Primära humana celler

Vad är primära celler från människa?

Primära celler är den renaste representationen av sina respektive vävnader. De isoleras från vävnaden och bearbetas så att de kan etablera sig i en odlingsmiljö med idealiska förhållanden. De efterliknar in vivo-tillståndet mer och uppvisar normal fysiologi eftersom de härrör från vävnad snarare än modifieras. Därför kan de fungera som användbara modeller för forskning inom cellulär farmakologi, toxikologi och fysiologi (inklusive studier av metabolism, åldrande och signaltransduktion). Tänk på att primära celler är mer utmanande att odla och underhålla än en kontinuerlig cellinje eftersom de har kortare livslängd och slutar dela sig (eller åldras) efter ett visst antal celldelningar. Studier av cellers signalvägar kompliceras av den inneboende variabiliteten hos primära celler som erhålls från donatorer och genom subkulturer. Innan signalstudier påbörjas gör forskarna ofta en screening för att avgöra om cellerna svarar på vanliga stimuli eller inte. För att undvika slöseri med tid och pengar kan primära celler stimuleras att aktivera viktiga signalvägar innan de screenas.

Varför använda primära celler från människa?

Immortaliserade cellinjer används ofta som cellassay. Även om forskare har erkänt att biologiska förändringar på grund av cellinjer kan vara skadliga när man studerar deras fysiologiska betydelse. Användningen av humana primära celler förbättrar det fysiologiska värdet av data som erhålls genom cellodlingar, och de anses alltmer viktiga för att studera biologiska processer, sjukdomsförlopp och läkemedelsutveckling.

Humana primärceller används ofta i in vitro-studier av intercellulär och intracellulär kommunikation, utvecklingsbiologi och de mekanismer som ligger bakom cancer, Parkinsons sjukdom och diabetes, bland många andra prekliniska och undersökande biologiska forskningsområden. Forskare har länge använt odödliga cellinjer för att studera vävnadsfunktioner, men cellinjer med uppenbara mutationer och kromosomavvikelser kanske inte är bra substitut för normala celler och för sjukdomsutveckling i tidiga stadier. En mer exakt modell av en specifik vävnadscelltyp kan nu uppnås genom att använda humana primära celler som isolerats från vävnaden och hålls i primära cellodlingsmedier och -tillskott.

Vad är primär cellkultur?

Istället för att använda odlade cellinjer innebär primär cellodling att man odlar celler direkt från en multicellulär organism utanför kroppen. I vissa länder, t.ex. Storbritannien, är det juridiskt erkänt att primära cellkulturer är mer representativa för in vivo-vävnader än cellinjer. Primärceller behöver dock rätt substrat och näringsämnen för att växa, och efter ett visst antal delningar utvecklar de en senescent fenotyp som gör att de permanent slutar dela sig. Dessa två faktorer motiverar skapandet av cellinjer. Både naturligt odödliggjorda primärceller (t.ex. HeLa-celler) och artificiellt odödliggjorda primärceller (t.ex. HEK-celler) kan odlas på obestämd tid i cellkultur.

Primära celler från människa per vävnadstyp

Epitelceller, fibroblaster, keratinocyter, melanocyter, endotelceller, muskelceller, immunceller och stamceller, t.ex. mesenkymala stamceller, är några av de vanligaste primära cellerna i vetenskapliga studier. Till att börja med är kulturerna heterogena (de representerar en blandning av de celltyper som finns i vävnaden), och de kan bara hållas vid liv in vitro under en viss tid. Transformation är en in vitro-process som gör det möjligt att manipulera mänskliga primärceller för obegränsade subkulturer. Transformationen kan ske naturligt eller induceras av kemikalier eller virus. Efter att ha genomgått genetisk omvandling kan en primärkultur dela sig i det oändliga till en odödliggjord sekundär cellinje om den får tillräckligt med näring och utrymme.

Endoteliala celler

Cancerbehandling, sårläkning, forskning om cellsignalering, screening med hög genomströmning och högt innehåll samt toxikologisk screening är bara några av de områden som kan dra nytta av primära endotelceller som forskningsverktyg.

Keratinocyter

Keratinocyter, som härrör från överhuden hos antingen vuxna människor eller förhuden hos nyfödda, spelar en avgörande roll i studierna av hudsjukdomar som psoriasis och cancer.

Epiteliala celler

I allt från cancerstudier till toxikologiska undersökningar har primära epitelceller visat sig vara ovärderliga resurser för att modellera kroppens naturliga försvar.

Fibroblaster

Inducering av pluripotenta stamceller (iPS-celler) och studier av sårläkning är bara några av de många användningsområdena för primära fibroblaster.

Immunceller

Mononukleära celler i perifert blod, förkortat PBMC, är mononukleära celler i blodet med en rund cellkärna. De består huvudsakligen av lymfocyter och monocyter, som har viktiga funktioner under immunförsvarets gång. Mononukleära celler i perifert blod används ofta för att diagnostisera infektioner eller för att upptäcka eventuellt vaccinationsskydd. Insikt i det cellulära immunsvar som förmedlas av T-celler är ofta avgörande.

Melanocyter

Melanocyter, de specialiserade hudceller som producerar pigmentet melanin, är användbara som modeller för forskning inom ämnen som sårläkning, toxicitet, melanom, hudens reaktion på ultraviolett (UV) strålning, hudsjukdomar och kosmetika.

Stamceller

Stamceller har potential att differentieras till en mängd olika celltyper. På grund av sin förmåga att differentiera sig ger de nya möjligheter att modellera mänsklig vävnad och hälsotillstånd.

Mesenkymala stamceller

Mesenkymala stamceller, även kallade MSC, kan erhållas från olika mänskliga källor som benmärg, fett (fettvävnad), navelsträngsvävnad (Whartons gelé) och fostervatten (vätskan som omger ett foster) och kan expanderas in vitro. Dessa vuxna stromala stamceller har förmågan att utvecklas till en mängd olika celltyper. Några av dessa celltyper är benceller, broskceller, muskelceller, nervceller, hudceller och hornhinneceller.

Glatta muskelceller

I ihåliga organ finns det primära glatta muskelceller (SMC) som täcker insidan och förmedlar kontraktilitet. Förutom cancer och andra sjukdomar kan SMC användas för att modellera fibros vid högt blodtryck.

Primära celler och cellinjer

Antingen genom spontan mutation, som i transformerade cancercellinjer, eller genom avsiktlig förändring, som i den artificiella produktionen av cancergener, har kontinuerliga cellinjer fått potential att reproducera sig i det oändliga (odödliggjorda). Som regel är kontinuerliga cellinjer mer tillförlitliga och praktiska att hantera än primära celler. De kan expandera på obestämd tid och ger snabb tillgång till viktiga data. Användningen av kontinuerliga cellinjer har vissa begränsningar, bland annat det faktum att de är genetiskt modifierade/transformerade, vilket kan förändra fysiologiska egenskaper och inte motsvara in vivo-förhållandena, och att detta kan förändras ytterligare över tid med betydande passage.

Framsteg inom primär cellodling

Primära celler har ett ökänt rykte om sig att vara svåra att arbeta med. Processen blir dock enklare än någonsin tack vare utvecklingen inom primär cellodling, tillgången till kommersiella primära celler med helt optimerade protokoll och nya analystekniker som kräver mindre input.

Övergången från tvådimensionell till tredimensionell cellodling betraktas som en viktig milstolpe inom området. Vävnadsspecifik arkitektur, cell-cell-interaktioner och mekanisk/biokemisk signalering kan dämpas i en 2D-kultur. Det finns således en gräns för det biologiska värdet av dessa kulturer.

Å andra sidan gör 3D-cellodling det möjligt för celler att expandera och interagera med ett extracellulärt 3D-ramverk. Detta gör att cellerna kan interagera med varandra och den extracellulära matrisen, vilket gör 3D-odlingar mer fysiologiskt relevanta. Metodens förmåga att förutsäga reaktioner in vivo har gjort den revolutionerande inom områden som läkemedelsupptäckt och -utveckling. Tack vare detta ger den senaste tekniken, som organoider från patienter och organ-on-a-chip, mycket kontextuella modeller för screening och utveckling av läkemedel.

Generering av primära celler är en flaskhals i primärkulturer. För att övervinna detta krävs vanligtvis en större vävnadsvolym, vilket kan vara svårt att uppnå. Förbättrad analytisk känslighet ger dock en väg framåt. Till exempel minskar behovet av att odla stora mängder primära celler genom att använda single-cell-teknik, som omfattar sekvensering, western blotting och masscytometri.

Lovande framtidsutsikter för primär cellodling

De övergripande svårigheterna med primär cellodling mildras av tekniska framsteg. I sin tur håller denna metod snabbt på att ersätta andra som guldstandard inom cell- och molekylärbiologiska studier och tillämpningar. Vaccintillverkning, organersättning, stamcellsterapier, cancerforskning och mycket mer kommer att ha stor nytta av de fortsatta framstegen inom primär cellodling.

Tips och tricks för primär cellodling

Behoven av cellexpansion

De två vanligaste metoderna för odling av primära celler är i suspension eller på en yta (2D). Vissa celler kan flyta fritt i blodomloppet utan att någonsin fästa vid en yta (t.ex. celler från perifert blod). Olika cellinjer har utvecklats för att trivas i suspensionskulturer, där de kan nå tätheter som är omöjliga att uppnå under 2D-tillväxtförhållanden. Primära celler som behöver förankring för att växa in vitro kallas adherenta celler och omfattar de celler som finns i fasta vävnader. För att förbättra vidhäftningsegenskaperna och tillföra andra signaler som krävs för tillväxt och differentiering odlas dessa celler vanligtvis i ett platt, obelagt plastkärl, men ibland i en mikrobärare. Det senare alternativet kan vara belagt med extracellulära matrisproteiner (t.ex. kollagen och laminin). De medier som används vid cellodling består av ett basmedium som har kompletterats med lämpliga tillväxtfaktorer och cytokiner. En cellinkubator är en speciell typ av laboratorieinkubator som används för att odla och underhålla celler vid en specifik temperatur och gasblandning (vanligtvis 37 °C, 5% CO2 för däggdjursceller). Beroende på vilken typ av cell som odlas kan de optimala förhållandena vara mycket olika. Beroende på vilken typ av celler som odlas kommer det optimala tillväxtmediet att ha en unik kombination av faktorer, inklusive men inte begränsat till pH, glukoskoncentration, tillväxtfaktorer och närvaron av andra näringsämnen.

Antibiotika i tillväxtmediet är avgörande under etableringen av primärkulturen för att förhindra kontaminering från värdvävnaden. Vissa antibiotikaregimer innehåller en kombination av gentamicin, penicillin, streptomycin och amfotericin B. Användning av antibiotika under en längre tid rekommenderas dock inte, eftersom vissa reagenser (t.ex. amfotericin B) kan vara toxiska för cellerna på lång sikt.

De flesta primära celler genomgår senescens och slutar dela sig efter ett visst antal populationsdubbleringar, vilket gör det viktigt att hålla dem vid liv efter isoleringen. Långsiktig cellviabilitet kräver expertkunskaper inom cellodlingsteknik och idealiska odlingsförhållanden (inklusive rätt medium, rätt temperatur, rätt gasblandning, rätt pH, rätt koncentration av tillväxtfaktorer, närvaro av näringsämnen och närvaro av glukos). Eftersom många av de tillväxtfaktorer som används för att komplettera medier erhålls från djurblod (de blodbaserade ingredienserna har potential för kontaminering), rekommenderas att deras användning minimeras eller undviks helt och hållet. Det är också viktigt att använda en aseptisk teknik.

Subkultur och underhåll

När isolerade celler fäster på ytan av odlingsskålen inleds underhållsfasen. Fästningen sker vanligen 24 timmar efter att odlingen påbörjats. Cellerna bör subkultiveras när de har nått en viss konfluensprocent och aktivt replikerar. Eftersom postkonfluenta celler kan genomgå differentiering och uppvisa långsammare proliferation efter passage, är det bäst att subkultivera primära cellkulturer innan de når 100% konfluens.

Subkultur i färskt medium upprätthåller den exponentiella tillväxten av ankarberoende celler. Subkultur av monolager stör interaktioner mellan och inom cellytor. Låga koncentrationer av proteolytiska enzymer, t.ex. trypsin/EDTA, används för att extrahera adherenta primära celler från monolager eller vävnader. Efter dissociation och utspädning till en encellslösning räknas cellerna och överförs till nya odlingsbehållare för att åter fästa och föröka sig.

Kryopreservering och återvinning

Vid kryopreservering bevaras levande celler genom att de fryses vid låga temperaturer. Kryokonservering och upptining av humana primärceller förhindrar celldöd och skador under förvaring och användning. Primära celler från människa kryopreserveras med DMSO eller glycerol (vid rätt temperatur och med en kontrollerad frysningshastighet). Frysningsprocessen måste vara progressiv, med -1 °C varje minut, för att förhindra bildning av iskristaller. För långtidsförvaring krävs flytande kväve (-196 °C) eller temperaturer under -130 °C.

För att tina upp kryopreserverade celler räcker det att sänka ned frysta celler i ett 37 °C vattenbad i cirka 1-2 minuter. Primära celler från människa ska inte centrifugeras efter upptining ur frysen (eftersom de är extremt känsliga för skador under återhämtningen från kryokonservering). Det är lämpligt för plätering av celler omedelbart efter upptining och det främjar vidhäftning i kulturer under de första 24 timmarna efter plätering. 1 Efter att de kryopreserverade primära cellerna har fäst måste det förbrukade mediet avlägsnas (eftersom DMSO är skadligt för primära celler och kan orsaka en minskning av viabiliteten efter upptining).