Põhjalik juhend rakkude külmutamise kohta: Elujõulisuse ja steriilsuse tagamine
Rakkude külmutamine on kriitiline protsess rakukultuuride haldamisel, tagades väärtuslike rakuliinide pikaajalise säilitamise ja säilitamise. Olenemata sellest, kas töötatakse inimese või loomade rakkudega, on täpse protokolli järgimine ja rangete aseptiliste tehnikate säilitamine eduka krüokonserveerimise saavutamiseks esmatähtis.
Selles juhendis on üksikasjalikud juhised vajalike materjalide, reaktiivide ja samm-sammult toimuvate protseduuride kohta, et tõhusalt külmutada rakke, säilitades samal ajal nende elujõulisuse ja steriilsuse. Neid juhiseid järgides saavad teadlased rakukultuure kindlalt säilitada ja hiljem taaselustada, säilitades rakkude elujõulisuse minimaalse kaotusega, säilitades oma katsetulemuste terviklikkuse ja usaldusväärsuse.
Alustuseks on oluline luua steriilne töökeskkond. Nõuetekohased aseptilised tehnikad mängivad olulist rolli saastumise vältimisel ja kultuuride steriilsuse tagamisel.
Aseptiline tehnika
Kultuuride steriilsuse tagamiseks tuleb kogu protsessi jooksul järgida aseptilisi võtteid.
Põhjalik lahtri külmutamise protsess
See vooskeem annab üksikasjaliku visuaalse juhendi rakkude nõuetekohase külmutamise oluliste etappide kohta. Järgige neid protseduure, et tagada rakkude kõrge elujõulisus ja terviklikkus krüokonserveerimise käigus.
Külmutuskeskkonna ettevalmistamine
Valmistage krüoprotektiivne külmutussöötme vastavalt rakutüübile:
- FBS-i sisaldav keskkond kultuuride jaoks: 90% FBS + 10% DMSO või 70% kasvukeskkonda, 20% FBS ja 10% DMSO
- Glütserooli vajavad rakud: 90% FBS + 10% glütserool
Kaaluge meie eelretsepteeritud külmutussöötme soetamist:
- Freeze Medium CM-1: Protokollideks, mis nõuavad Fetal Bovine Serum (FBS) sisaldavat keskkonda
- Külmutussöötme CM-ACF - seerumivaba: FBS-vaba alternatiivina
Märgistamine ja dokumenteerimine
Märgistage krüoviaalid järgmiste andmetega:
- Kuupäev
- Teadlase nimi
- Raku number
- Passio number
- Raku tüüp
- Mis tahes lisateave (nt geneetilised muudatused)
Raku ettevalmistus
Adherentsete rakkude puhul:
- Jälgida rakke, kuni need saavutavad 85-95% konfluentsuse
- Aspireerige vana kasvukeskkond
- Loputage rakumonokihti kaltsiumi- ja magneesiumivaba PBSiga
- Lahutage rakud Accutase, trüpsiin või trüpsiin-EDTA abil ja neutraliseerige vajadusel kultuurkeskkonnaga
- Viige rakususpensioon 50 ml Falconi torusse
Suspensionirakkude puhul:
- Kontrollige rakkude tihedust ja tervist mikroskoobi all
- Viige rakususpensioon otse 50 ml Falconi torusse
Rakkude loendamine ja tsentrifuugimine
- Loendage rakke hemotsütomeetri või automaatse rakkude loenduri abil
- Rakkude tsentrifuugimine 300 g juures 3-5 minutit toatemperatuuril, et rakud pelletada
- Aspireerige supernatant ettevaatlikult, vältides rakupelleti häirimist
- Enne kasutamist soojendage ettevalmistatud külmutuskeskkonda 37 °C-ni
Krüokonserveerimine
- Resuspenseerige rakupellet külmutuskeskkonnas tiheduseni 2,0 miljonit rakku/ml adherentsete ja 5 miljonit rakku/ml suspensioonirakkude puhul või soovitud kontsentratsioonini
- Eraldage 1,0 ml (või vastavalt vajadusele rohkem) rakususpensiooni märgistatud krüoklaasidesse
- Kasutage enne rakkude üleviimist pikaajalisele säilitamisele aeglast külmutamist
| ? Meetod | ? Sammud |
|---|---|
|
❄️ Käsitsi külmutamine |
1️⃣ Asetage rakud külmutuskeskkonda 4 °C sügavkülmikusse 40 minutiks. 2️⃣ Viige 24 tunniks -80°C sügavkülmikusse. 3️⃣ Säilitage rakke pikaajalise säilitamise eesmärgil vedelas lämmastikus |
|
? Mr. Frosty kasutamine |
1️⃣ Valmistage rakud krüoviaalidesse koos külmutussöötmega. 2️⃣ Asetage krüoviaalid Mr. Frosty konteinerisse. 3️⃣ Säilitage 24 tundi temperatuuril -80 °C enne vedela lämmastiku sisse viimist |
|
? Reguleeritava kiirusega sügavkülmik |
1️⃣ Programmeerige seade nii, et temperatuur langeb järk-järgult. 2️⃣ Asetage ettevalmistatud rakud sügavkülmikusse. 3️⃣ Pärast külmutamistsüklit viige rakud üle vedela lämmastikuga |
- Säilitage krüoviaalid temperatuuril alla -130 °C või pikaajalise säilitamise eesmärgil vedelas lämmastikus.
Materjalid ja reaktiivid
- 1-2 mL krüoviaalid
- CoolCell® külmutusseade või kontrollitud kiirusega sügavkülmik
- Krüoprotektiivne külmutuskeskkond (nt DIY krüoprotektiivne keskkond, CM-1, CM-ACF või spetsiaalne keskkond)
- Veiste loote seerum (FBS) või konditsioneeritud keskkond
- DMSO või glütserool
- Kaltsiumi- ja magneesiumivaba PBS
- Accutase, trüpsiin või trüpsiin-EDTA (adherentsete rakkude puhul)
- 15 ml või 50 ml Falconi torud
- Hemotsütomeeter või automaatne rakkude loendur
- Tsentrifuugimine