Primära mänskliga celler

Vad är primära mänskliga celler?

Primärceller är den renaste representationen av sina respektive vävnader. De isoleras från vävnaden och bearbetas så att de kan etableras i en odlingsmiljö med idealiska förhållanden. De efterliknar tillståndet in vivo bättre och uppvisar normal fysiologi eftersom de härrör från vävnad snarare än att vara modifierade. På grund av detta kan de fungera som användbara modeller för forskning inom cellulär farmakologi, toxikologi och fysiologi (inklusive studier av ämnesomsättning, åldrande och signaltransduktion). Tänk på att primärceller är svårare att odla och underhålla än en kontinuerlig cellinje, eftersom de har en kortare livslängd och slutar dela sig (eller åldras) efter ett visst antal celldelningar. Studier av cellsignaleringsvägar kompliceras av den inneboende variabiliteten hos primärceller som erhållits från donatorer och genom subkultureringsmetoder. Innan signaleringsstudier påbörjas genomför forskare ofta en screening för att avgöra om cellerna reagerar på vanligt förekommande stimuli eller inte. För att undvika att slösa tid och pengar kan primärceller stimuleras för att aktivera viktiga signaleringsvägar innan de screenas.

Varför använda humana primärceller?

Immortaliserade cellinjer används ofta som cellanalys. Även om forskare har insett att biologiska förändringar till följd av cellinjer kan vara skadliga när man studerar deras fysiologiska betydelse, förbättrar användningen av humana primärceller det fysiologiska värdet av data som erhålls genom cellodlingar, och de betraktas i allt högre grad som viktiga för att studera biologiska processer, sjukdomsförlopp och läkemedelsutveckling.

Humana primärceller används i stor utsträckning i in vitro-studier av intercellulär och intracellulär kommunikation, utvecklingsbiologi samt de mekanismer som ligger till grund för cancer, Parkinsons sjukdom och diabetes, bland många andra prekliniska och undersökande biologiska forskningsområden. Forskare har länge använt odödliggjorda cellinjer för att studera vävnadsfunktion; dock kan cellinjer med uppenbara mutationer och kromosomavvikelser vara dåliga ersättare för normala celler och sjukdomsutvecklingen i dess tidiga stadier. En mer exakt modell av en specifik vävnadscelltyp kan nu uppnås genom att använda humana primärceller som isolerats från den vävnaden och odlas i odlingsmedier och tillskott avsedda för primärcellskultur.

Vad är primärcellodling?

I stället för att använda odödliga cellinjer innebär primärcellodling att celler odlas direkt från en flercellig organism utanför kroppen. I vissa länder, till exempel Storbritannien, erkänns det juridiskt att primärcellodlingar är mer representativa för vävnader in vivo än cellinjer. Primärceller behöver dock rätt substrat och näringsämnen för att växa, och efter ett visst antal delningar utvecklar de en senescent fenotyp som gör att de permanent slutar dela sig. Dessa två faktorer motiverar skapandet av cellinjer. Både naturligt odödliga primärceller (t.ex. HeLa-celler) och artificiellt odödliga primärceller (t.ex. HEK-celler) kan odlas i oändlighet i cellodling.

Mänskliga primärceller efter vävnadstyp

Epithelceller, fibroblaster, keratinocyter, melanocyter, endotelceller, muskelceller, immunceller och stamceller som mesenkymala stamceller hör till de vanligast använda humana primärcellerna i vetenskaplig forskning. Till att börja med är odlingarna heterogena (de representerar en blandning av de celltyper som finns i vävnaden) och de kan endast hållas vid liv in vitro under en viss tid. Transformation är en in vitro-process som gör det möjligt att manipulera humana primärceller för obegränsade subkulturer. Transformation kan ske naturligt, eller den kan induceras av kemikalier eller virus. Efter att ha genomgått genetisk transformation kan en primärkultur dela sig i oändlighet till en odödliggjord sekundär cellinje om den får tillräckligt med näringsämnen och utrymme.

Endotelceller

Cancerbehandling, sårläkning, forskning om cellsignalering, screening med hög genomströmning och högt innehåll samt toxikologisk screening är bara några av de områden som kan dra nytta av användningen av primära endotelceller som forskningsverktyg.

Keratinocyter

Keratinocyter, som härrör från epidermis hos antingen vuxna människor eller nyfödda pojkar, spelar en avgörande roll i studiet av hudsjukdomar som psoriasis och cancer.

Epithelceller

Från cancerstudier till toxikologiska undersökningar har primära epitelceller visat sig vara ovärderliga resurser för att modellera kroppens naturliga försvar.

Fibroblaster

Att framställa inducerade pluripotenta stamceller (iPS-celler) och studera sårläkning är bara några av de många användningsområdena för primära fibroblaster.

Immunceller

Mononukleära celler i perifert blod, förkortat PBMC, är mononukleära blodceller med en rund cellkärna. De består huvudsakligen av lymfocyter och monocyter, som har viktiga funktioner under en immunrespons. Mononukleära celler från perifert blod används ofta för att diagnostisera infektioner eller för att upptäcka eventuellt vaccinationsskydd. Insikt i det cellulära immunsvaret som förmedlas av T-celler är ofta avgörande.

Melanocyter

Melanocyter, de specialiserade hudcellerna som producerar pigmentet melanin, är användbara som modeller för forskning inom områden som sårläkning, toxicitet, melanom, hudens reaktion på ultraviolett (UV) strålning, hudsjukdomar och kosmetika.

Stamceller

Stamceller har potential att differentieras till en mängd olika celltyper. Tack vare sin förmåga att differentieras erbjuder de nya möjligheter att modellera mänsklig vävnad och hälsotillstånd.

Mesenchymala stamceller

Mesenchymala stamceller, även kallade MSC, kan utvinnas från olika mänskliga källor såsom benmärg, fettvävnad, navelsträngsvävnad (Whartons gelé) och fostervatten (vätskan som omger fostret) och kan odlas in vitro. Dessa vuxna stromala stamceller har förmågan att utvecklas till en mängd olika celltyper. Några av dessa celltyper är benceller, broskceller, muskelceller, nervceller, hudceller och hornhinneceller.

Glattmuskelceller

I ihåliga organ täcker primära glatta muskelceller (SMC) insidan och reglerar sammandragningen. Förutom cancer och andra sjukdomar kan SMC användas för att modellera hypertoni och fibros.

Primära celler och cellinjer

Antingen genom spontan mutation, som i transformerade cancercellinjer, eller genom avsiktlig förändring, som vid artificiell framställning av cancergener, har kontinuerliga cellinjer fått förmågan att reproducera sig i oändlighet (odödliggjorda). I regel är kontinuerliga cellinjer mer tillförlitliga och lättare att hantera än primära celler. De kan förökas i oändlighet och ger snabb tillgång till väsentliga data. Användningen av kontinuerliga cellinjer har vissa begränsningar, bland annat det faktum att de är genetiskt modifierade/transformerade, vilket kan förändra fysiologiska egenskaper och göra att de inte stämmer överens med förhållandena in vivo, samt att detta kan förändras ytterligare över tid vid ett stort antal passager.

Framsteg inom primärcellodling

Primärceller har ett rykte om sig att vara svåra att arbeta med. Processen blir dock enklare än någonsin tack vare utvecklingen inom primärcellodling, tillgången till kommersiella primärceller med fullt optimerade protokoll samt nya analystekniker som kräver mindre insats.

Övergången från tvådimensionell till tredimensionell cellodling betraktas som en viktig milstolpe inom området. Vävnadsspecifik arkitektur, cell-cell-interaktioner samt mekanisk och biokemisk signalering kan försvagas i en 2D-odling. Det finns därför en gräns för det biologiska värdet av dessa odlingar.

Å andra sidan gör 3D-cellodling det möjligt för celler att expandera och interagera med ett tredimensionellt extracellulärt ramverk. Detta gör att cellerna kan interagera med varandra och den extracellulära matrisen, vilket gör 3D-odlingar mer fysiologiskt relevanta. Denna metods noggrannhet när det gäller att förutsäga in vivo-reaktioner har gjort den revolutionerande inom områden som läkemedelsupptäckt och -utveckling. Därför erbjuder toppmoderna tekniker, såsom organoider som härrör från patienter och ”organ-on-a-chip”, mycket kontextuella modeller för läkemedelsscreening och -utveckling.

Generering av primära celler utgör en flaskhals i primärodling. För att övervinna detta krävs vanligtvis en större vävnadsvolym, vilket kan vara svårt att uppnå. Förbättrad analytisk känslighet banar dock väg framåt. Till exempel minskas behovet av att odla stora mängder primärceller genom användning av enkelcellsteknik, som omfattar sekvensering, western blotting och masscytometri.

Lovande framtidsutsikter för primärcellskultur

De övergripande svårigheterna med primärcellskultur mildras av tekniska framsteg. I sin tur ersätter denna metod snabbt andra metoder som guldstandard inom cellulär och molekylärbiologisk forskning och praktik. Vaccintillverkning, organersättning, stamcellsterapier, cancerforskning och mycket mer kommer att dra stor nytta av de fortsatta framstegen inom primärcellskultur.

Tips och knep för primärcellskultur

Behovet av cellförökning

De två vanligaste metoderna för odling av primära celler är i suspension eller på en yta (2D). Vissa celler kan flyta fritt i blodomloppet utan att någonsin fästa vid en yta (till exempel celler som härrör från perifert blod). Olika cellinjer har utvecklats för att trivas i suspensionsodlingar, där de kan uppnå tätheter som är omöjliga att uppnå under 2D-odlingsförhållanden. Primärceller som behöver fästpunkt för att växa in vitro kallas adherenta celler och inkluderar de som finns i fasta vävnader. För att förbättra vidhäftningsegenskaperna och tillföra andra signaler som krävs för tillväxt och differentiering odlas dessa celler vanligtvis i ett plant, obelagt plastkärl, men ibland på en mikrobärare. Det sistnämnda alternativet kan vara belagt med extracellulära matrisproteiner (såsom kollagen och laminin). Det medium som används vid cellodling består av ett basmedium som har kompletterats med lämpliga tillväxtfaktorer och cytokiner. En cellinkubator är en speciell typ av laboratorieinkubator som används för att odla och hålla celler vid en specifik temperatur och gasblandning (vanligtvis 37 °C, 5 % CO₂ för däggdjursceller). Beroende på vilken typ av cell som odlas kan de optimala förhållandena variera kraftigt. Beroende på vilka celltyper som odlas kommer det optimala odlingsmediet att ha en unik kombination av faktorer, inklusive men inte begränsat till pH, glukoskoncentration, tillväxtfaktorer och förekomsten av andra näringsämnen.

Antibiotika i odlingsmediet är avgörande under etableringen av primärkulturen för att förhindra kontaminering från värdvävnaden. Vissa antibiotikabehandlingar består av en kombination av gentamicin, penicillin, streptomycin och amfotericin B. Användning av antibiotika under en längre tidsperiod rekommenderas dock inte, eftersom vissa reagenser (såsom amfotericin B) kan vara toxiska för cellerna på lång sikt.

De flesta primära celler genomgår senescens och slutar dela sig efter ett visst antal population fördubblingar, vilket gör det avgörande att hålla dem vid liv efter isolering. Långsiktig cellviabilitet kräver avancerade cellodlingstekniker och optimala odlingsförhållanden (inklusive rätt odlingsmedium, rätt temperatur, rätt gasblandning, rätt pH-värde, rätt koncentration av tillväxtfaktorer, närvaro av näringsämnen och närvaro av glukos). Eftersom många av de tillväxtfaktorer som används för att komplettera odlingsmedierna utvinns ur djurblod (de blodbaserade ingredienserna medför en risk för kontaminering) rekommenderas det att deras användning minimeras eller undviks helt. Det är också viktigt att använda aseptisk teknik.

Subkultur och underhåll

När isolerade celler fäster vid ytan på odlingsskålen markerar detta början på underhållsfasen. Fästningen sker vanligtvis 24 timmar efter odlingens start. Cellerna bör subkultiveras när de har nått en viss konfluensprocent och aktivt förökar sig. Eftersom celler som nått konfluens kan genomgå differentiering och uppvisa långsammare proliferation efter passage är det bäst att subkultivera primära cellkulturer innan de når 100 % konfluens.

Subkultivering i färskt odlingsmedium upprätthåller den exponentiella tillväxten hos fästberoende celler. Subkultivering av monolager stör inter- och intracellulära interaktioner på cellytan. Låga koncentrationer av proteolytiska enzymer, såsom trypsin/EDTA, används för att extrahera vidhäftande primärceller från monolager eller vävnader. Efter att cellerna har dissocierats och spädts ut till en enkelcellslösning räknas de och överförs till färska odlingskärl för att återfästa sig och föröka sig.

Kryokonservering och återvinning

Kryokonservering bevarar levande celler genom att frysa dem vid låga temperaturer. Kryokonservering och upptining av humana primärceller förhindrar celldöd och skador under lagring och användning. Humana primärceller kryoskyddas med DMSO eller glycerol (vid rätt temperatur och med kontrollerad fryshastighet). Frysningsprocessen måste ske gradvis, med -1 °C per minut, för att förhindra bildning av iskristaller. Långtidsförvaring kräver flytande kväve (-196 °C) eller temperaturer under -130 °C.

Det räcker med att sänka ner de frysta cellerna i ett vattenbad vid 37 °C i cirka 1 till 2 minuter för att tina upp kryokonserverade celler. Mänskliga primärceller bör inte centrifugeras efter upptining ur frysen (eftersom de är extremt känsliga för skador under återhämtningen från kryokonserveringen). Det är lämpligt att platera celler omedelbart efter upptining, och det främjar vidhäftningen i odlingarna under de första 24 timmarna efter pläteringen. 1 Efter att de kryokonserverade primärcellerna har fäst måste det använda odlingsmediet avlägsnas (eftersom DMSO är skadligt för primärceller och kan orsaka en minskning av livskraften efter upptining).