Cellodling av däggdjur: Grundläggande principer och tekniker
Cellodling av däggdjursceller är en hörnstensteknik inom biologisk forskning och gör det möjligt för forskare att studera celler i en kontrollerad miljö utanför levande organismer. Processen innebär att man isolerar celler från vävnader, håller dem under noggrant kontrollerade förhållanden och förökar dem för olika experimentella ändamål. Däggdjurscellkultur är avgörande för att förstå cellulära processer, sjukdomsmekanismer och utveckla nya terapier, inklusive sådana som använder odödliga cellinjer
Viktiga lärdomar:
- Celler kan isoleras från vävnader med hjälp av enzymatisk nedbrytning eller explantatkulturmetoder
- Primära celler har begränsad livslängd, medan odödliga cellinjer kan föröka sig på obestämd tid
- Odlingsförhållandena, inklusive tillväxtmediets sammansättning, är avgörande för cellernas överlevnad och proliferation
- Celler kan odlas i suspension eller som adherenta kulturer, beroende på typ och forskningsbehov
- Vanliga odlingsmedier är MEM, DMEM och RPMI 1640, som alla är skräddarsydda för specifika celltyper
- Typiska odlingsförhållanden är 37°C temperatur, 5% CO2 och 95% relativ luftfuktighet
- Serumalternativ som humant trombocytlysat (hPL) används allt oftare för att undvika potentiella kontamineringsproblem
Tekniker för cellisolering
Processen med att etablera en cellkultur börjar med att isolera celler från vävnader. Det finns flera metoder för att åstadkomma detta, var och en lämpad för olika vävnadstyper och forskningsmål. För blodprover är cellisolering relativt okomplicerad, och vita blodkroppar är det primära fokuset för odling på grund av deras tillväxtförmåga. Fasta vävnader kräver mer komplexa isoleringstekniker. En vanlig metod är enzymatisk nedbrytning, där enzymer som kollagenas, trypsin eller pronas används för att bryta ner den extracellulära matrisen och frigöra enskilda celler till suspension. Alternativt kan forskarna använda metoden med explantatkultur, där små bitar av vävnaden placeras direkt i tillväxtmedier, så att cellerna kan vandra ut och föröka sig. Valet mellan dessa metoder beror ofta på den specifika vävnadstypen, den önskade cellpopulationen och den avsedda experimentella användningen. Det är viktigt att notera att celler som isoleras direkt från en organism kallas primära celler och, med vissa undantag som tumörceller, vanligtvis har en begränsad livslängd i odling innan de genomgår senescens
Viktiga produkter för cellodling av däggdjur
| Produktens namn | Produktnummer | Produktnummer Kategori | Användning |
|---|---|---|---|
| DMEM, m: 4,5 g/L glukos, m: 4 mM L-glutamin, m: 1,5 g/L NaHCO3, m: 1,0 mM natriumpyruvat | 820300a | Kulturmedium | Medium för allmänt bruk för olika typer av mammalieceller |
| DMEM:Ham's F12 (1:1), w: 3,1 g/L Glukos, w: 1,6 mM L-Glutamin, w: 15 mM HEPES, w: 1,0 mM Natriumpyruvat, w: 1,2 g/L NaHCO3 | 820400a | Kulturmedier | Lämplig för ett brett spektrum av mammalieceller, särskilt epitelceller |
| RPMI 1640, w: 2,1 mM stabilt glutamin, w: 2,0 g/L NaHCO3 | 820700a | Kulturmedier | Används vanligen för lymfoida celler och hybridcellinjer |
| Accutase | 830100 | Dissociation av celler | Skonsam cellavskiljningslösning för adherenta celler |
| Frys medium CM-1 | 800150 | Kryopreservering | För frysning och långtidsförvaring av mammalieceller |
| Frysmedium CM-ACF, serumfritt | 800650 | Kryopreservering | Djurkomponentfritt medium för cellfrysning |
| PBS | 860015 | Buffertlösning | För tvättning av celler och upprätthållande av pH-balans |
| Medium för tillväxt av endoteliala celler | 820731 | Specialiserat medium | Optimerad för odling av endotelceller |
| Mykoplasma-testning | 900159 | Kvalitetskontroll | Viktigt för att upptäcka mykoplasmakontaminering i kulturer |
| Autentisering av cellinje - människa | 900154 | Kvalitetskontroll | Verifierar identiteten hos mänskliga cellinjer |
Denna tabell visar ett urval av viktiga produkter för cellodling av däggdjur. För vårt kompletta sortiment av cellodlingsprodukter, inklusive specialiserade medier och reagenser, besök vår kategorisida för medier och reagenser.
- Ett skonsamt alternativ till Trypsin
Accutase är en cellavskiljningslösning som revolutionerar cellodlingsindustrin. Det är en blandning av proteolytiska och kollagenolytiska enzymer som efterliknar effekten av trypsin och kollagenas. Till skillnad från trypsin innehåller Accutase inga däggdjurs
- eller bakteriekomponenter och är mycket skonsammare mot cellerna, vilket gör det till en idealisk lösning för rutinmässig avskiljning av celler från vanliga plastbehållare för vävnadsodling och plastbehållare med adhesionsbeläggning. I det här blogginlägget går vi igenom fördelarna och användningsområdena för Accutase och hur det förändrar spelreglerna för cellodling.
Fördelar med Accutase
Accutase har flera fördelar jämfört med traditionella trypsinlösningar. För det första kan det användas när det behövs en skonsam och effektiv avskiljning av en adherent cellinje, vilket gör det till en direkt ersättning för trypsin. För det andra fungerar Accutase mycket bra på embryonala och neuronala stamceller, och det har visat sig att dessa cellers viabilitet bibehålls efter passering. För det tredje bevarar Accutase de flesta epitoper för efterföljande flödescytometrianalys, vilket gör den idealisk för analys av cellytemarkörer.
Dessutom behöver Accutase inte neutraliseras vid passering av adherenta celler. Genom att tillsätta mer media efter att cellerna har delats späds Accutase ut så att det inte längre kan lossa cellerna. Detta eliminerar behovet av ett inaktiveringssteg och sparar tid för cellodlingsteknikerna. Slutligen behöver Accutase inte alikeras, och en flaska är stabil i kylskåpet i 2 månader.
Tillämpningar av Accutase
Accutase är en direkt ersättning för trypsinlösning och kan användas för passering av cellinjer. Dessutom fungerar Accutase bra när celler lossas för analys av många cellytmarkörer med hjälp av flödescytometri och för cellsortering. Andra nedströmsapplikationer för Accutase-behandling inkluderar analys av cellytmarkörer, virustillväxtanalys, cellproliferation, tumörcellsmigrationsanalyser, rutinmässig cellpassage, produktionsuppskalning (bioreaktor) och flödescytometri.
Sammansättning av Accutase
Accutase innehåller inga däggdjurs
- eller bakteriekomponenter och är en naturlig enzymblandning med proteolytisk och kollagenolytisk enzymaktivitet. Den är formulerad i en mycket lägre koncentration än trypsin och kollagenas, vilket gör den mindre toxisk och skonsammare, men lika effektiv.
Effektiviteten hos Accutase
Accutase har visat sig vara effektivt när det gäller att avlägsna primära celler och stamceller och bibehålla hög cellviabilitet jämfört med enzymer av animaliskt ursprung, t.ex. trypsin. 100% av cellerna återvinns efter 10 minuter, och det är ingen fara att låta cellerna ligga i Accutase i upp till 45 minuter, tack vare Accutases autodigestion.
Sammanfattningsvis
Sammanfattningsvis är Accutase en kraftfull lösning som håller på att förändra spelreglerna för cellodling. Med sin skonsamma natur, effektivitet och mångsidighet är Accutase det perfekta alternativet till trypsin. Om du letar efter en tillförlitlig och effektiv lösning för cellavskiljning är Accutase lösningen för dig.
Fosfatbuffrad saltlösning (PBS) är en buffertlösning som används i stor utsträckning inom biologisk och kemisk forskning. Den spelar en avgörande roll för att upprätthålla pH-balansen och osmolariteten under olika experimentella procedurer, inklusive vävnadsbearbetning och cellodling. Vår PBS-lösning är noggrant formulerad med ingredienser med hög renhet för att säkerställa stabilitet och tillförlitlighet i varje experiment. Osmolariteten och jonkoncentrationerna i vår PBS efterliknar i hög grad de som finns i människokroppen, vilket gör den isotonisk och giftfri för de flesta celler.
Sammansättning av vår PBS-lösning
Vår PBS-lösning är en pH-justerad blandning av fosfatbuffertar och saltlösningar av ultrapur kvalitet. Vid en 1X arbetskoncentration innehåller den:
8000 mg/L natriumklorid (NaCl)
200 mg/L kaliumklorid (KCl)
1150 mg/L Natriumfosfat dibasisk vattenfri (Na2HPO4)
200 mg/L Kaliumfosfat monobasiskt vattenfritt (KH2PO4)
Denna sammansättning säkerställer en optimal pH
- och jonbalans, lämplig för ett brett spektrum av biologiska tillämpningar.
Tillämpningar av vår PBS-lösning
Vår PBS-lösning är idealisk för olika tillämpningar inom biologisk forskning. Dess isotoniska och giftfria egenskaper gör den lämplig för utspädning av substanser och sköljning av cellbehållare. PBS-lösningar som innehåller EDTA är effektiva för att frigöra fastsittande och klumpade celler. Tvåvärda metaller som zink bör dock inte tillsättas i PBS, eftersom det kan orsaka utfällning. I sådana fall rekommenderas Good's buffertar. Dessutom är vår PBS-lösning ett godtagbart alternativ till viralt transportmedium för transport och förvaring av RNA-virus, inklusive SARS-CoV-2.
Kvalitetskontroll
Sterilt filtrerad
Förvaring och hållbarhetstid
Förvaras vid +2°C till +25°C, skyddat från ljus.
Efter öppnandet, förvara vid 2°C till 25°C och använd inom 24 månader.
Förhållanden vid leverans
Omgivande temperatur
Underhåll
Förvaras i kylskåp vid +2°C till +8°C i mörker. Undvik frysning och frekvent uppvärmning till +37°C, eftersom det försämrar produktkvaliteten.
Värm inte upp mediet över 37°C och använd inte okontrollerade värmekällor som t.ex. mikrovågsugnar.
Om endast en del av mediet ska användas, ta ut den mängd som behövs och värm det till rumstemperatur före användning.
Sammansättning
Kategori
Komponenter
Koncentration (mg/L)
Salter
Kaliumklorid
200
Kaliumfosfat monobasiskt vattenfritt
200
Natriumklorid
8000
Natriumfosfat dibasisk vattenfri
1150
Analysmetod
CLS erbjuder både korttids
- och långtidstestning för detektion av mykoplasma. I det förstnämnda fallet testas proverna omedelbart efter ankomst, medan cellodling initieras i det sistnämnda fallet och cellerna testas efter 14 dagars antibiotikafri odling. Mykoplasma-testning utförs med ett tvåpunktsdetektionssystem med både PlasmoTest™
- Mycoplasma Detection Kit (Invivogen) och Certus QC
- mycoADVANCED Detection Kit (Certus).
Prover
För snabbtestet ska du tillhandahålla minst 50 µl cellsuspension som innehåller 50 000 celler. Cellsuspensionen kan levereras vid rumstemperatur.
För premiumtestet ska du tillhandahålla minst 1 miljon celler i ett lämpligt frysmedium för att säkerställa en robust och hälsosam kultur för odling och efterföljande testning av cellerna. Skicka proverna på torr is.
Fyll i Mycoplasma Testing Sample Form och bifoga den med din provförsändelse.
Kolorimetrisk reporteranalys
Detta test är en cellbaserad kolorimetrisk analys. I närvaro av mykoplasma inducerar en reportercellinje en signalkaskad som utlöser en färgförändring i mediet från rött till blått. Assayen utförs i 96-brunnars multiwellplattor. Signalerna detekteras i en spektrofotometer för mikroplattor vid 620-655 nm. Alla mykoplasma
- och acholeplasma-arter, men även andra föroreningar i cellkulturer, t.ex. bakterier, detekteras.
Isotermisk amplifiering
Isotermisk amplifiering är ett snabbt och tillförlitligt test som baseras på isotermisk amplifiering av mykoplasmaspecifikt DNA kombinerat med realtidsdetektion med hjälp av ett DNA-interkalerande färgämne. Analysen kan detektera sex av de vanligaste arterna som står för >95% av kontamineringarna: M.orale, M.hyorhinis, M.arginini, M.fermentans, M.hominis och A.laidlawii. På grund av sekvenshomologi kommer även andra mykoplasmaarter att upptäckas (M.pneumoniae, M.gallisepticum och M.synoviae). För att identifiera om provet är mykoplasmapositivt eller -negativt studeras smälttemperaturen (Tm).
Slutsats: Mammaliancellkulturens centrala roll i modern forskning
Cellodling av däggdjursceller har revolutionerat den biologiska och medicinska forskningen och gett forskarna kraftfulla verktyg för att studera komplexa cellulära processer, sjukdomsmekanismer och potentiella terapeutiska interventioner. Från isolering av primära celler till utveckling av odödliga cellinjer har denna teknik blivit en oumbärlig del av den moderna vetenskapliga verktygslådan
Däggdjurscellkulturens resa börjar med noggranna isoleringstekniker, fortsätter genom det omsorgsfulla underhållet av celler i specialiserade medier och kulminerar i ett brett utbud av tillämpningar inom olika forskningsområden. Oavsett om det handlar om cancerforskning, läkemedelsupptäckt eller grundläggande cellbiologi har möjligheten att odla och manipulera mammalieceller in vitro öppnat helt nya vägar för vetenskaplig utforskning
Nyckeln till framgång för cellodling av däggdjursceller är de noggrant kontrollerade förhållanden under vilka cellerna hålls. Från sammansättningen av tillväxtmedier till de exakta miljöparametrarna i inkubatorer är varje aspekt optimerad för att efterlikna cellernas naturliga förhållanden så nära som möjligt. Denna omsorg om detaljerna säkerställer att experimenten är tillförlitliga och reproducerbara, vilket är en hörnsten i god vetenskaplig praxis
Utvecklingen av odödliga cellinjer, till exempel de allmänt använda HeLa-cellerna, har ytterligare utökat möjligheterna med cellodling. Dessa cellinjer ger konsekventa, lättillgängliga cellmodeller som har påskyndat forskningen inom många olika discipliner
När vi blickar framåt fortsätter cellodlingen i däggdjursceller att utvecklas. Framsteg inom 3D-odlingstekniker, organoidutveckling och användning av kemiskt definierade medier flyttar fram gränserna för vad som är möjligt inom cellodling. Denna utveckling kommer att föra in vitro-modellerna ännu närmare komplexiteten i in vivo-systemen, vilket potentiellt kan revolutionera läkemedelsupptäckten, den individanpassade medicinen och vår förståelse av den mänskliga biologin
Sammanfattningsvis är cellodling av däggdjur fortfarande en dynamisk och viktig teknik inom biovetenskaplig forskning. Dess fortsatta förfining och tillämpning kommer utan tvekan att spela en avgörande roll när det gäller att ta itu med några av de mest angelägna frågorna inom biologi och medicin och driva på de vetenskapliga framstegen under många år framöver