude 293T rakkudega on seotud ainulaadne eeliste ja piirangute kombinatsioon. Siinkohal vaatleme selle rakuliini mõningaid peamisi eeliseid ja puudusi.
HEK293T rakkude eelised ja puudused
HEK293T rakkude märkimisväärsete eeliste hulka kuulub nende kõrge transfektiivsus, kus rakuliinil on märkimisväärne tõhusus võõra DNA vastuvõtmisel ja rohke valkude tootmisel. Tänu sellele omadusele on nad laialdaselt eelistatud nii transientse kui ka stabiilse transfektsiooni uuringuteks. Lisaks on HEK293T rakukultuurid tuntud oma lihtsa hoolduse poolest, mis muudab need tänu nende vastupidavusele ja lihtsatele käitlemisnõuetele suurepäraseks valikuks mitmesuguste laboratoorsete katsete jaoks.
Siiski on HEK293T rakukultuuridega seotud piirangud. Üheks peamiseks probleemiks on mikroobse saastumise oht, mis võib oluliselt mõjutada rakkude morfoloogiat, geeniekspressiooni ja muid kriitilisi omadusi, mis võib viia ebatäpsete katsetulemusteni. Lisaks sellele, kuigi HEK293T rakud sobivad pikaajalisteks katsetusteks, võivad pikad kasvatusperioodid kahjustada rakkude tervist. See võib mõjutada nende transfektsiooni tõhusust ja kasvukiirust, mistõttu on rakkude terviklikkuse säilitamiseks üldiselt soovitatav piirata nende läbimise arvu 20-ni või alla selle.
Korduma kippuvad küsimused HEK293T rakukultuuri ja rakenduste kohta
HEK293T rakud: HEKTAN HEKTAN: teaduspublikatsioonid
Selles jaotises on mainitud mõned paljulubavad uurimispublikatsioonid, milles kasutatakse HEK293T rakke.
See publikatsioon avaldatakse BioRxivis 2022. aastal. Selles uuringus kasutati HEK293T rakke COVID-19 viiruse mRNA-vaktsiinide väljatöötamiseks, mis kodeerivad spike'i geeni N-terminaalset ja RBD (retseptorit siduv domeen) domeeni.
Tsirkulaarne HER2 RNA-positiivne kolmiknegatiivne rinnavähk on tundlik pertuzumabi suhtes
See uuring on avaldatud ajakirjas Molecular Cancer 2020. Uuringus pakuti välja, et ringikujuline HER2 RNA ekspressioon kolmiknegatiivse rinnavähi rakkudes muudab selle tundlikuks Pertuzumabi ravimravi suhtes. Teadlased kasutasid selles uuringus HEK293 rakke lentiviiruse tootmiseks ja ringikujulise HER2 geeni transfektsiooniks.
IFITM3 viirusevastane roll prototüübi vahtuvirusinfektsioonis
See töö avaldati ajakirjas Virology Journal 2022. Selles uuringus kasutati HEK293T rakke, et uurida IFITM3 (interferoonist indutseeritud transmembraanvalk 3) viirusevastast mõju prototüüpse foamiviiruse (PFV) infektsioonis.
Selles ajakirjas Nature Scientific Reports (2017) avaldatud uurimuses kasutati HEK293T rakke ja uuriti, et miRNA-21 vahendab metformiini poolt indutseeritud antiangiogeenset toimet, reguleerides PI3K/AKT signaalirada ning SMAD7 ja PTEN geenide ekspressiooni.
MikroRNA-608 pärsib põievähi proliferatsiooni AKT/FOXO3a signaalitee kaudu
See uuring avaldati ajakirjas Molecular Cancer 2017. aastal. Selles uuringus kasutati HEK293 rakke, et uurida miRNA-608 antiproliferatiivset potentsiaali põievähi vastu.
HEK293T rakuliini ressursid: Protokollid, videod ja muud
Järgnevalt on esitatud mõned ressursid HEK293T rakkude kohta:
- HEK293T rakkude transfekteerimine.
- HEK rakkude transfektsioon: See video näitab inimese embrüonaalsete neerude rakuliini HEK293 üldist transfektsiooniprotokolli.
- Rakkude passageerimine: See video selgitab adherentsete rakkude jagamise või subkultiveerimise protseduuri.
Rakukultuuri protokollid
HEK293T rakkude kasvatamise protokollid on loetletud siin.
- HEK293T rakkude jagamine: Sellel saidil on üksikasjalik samm-sammuline juhend HEK293 rakkude subkultuurimiseks.
- Inimese embrüonaalsete neerurakkude kultiveerimine: See link annab teile HEK293T rakkude kasvatamise protokolli.
Viited
- Tan, E., et al., HEK293 rakuliin kui platvorm rekombinantsete valkude ja viirusvektorite tootmiseks. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology, 2021, 9.
- Kim, M.J., et al., AMPKα1 reguleerib kopsu- ja rinnavähi progresseerumist, reguleerides TLR4-vahendatud TRAF6-BECN1-signaaliteljestikku. Cancers (Basel), 2020, 12(11).
- Wang, Q., et al., SARS-CoV-2 sisenemise struktuuriline ja funktsionaalne alus inimese ACE2 abil. Cell, 2020. 181(4): p. 894-904.
- Gale, E.C., et al., Hydrogeelil põhinev retseptorit siduvate domeenide allüksuse aeglase vabanemise vaktsiin kutsub esile neutraliseerivaid antikehade vastuseid SARS-CoV-2 vastu. bioRxiv, 2021.
- Kalsoom, A., et al., Caladium lindenii ekstraktide tsütotoksilise potentsiaali in vitro hindamine inimese hepatokartsinoomi HepG2 ja normaalsete HEK293T rakuliinide suhtes. Biomed Res Int, 2022, lk. 1279961.
- Yu, Z., et al., LncRNA SNHG16 reguleerib trofoblastide funktsioone miR-218-5p/LASP1 telje abil. J Mol Histol, 2021. 52(5): p. 1021-1033.