Avaldatud: 2023 | Viimati läbi vaadatud: mai 2026
Põhjalik juhend rakkude külmutamiseks: eluvõimelisuse ja steriilsuse tagamine
Rakkude külmutamine on rakukultuuri haldamisel kriitiline protsess, mis tagab väärtuslike rakuliinide pikaajalise säilitamise ja hoidmise. Olgu tegemist inim- või loomarakkudega, on täpsete protokollide järgimine ja rangete aseptiliste meetodite kasutamine ülimalt oluline edukaks krüokonserveerimiseks.
Käesolev juhend sisaldab üksikasjalikke juhiseid vajalike materjalide, reagentide ja samm-sammuliste protseduuride kohta, et rakke tõhusalt külmutada, säilitades samal ajal nende eluvõime ja steriilsuse. Nende juhiste järgimisel saavad teadlased rakukultuure kindlalt säilitada ja hiljem taaselustada minimaalsete rakkude eluvõime kaotustega, säilitades oma eksperimentide tulemuste terviklikkuse ja usaldusväärsuse.
Esmalt on oluline luua steriilne töökeskkond. Nõuetekohased aseptilised meetodid mängivad olulist rolli saastumise vältimisel ja kultuuride steriilsuse tagamisel.
Aseptiline tehnika
Järgige kogu protsessi vältel aseptilisi meetodeid, et tagada kultuuride steriilsus.
Rakukülmutamise terviklik protsess
See vooskeem pakub üksikasjalikku visuaalset juhendit rakkude nõuetekohase külmutamise oluliste etappide kohta. Järgige neid protseduure, et tagada rakkude kõrge eluvõime ja terviklikkus krüokonserveerimise protsessi ajal.
Külmutuskeskkonda ettevalmistamine
Valmistage krüoprotektiivne külmutuskeskkond vastavalt rakutüübile:
- FBS-d sisaldavad kultuurid: 90% FBS + 10% DMSO või 70% kasvukeskkond, 20% FBS ja 10% DMSO
- Glütserooli vajavad rakud: 90% FBS + 10% glütserool
Kaaluge meie valmis külmutuskeskkonda:
- Külmutuskeskkond CM-1: protokollidele, mis nõuavad loote veise seerumit (FBS) sisaldavat keskkonda
- Külmutuskeskkond CM-ACF – seerumivaba: FBS-vaba alternatiiv
Märgistamine ja dokumenteerimine
Märgistage krüovialid järgmiste andmetega:
- Kuupäev
- Teadlase nimi
- Rakunumber
- Passaaži number
- Rakutüüp
- Mis tahes lisateave (nt geneetilised muudatused)
Rakkude ettevalmistamine
Adherentrakkude puhul:
- Jälgige rakke, kuni need saavutavad 85–95% konfluentsuse
- Imege vana kasvukeskkond ära
- Loputage rakkude monokihiga kaltsiumi- ja magneesiumivaba PBS-ga
- Eraldage rakud Accutase'i, trüpsiini või trüpsiini-EDTA abil ja neutraliseerige vajadusel kasvukeskkonnaga
- Kandke rakususpensioon üle 50 ml Falconi torusse
Suspensioonrakkude puhul:
- Kontrollige rakkude tihedust ja tervist mikroskoobi all
- Kandke rakususpensioon otse 50 ml Falconi torusse
Rakkude loendamine ja tsentrifuugimine
- Loendage rakud hemotsütoomeetri või automaatse rakuloenduri abil
- Tsentrifuugige 300 g juures 3–5 minutit toatemperatuuril, et rakud sadestuksid
- Ime supernatant ettevaatlikult ära, vältides rakupelleti segamist
- Soojendage valmistatud külmutuskeskkond enne kasutamist 37 °C-ni
Krüokonserveerimine
- Resuspendeerige rakupellet külmutuskeskkonnas tiheduseni 2,0 miljonit rakku/ml adhesiivsete rakkude puhul ja 5 miljonit rakku/ml suspensioonrakkude puhul või soovitud kontsentratsioonini
- Võtke 1,0 ml (või vajaduse korral rohkem) rakususpensiooni ja jaotage see märgistatud krüovialidesse
- Kasutage aeglase külmutamise meetodit enne rakkude üleviimist pikaajalisesse säilitamisse
- ? Meetod
- ? Sammud
-
❄️
Käsitsi külmutamine -
1️⃣ Asetage rakud külmutuskeskkonnas 4 °C külmikusse 40 minutiks.
2️⃣ Viige üle -80 °C külmikusse 24 tunniks.
3️⃣ Säilitage rakke vedelas lämmastikus pikaajaliseks säilitamiseks. -
?
Mr. Frosty kasutamine -
1️⃣ Valmistage rakud ette külmutuskeskkonnaga kriovialides.
2️⃣ Asetage kriovialid Mr. Frosty konteinerisse.
3️⃣ Säilitage -80 °C juures 24 tundi enne vedelasse lämmastikku viimist. -
?
Reguleeritava kiirusega külmik -
1️⃣ Programmeerige seade temperatuuri järkjärguliseks alandamiseks.
2️⃣ Asetage ettevalmistatud rakud külmutusseadmesse.
3️⃣ Pärast külmutustsüklit viige rakud üle vedelasse lämmastikku.
- Hoidke krüoviale pikaajaliseks säilitamiseks temperatuuril alla -130 °C või vedelas lämmastikus.
Materjalid ja reagendid
- 1–2 ml krüovialid
- CoolCell® külmutusseade või kontrollitud kiirusega külmutuskapp
- Krüoprotektiivne külmutuskeskkond (nt ise valmistatud krüoprotektiivne keskkond, CM-1, CM-ACF või spetsiaalne keskkond)
- Loote veise seerum (FBS) või konditsioneeritud keskkond
- DMSO või glütserool
- Kaltsiumi- ja magneesiumivaba PBS
- Accutase, trüpsiin või trüpsiin-EDTA (adherentseid rakke jaoks)
- 15 ml või 50 ml Falconi torud
- Hemocytometer või automaatne rakulugemisseade
- Tsentrifuug