Células primarias humanas

¿Qué son las células primarias humanas?

Las células primarias son la representación más pura de sus respectivos tejidos. Se aíslan del tejido y se procesan para que puedan establecerse en un entorno de cultivo con condiciones ideales. Imitan mejor el estado in vivo y muestran una fisiología normal porque se derivan del tejido en lugar de modificarse. Por ello, pueden servir como modelos útiles para la investigación en farmacología celular, toxicología y fisiología (incluidos los estudios del metabolismo, el envejecimiento y la transducción de señales). Tenga en cuenta que las células primarias son más difíciles de cultivar y mantener que una línea celular continua porque tienen una vida útil más corta y dejarán de dividirse (o senecer) después de un cierto número de divisiones celulares. Los estudios de las vías de señalización celular se complican por la variabilidad inherente a las células primarias adquiridas de donantes y mediante prácticas de subcultivo. Antes de iniciar los estudios de señalización, los investigadores suelen realizar un cribado para determinar si las células responden o no a los estímulos utilizados habitualmente. Para evitar la pérdida de tiempo y dinero, las células primarias pueden estimularse para activar las principales vías de señalización antes de realizar el cribado.

¿Por qué utilizar células primarias humanas?

Las líneas celulares inmortalizadas se utilizan habitualmente como ensayo celular. Aunque los científicos han reconocido que los cambios biológicos debidos a las líneas celulares pueden ser perjudiciales a la hora de estudiar su significado fisiológico. El uso de células primarias humanas mejora el valor fisiológico de los datos obtenidos mediante cultivos celulares, y cada vez se las considera más importantes para estudiar los procesos biológicos, el progreso de las enfermedades y el desarrollo de fármacos.

Las células primarias humanas se utilizan ampliamente en estudios in vitro de la comunicación intercelular e intracelular, la biología del desarrollo y los mecanismos subyacentes al cáncer, la enfermedad de Parkinson y la diabetes, entre otras muchas áreas de investigación biológica preclínica y de investigación. Los investigadores llevan mucho tiempo utilizando líneas celulares inmortalizadas para estudiar la función de los tejidos; sin embargo, las líneas celulares con mutaciones y anomalías cromosómicas evidentes pueden no ser buenos sustitutos de las células normales y del desarrollo de enfermedades en sus primeras fases. Ahora se puede conseguir un modelo más preciso de un tipo celular de tejido específico utilizando células primarias humanas aisladas de ese tejido y mantenidas en medios y suplementos de cultivo celular primario.

¿Qué es el cultivo celular primario?

En lugar de utilizar líneas celulares inmortalizadas, el cultivo celular primario consiste en cultivar células directamente a partir de un organismo multicelular fuera del cuerpo. En algunos países, como el Reino Unido, se reconoce legalmente que los cultivos celulares primarios son más representativos de los tejidos in vivo que las líneas celulares. No obstante, las células primarias necesitan el sustrato y los nutrientes adecuados para crecer y, tras un cierto número de divisiones, desarrollan un fenotipo senescente que hace que dejen de dividirse permanentemente. Estos dos factores motivan la creación de líneas celulares. Tanto las células primarias inmortalizadas de forma natural (por ejemplo, las células HeLa) como las inmortalizadas artificialmente (por ejemplo, las células HEK) pueden cultivarse indefinidamente en cultivos celulares.

Células primarias humanas por tipos de tejido

Las células epiteliales, los fibroblastos, los queratinocitos, los melanocitos, las células endoteliales, las células musculares, las células inmunitarias y las células madre, como las células madre mesenquimales, se encuentran entre las células primarias humanas más utilizadas en el estudio científico. Para empezar, los cultivos son heterogéneos (representan una mezcla de tipos celulares presentes en el tejido) y sólo pueden mantenerse vivos in vitro durante un tiempo determinado. La transformación es un proceso in vitro que permite manipular células primarias humanas para realizar subcultivos ilimitados. La transformación puede producirse de forma natural o inducida por sustancias químicas o virus. Tras sufrir una transformación genética, un cultivo primario puede dividirse indefinidamente en una línea celular secundaria inmortalizada si se le proporcionan suficientes nutrientes y espacio.

Células endoteliales

El tratamiento del cáncer, la cicatrización de heridas, la investigación de la señalización celular, el cribado de alto rendimiento y alto contenido y el cribado toxicológico son sólo algunas de las áreas que pueden beneficiarse del uso de células endoteliales primarias como herramienta de investigación.

Queratinocitos

Los queratinocitos, derivados de la epidermis de la piel humana adulta o del prepucio neonatal, desempeñan un papel crucial en el estudio de enfermedades cutáneas como la psoriasis y el cáncer.

Células epiteliales

Desde los estudios sobre el cáncer hasta las investigaciones toxicológicas, las células epiteliales primarias han demostrado ser recursos inestimables para modelar las defensas naturales del organismo.

Fibroblastos

La inducción de células madre pluripotentes (iPS) y el estudio de la cicatrización de heridas son sólo algunos de los muchos usos de los fibroblastos primarios.

Células inmunitarias

Las células mononucleares de sangre periférica, abreviadas PBMC, son células mononucleares de la sangre con un núcleo celular redondo. Incluyen principalmente linfocitos y monocitos, que asumen funciones importantes en el curso de una respuesta inmunitaria. Las células mononucleares de la sangre periférica se utilizan a menudo para diagnosticar infecciones o detectar una posible protección vacunal. El conocimiento de la respuesta inmunitaria celular mediada por las células T suele ser crucial.

Melanocitos

Los melanocitos, las células especializadas de la piel que producen el pigmento melanina, son útiles como modelos para la investigación de temas como la cicatrización de heridas, la toxicidad, el melanoma, la respuesta dérmica a la radiación ultravioleta (UV), las enfermedades cutáneas y los cosméticos.

Células madre

Las células madre tienen el potencial de diferenciarse en una amplia variedad de tipos celulares. Gracias a su capacidad de diferenciación, ofrecen nuevas oportunidades para modelar tejidos humanos y enfermedades.

Células madre mesenquimales

Las células madre mesenquimales, también conocidas como CMM, pueden obtenerse de distintas fuentes humanas como la médula ósea, la grasa (tejido adiposo), el tejido del cordón umbilical (gelatina de Wharton) y el líquido amniótico (el líquido que rodea al feto) y pueden expandirse in vitro. Estas células madre estromales adultas tienen la capacidad de convertirse en una amplia variedad de tipos celulares. Algunos de estos tipos celulares incluyen células óseas, células cartilaginosas, células musculares, células neurales, células de la piel y células de la córnea.

Células musculares lisas

En los órganos huecos, las células musculares lisas (CML) primarias revisten el interior y median en la contractilidad. Además del cáncer y otras enfermedades, las SMC pueden utilizarse para modelar la fibrosis hipertensiva.

Células primarias y líneas celulares

Ya sea por mutación espontánea, como en las líneas celulares de cáncer transformadas, o por alteración intencionada, como en la producción artificial de genes cancerígenos, las líneas celulares continuas han adquirido el potencial de reproducirse sin fin (inmortalizadas). Por regla general, las líneas celulares continuas son más fiables y cómodas de manejar que las células primarias. Pueden expandirse indefinidamente y proporcionan un acceso rápido a datos esenciales. El uso de líneas celulares continuas tiene ciertas limitaciones, como el hecho de que están modificadas/transformadas genéticamente, lo que podría cambiar las características fisiológicas y no coincidir con la condición in vivo, y que esto puede cambiar aún más con el tiempo con un pasaje significativo.

Avances en el cultivo de células primarias

Las células primarias tienen fama de ser difíciles de trabajar. Sin embargo, el proceso es cada vez más fácil gracias a los avances en el cultivo de células primarias, la disponibilidad de células primarias comerciales con protocolos totalmente optimizados y las nuevas técnicas de análisis que requieren menos datos.

El paso del cultivo celular bidimensional al tridimensional se considera un hito importante en este campo. La arquitectura específica del tejido, las interacciones célula-célula y la señalización mecánica/bioquímica pueden verse atenuadas en un cultivo bidimensional. Por tanto, el valor biológico de estos cultivos tiene un límite.

Por otro lado, el cultivo celular en 3D permite a las células expandirse e interactuar con un marco extracelular tridimensional. Esto permite que las células interactúen entre sí y con la matriz extracelular, lo que hace que los cultivos 3D sean más relevantes desde el punto de vista fisiológico. La precisión de este método para predecir respuestas in vivo lo ha convertido en revolucionario en campos como el descubrimiento y desarrollo de fármacos. Por ello, las tecnologías más avanzadas, como los organoides derivados de pacientes y los órganos en un chip, proporcionan modelos muy contextuales para el cribado y el desarrollo de fármacos.

La generación de células primarias es un cuello de botella en el cultivo primario. Para superarlo, suele ser necesario un mayor volumen de tejido, lo que puede resultar difícil de conseguir. Sin embargo, la mejora de la sensibilidad analítica está abriendo una vía de progreso. Por ejemplo, la necesidad de cultivar grandes cantidades de células primarias se reduce mediante el uso de tecnología unicelular, que incluye secuenciación, western blotting y citometría de masas.

Perspectivas prometedoras para el cultivo de células primarias

Las dificultades generales del cultivo de células primarias se están atenuando gracias a los avances tecnológicos. A su vez, este método está sustituyendo rápidamente a otros como patrón oro en el estudio y la práctica de la biología celular y molecular. La fabricación de vacunas, la sustitución de órganos, las terapias con células madre, la investigación del cáncer y muchos otros campos se beneficiarán enormemente de los continuos avances en el cultivo de células primarias.

Trucos y consejos para el cultivo de células primarias

Las necesidades de expansión celular

Los dos métodos más comunes para cultivar células primarias son en suspensión o en una superficie (2D). Algunas células pueden flotar libremente en el torrente sanguíneo sin adherirse nunca a una superficie (por ejemplo, las derivadas de la sangre periférica). Diferentes líneas celulares han sido diseñadas para prosperar en cultivos en suspensión, donde pueden alcanzar densidades inalcanzables en condiciones de crecimiento 2D. Las células primarias que necesitan anclaje para crecer in vitro se denominan células adherentes e incluyen las que se encuentran en los tejidos sólidos. Para mejorar las propiedades de adhesión y suministrar otras señales necesarias para el crecimiento y la diferenciación, estas células se cultivan normalmente en un recipiente plano de plástico sin recubrimiento, pero ocasionalmente en un microportador. Esta última opción puede estar recubierta de proteínas de matriz extracelular (como colágeno y laminina). El medio utilizado en el cultivo celular consiste en un medio básico al que se han añadido los factores de crecimiento y las citocinas adecuados. Un incubador celular es un tipo especial de incubador de laboratorio utilizado para cultivar y mantener células a una temperatura y mezcla de gases específicas (normalmente 37 °C, 5% CO2 para células de mamíferos). Dependiendo del tipo de célula que se cultive, las condiciones óptimas pueden ser muy diferentes. Dependiendo de los tipos de células que se cultiven, el medio de crecimiento óptimo tendrá una combinación única de factores, entre los que se incluyen el pH, la concentración de glucosa, los factores de crecimiento y la presencia de otros nutrientes.

Los antibióticos en el medio de crecimiento son cruciales durante el establecimiento del cultivo primario para evitar la contaminación del tejido huésped. Algunos regímenes antibióticos incluyen una combinación de gentamicina, penicilina, estreptomicina y anfotericina B. Sin embargo, no se aconseja el uso de antibióticos durante un periodo prolongado, ya que algunos reactivos (como la anfotericina B) pueden ser tóxicos para las células a largo plazo.

La mayoría de las células primarias entran en senescencia y dejan de dividirse tras un cierto número de duplicaciones de la población, por lo que es crucial mantenerlas vivas tras el aislamiento. La viabilidad celular a largo plazo requiere técnicas expertas de cultivo celular y condiciones de cultivo ideales (incluido el medio adecuado, la temperatura adecuada, la mezcla de gases adecuada, el pH adecuado, la concentración adecuada de factores de crecimiento, la presencia de nutrientes y la presencia de glucosa). Dado que muchos de los factores de crecimiento utilizados para complementar los medios se obtienen a partir de sangre animal (los ingredientes derivados de la sangre poseen el potencial de contaminación), se recomienda minimizar su uso o evitarlo por completo. También es importante utilizar una técnica aséptica.

Subcultivo y mantenimiento

Cuando las células aisladas se adhieren a la superficie de la placa de cultivo, comienza la fase de mantenimiento. La adhesión suele producirse 24 horas después del inicio del cultivo. Las células deben subcultivarse cuando hayan alcanzado un determinado porcentaje de confluencia y se estén replicando activamente. Dado que las células posconfluentes pueden sufrir diferenciación y mostrar una proliferación más lenta tras el pasaje, es mejor subcultivar los cultivos celulares primarios antes de que alcancen el 100% de confluencia.

El subcultivo en medios frescos mantiene el crecimiento exponencial de las células dependientes de anclaje. El subcultivo de monocapas interrumpe las interacciones intercelulares e intracelulares de la superficie celular. Se emplean bajas concentraciones de enzimas proteolíticas, como tripsina/EDTA, para extraer células primarias adherentes de monocapas o tejidos. Una vez disociadas y diluidas en una solución unicelular, las células se cuentan y se transfieren a recipientes de cultivo frescos para que vuelvan a adherirse y multiplicarse.

Criopreservación y recuperación

La crioconservación preserva las células vivas congelándolas a bajas temperaturas. La criopreservación y descongelación de células primarias humanas evita la muerte y el daño celular durante el almacenamiento y el uso. Las células primarias humanas se crioprotegen utilizando DMSO o glicerol (a la temperatura adecuada y con una velocidad de congelación controlada). El proceso de congelación debe ser progresivo, a -1 °C cada minuto, para evitar la formación de cristales de hielo. El almacenamiento a largo plazo requiere nitrógeno líquido (-196 °C) o temperaturas inferiores a -130 °C.

Sumergir las células congeladas en un baño de agua a 37 °C durante 1 ó 2 minutos es suficiente para descongelar las células crioconservadas. Las células primarias humanas no deben centrifugarse una vez descongeladas (ya que son extremadamente sensibles a los daños durante la recuperación de la crioconservación). Es adecuado para la siembra de células inmediatamente después de la descongelación, y promueve la fijación en los cultivos durante las primeras 24 horas después de la siembra. 1 Una vez que las células primarias criopreservadas se han adherido, debe eliminarse el medio utilizado (ya que el DMSO es perjudicial para las células primarias y puede provocar una disminución de la viabilidad tras la descongelación).