Células primarias humanas

¿Qué son las células primarias humanas?

Las células primarias son la representación más pura de sus respectivos tejidos. Se aíslan del tejido y se procesan para que puedan establecerse en un entorno de cultivo con condiciones ideales. Imitan más fielmente el estado in vivo y muestran una fisiología normal, ya que se derivan del tejido en lugar de haber sido modificadas. Por ello, pueden servir como modelos útiles para la investigación en farmacología celular, toxicología y fisiología (incluidos los estudios sobre el metabolismo, el envejecimiento y la transducción de señales). Hay que tener en cuenta que las células primarias son más difíciles de cultivar y mantener que una línea celular continua, ya que tienen una vida útil más corta y dejan de dividirse (o envejecen) tras un determinado número de divisiones celulares. Los estudios sobre las vías de señalización celular se complican debido a la variabilidad inherente de las células primarias obtenidas de donantes y a las prácticas de subcultivo. Antes de iniciar los estudios de señalización, los investigadores suelen realizar un cribado para determinar si las células responden o no a los estímulos más habituales. Para evitar perder tiempo y dinero, las células primarias pueden estimularse para activar las principales vías de señalización antes de someterlas al cribado.

¿Por qué utilizar células primarias humanas?

Las líneas celulares inmortalizadas se utilizan habitualmente como ensayo celular. Sin embargo, los científicos han reconocido que los cambios biológicos debidos a las líneas celulares pueden ser perjudiciales a la hora de estudiar su importancia fisiológica. El uso de células primarias humanas mejora el valor fisiológico de los datos obtenidos a través de cultivos celulares, y cada vez se consideran más importantes para el estudio de los procesos biológicos, la evolución de las enfermedades y el desarrollo de fármacos.

Las células primarias humanas se utilizan ampliamente en estudios in vitro sobre la comunicación intercelular e intracelular, la biología del desarrollo y los mecanismos subyacentes al cáncer, la enfermedad de Parkinson y la diabetes, entre muchas otras áreas de investigación biológica preclínica y de investigación. Los investigadores llevan mucho tiempo utilizando líneas celulares inmortalizadas para estudiar la función de los tejidos; sin embargo, las líneas celulares con mutaciones evidentes y anomalías cromosómicas pueden no ser buenos sustitutos de las células normales ni del desarrollo de la enfermedad en sus primeras etapas. Ahora es posible obtener un modelo más preciso de un tipo celular específico de un tejido utilizando células primarias humanas aisladas de dicho tejido y mantenidas en medios de cultivo de células primarias y suplementos.

¿Qué es el cultivo de células primarias?

En lugar de utilizar líneas celulares inmortalizadas, el cultivo de células primarias consiste en cultivar células directamente a partir de un organismo multicelular fuera del cuerpo. En algunos países, como el Reino Unido, existe un reconocimiento legal del hecho de que los cultivos de células primarias son más representativos de los tejidos in vivo que las líneas celulares. No obstante, las células primarias necesitan el sustrato y los nutrientes adecuados para crecer y, tras un determinado número de divisiones, desarrollan un fenotipo senescente que hace que dejen de dividirse de forma permanente. Estos dos factores motivan la creación de líneas celulares. Tanto las células primarias inmortalizadas de forma natural (p. ej., las células HeLa) como las inmortalizadas artificialmente (p. ej., las células HEK) pueden cultivarse indefinidamente en cultivo celular.

Células primarias humanas por tipos de tejido

Las células epiteliales, los fibroblastos, los queratinocitos, los melanocitos, las células endoteliales, las células musculares, las células inmunitarias y las células madre, como las células madre mesenquimales, se encuentran entre las células primarias humanas más utilizadas en la investigación científica. Para empezar, los cultivos son heterogéneos (representan una mezcla de los tipos de células presentes en el tejido) y solo pueden mantenerse vivos in vitro durante un tiempo determinado. La transformación es un proceso in vitro que permite manipular las células primarias humanas para obtener subcultivos ilimitados. La transformación puede producirse de forma natural o ser inducida por sustancias químicas o virus. Tras sufrir una transformación genética, un cultivo primario puede dividirse indefinidamente hasta convertirse en una línea celular secundaria inmortalizada si se le proporcionan suficientes nutrientes y espacio.

Células endoteliales

El tratamiento del cáncer, la cicatrización de heridas, la investigación sobre la señalización celular, el cribado de alto rendimiento y alto contenido, y el cribado toxicológico son solo algunas de las áreas que pueden beneficiarse del uso de células endoteliales primarias como herramienta de investigación.

Queratinocitos

Los queratinocitos, derivados de la epidermis de la piel humana adulta o del prepucio neonatal, desempeñan un papel crucial en el estudio de enfermedades cutáneas como la psoriasis y el cáncer.

Células epiteliales

Desde los estudios sobre el cáncer hasta las investigaciones toxicológicas, las células epiteliales primarias han demostrado ser recursos inestimables para modelar las defensas naturales del organismo.

Fibroblastos

La inducción de células madre pluripotentes (iPS) y el estudio de la cicatrización de heridas son solo algunos de los muchos usos de los fibroblastos primarios.

Células inmunitarias

Las células mononucleares de sangre periférica, PBMC por sus siglas en inglés, son células mononucleares de la sangre con un núcleo redondo. Incluyen principalmente linfocitos y monocitos, que desempeñan funciones importantes en el curso de una respuesta inmunitaria. Las células mononucleares de sangre periférica se utilizan a menudo para diagnosticar infecciones o para detectar una posible protección vacunal. Conocer la respuesta inmunitaria celular mediada por las células T suele ser crucial.

Melanocitos

Los melanocitos, células cutáneas especializadas que producen el pigmento melanina, resultan útiles como modelos para la investigación en temas como la cicatrización de heridas, la toxicidad, el melanoma, la respuesta dérmica a la radiación ultravioleta (UV), las enfermedades de la piel y los cosméticos.

Células madre

Las células madre tienen el potencial de diferenciarse en una amplia variedad de tipos celulares. Gracias a su capacidad de diferenciación, ofrecen nuevas oportunidades para modelar tejidos humanos y afecciones de salud.

Células madre mesenquimales

Las células madre mesenquimales, también conocidas como MSC, pueden obtenerse de diferentes fuentes humanas, como la médula ósea, la grasa (tejido adiposo), el tejido del cordón umbilical (gelatina de Wharton) y el líquido amniótico (el líquido que rodea al feto), y pueden cultivarse in vitro. Estas células madre estromales adultas tienen la capacidad de desarrollarse en una amplia variedad de tipos celulares. Algunos de estos tipos celulares son las células óseas, las células cartilaginosas, las células musculares, las células neuronales, las células cutáneas y las células corneales.

Células del músculo liso

En el interior de los órganos huecos, las células musculares lisas (CML) primarias recubren la pared interna y regulan la contractilidad. Además de en el cáncer y otras enfermedades, las CML pueden utilizarse para modelar la fibrosis asociada a la hipertensión.

Células primarias y líneas celulares

Ya sea por mutación espontánea, como en las líneas celulares cancerosas transformadas, o mediante alteración intencionada, como en la producción artificial de genes oncológicos, las líneas celulares continuas han adquirido la capacidad de reproducirse indefinidamente (inmortalizadas). Por regla general, las líneas celulares continuas son más fiables y más fáciles de manejar que las células primarias. Pueden expandirse indefinidamente y proporcionan un acceso rápido a datos esenciales. El uso de líneas celulares continuas presenta ciertas limitaciones, entre ellas el hecho de que están genéticamente modificadas o transformadas, lo que podría alterar sus características fisiológicas y hacer que no se correspondan con las condiciones in vivo, y que esto pueda cambiar aún más con el tiempo tras un número significativo de pases.

Avances en el cultivo de células primarias

Las células primarias tienen fama de ser difíciles de manejar. Sin embargo, el proceso se está volviendo más sencillo que nunca gracias a los avances en el cultivo de células primarias, a la disponibilidad de células primarias comerciales con protocolos totalmente optimizados y a las nuevas técnicas de análisis que requieren menos esfuerzo.

El paso del cultivo celular bidimensional al tridimensional se considera un hito importante en este campo. La arquitectura específica del tejido, las interacciones célula-célula y la señalización mecánica y bioquímica pueden verse atenuadas en un cultivo 2D. Por lo tanto, el valor biológico de estos cultivos tiene un límite.

Por otro lado, el cultivo celular tridimensional permite que las células se expandan e interactúen con un entramado extracelular tridimensional. Esto permite que las células interactúen entre sí y con la matriz extracelular, lo que hace que los cultivos tridimensionales sean más relevantes desde el punto de vista fisiológico. La precisión de este método a la hora de predecir respuestas in vivo lo ha convertido en una herramienta revolucionaria en campos como el descubrimiento y el desarrollo de fármacos. Por ello, tecnologías de vanguardia, como los organoides derivados de pacientes y los «órganos en un chip», proporcionan modelos altamente contextuales para el cribado y el desarrollo de fármacos.

La generación de células primarias constituye un cuello de botella en el cultivo primario. Para superarlo, suele ser necesario un mayor volumen de tejido, lo que puede resultar difícil de conseguir. Sin embargo, la mejora de la sensibilidad analítica está abriendo nuevas vías. Por ejemplo, la necesidad de cultivar grandes cantidades de células primarias se reduce mediante el uso de la tecnología de célula única, que incluye la secuenciación, el western blot y la citometría de masas.

Perspectivas prometedoras para el cultivo de células primarias

Las dificultades generales del cultivo de células primarias se están mitigando gracias a los avances tecnológicos. A su vez, este método está sustituyendo rápidamente a otros como método de referencia en el estudio y la práctica de la biología celular y molecular. La fabricación de vacunas, el trasplante de órganos, las terapias con células madre, la investigación sobre el cáncer y muchos otros campos se beneficiarán enormemente de los continuos avances en el cultivo de células primarias.

Consejos y trucos para el cultivo de células primarias

Las necesidades de la expansión celular

Los dos métodos más comunes para cultivar células primarias son en suspensión o sobre una superficie (2D). Algunas células son capaces de flotar libremente en el torrente sanguíneo sin adherirse nunca a una superficie (por ejemplo, las derivadas de la sangre periférica). Se han diseñado diferentes líneas celulares para que prosperen en cultivos en suspensión, donde pueden alcanzar densidades inalcanzables en condiciones de crecimiento 2D. Las células primarias que necesitan anclaje para crecer in vitro se denominan células adherentes e incluyen las que se encuentran en los tejidos sólidos. Para mejorar las propiedades de adhesión y proporcionar otras señales necesarias para el crecimiento y la diferenciación, estas células se cultivan normalmente en un recipiente plano de plástico sin recubrimiento, aunque en ocasiones se utiliza un microportador. Esta última opción puede recubrirse con proteínas de la matriz extracelular (como el colágeno y la laminina). Los medios utilizados en el cultivo celular consisten en un medio básico al que se han añadido los factores de crecimiento y las citoquinas adecuados. Una incubadora celular es un tipo especial de incubadora de laboratorio que se utiliza para cultivar y mantener las células a una temperatura y una mezcla de gases específicas (normalmente 37 °C y un 5 % de CO₂ para las células de mamíferos). Dependiendo del tipo de célula que se cultive, las condiciones óptimas pueden variar considerablemente. Según los tipos de células que se cultiven, el medio de crecimiento óptimo presentará una combinación única de factores, entre los que se incluyen, entre otros, el pH, la concentración de glucosa, los factores de crecimiento y la presencia de otros nutrientes.

Los antibióticos en el medio de cultivo son fundamentales durante el establecimiento del cultivo primario para prevenir la contaminación procedente del tejido del huésped. Algunos regímenes antibióticos incluyen una combinación de gentamicina, penicilina, estreptomicina y anfotericina B. Sin embargo, no se recomienda el uso de antibióticos durante un periodo prolongado, ya que algunos reactivos (como la anfotericina B) pueden resultar tóxicos para las células a largo plazo.

La mayoría de las células primarias entran en senescencia y dejan de dividirse tras un determinado número de duplicaciones de la población, por lo que resulta crucial mantenerlas vivas tras su aislamiento. La viabilidad celular a largo plazo requiere técnicas especializadas de cultivo celular y condiciones de cultivo ideales (incluidos el medio adecuado, la temperatura adecuada, la mezcla de gases adecuada, el pH adecuado, la concentración adecuada de factores de crecimiento, la presencia de nutrientes y la presencia de glucosa). Dado que muchos de los factores de crecimiento utilizados para complementar los medios de cultivo se obtienen de la sangre animal (los ingredientes derivados de la sangre presentan un riesgo de contaminación), se recomienda minimizar su uso o evitarlo por completo. También es importante utilizar una técnica aséptica.

Subcultivo y mantenimiento

Cuando las células aisladas se adhieren a la superficie de la placa de cultivo, esto marca el inicio de la fase de mantenimiento. La adhesión suele producirse 24 horas después del inicio del cultivo. Las células deben someterse a subcultivo cuando hayan alcanzado un determinado porcentaje de confluencia y se estén replicando activamente. Dado que las células posconfluentes pueden sufrir diferenciación y presentar una proliferación más lenta tras el paso, es mejor realizar el subcultivo de los cultivos celulares primarios antes de que alcancen el 100 % de confluencia.

El subcultivo en medios frescos mantiene el crecimiento exponencial de las células dependientes del anclaje. El subcultivo de monocapas interrumpe las interacciones inter e intracelulares en la superficie celular. Se emplean bajas concentraciones de enzimas proteolíticas, como la tripsina/EDTA, para extraer células primarias adherentes de monocapas o tejidos. Tras su disociación y dilución en una solución de células individuales, las células se cuentan y se transfieren a recipientes de cultivo nuevos para que se vuelvan a adherir y se multipliquen.

Crioconservación y recuperación

La crioconservación preserva las células vivas mediante su congelación a bajas temperaturas. La crioconservación y la descongelación de células primarias humanas evitan la muerte celular y el daño durante el almacenamiento y el uso. Las células primarias humanas se crioprotegen utilizando DMSO o glicerol (a la temperatura adecuada y con una velocidad de congelación controlada). El proceso de congelación debe ser progresivo, a -1 °C por minuto, para evitar la formación de cristales de hielo. El almacenamiento a largo plazo requiere nitrógeno líquido (-196 °C) o temperaturas inferiores a -130 °C.

Para descongelar las células criopreservadas basta con sumergirlas en un baño de agua a 37 °C durante aproximadamente 1 o 2 minutos. Las células primarias humanas no deben centrifugarse tras su descongelación del congelador (ya que son extremadamente sensibles al daño durante la recuperación de la criopreservación). Es adecuado para sembrar las células inmediatamente después de la descongelación y favorece la adhesión en los cultivos durante las primeras 24 horas tras la siembra. 1 Una vez que las células primarias criopreservadas se hayan adherido, se debe retirar el medio usado (ya que el DMSO es perjudicial para las células primarias y puede provocar una disminución de la viabilidad tras la descongelación).