Primaire menselijke cellen

Wat zijn menselijke primaire cellen?

Primaire cellen zijn de zuiverste representatie van hun respectievelijke weefsels. Ze worden geïsoleerd uit het weefsel en bewerkt zodat ze zich kunnen vestigen in een kweekomgeving met ideale omstandigheden. Ze bootsen de in vivo toestand beter na en vertonen een normale fysiologie omdat ze afkomstig zijn van weefsel in plaats van gemodificeerd. Hierdoor kunnen ze dienen als nuttige modellen voor onderzoek naar cellulaire farmacologie, toxicologie en fysiologie (inclusief studies van metabolisme, veroudering en signaaltransductie). Houd er rekening mee dat primaire cellen moeilijker te kweken en te onderhouden zijn dan een continue cellijn omdat ze een kortere levensduur hebben en zullen stoppen met delen (of verouderen) na een bepaald aantal celdelingen. Studies van celsignaleringspathways worden gecompliceerd door de inherente variabiliteit van primaire cellen verkregen van donoren en door subcultuurpraktijken. Voordat ze studies naar signalering starten, voeren onderzoekers vaak een screening uit om te bepalen of de cellen wel of niet reageren op veelgebruikte stimuli. Om tijd- en geldverspilling te voorkomen, kunnen primaire cellen gestimuleerd worden om de belangrijkste signaalwegen te activeren voordat ze gescreend worden.

Waarom menselijke primaire cellen gebruiken?

Geïmmortaliseerde cellijnen worden vaak gebruikt als celtest. Hoewel wetenschappers hebben erkend dat biologische veranderingen als gevolg van cellijnen schadelijk kunnen zijn bij het bestuderen van hun fysiologische betekenis. Het gebruik van humane primaire cellen verbetert de fysiologische waarde van gegevens die via celculturen zijn verkregen en ze worden steeds belangrijker geacht voor het bestuderen van biologische processen, ziekteverloop en de ontwikkeling van geneesmiddelen.

Menselijke primaire cellen worden op grote schaal gebruikt in in vitro studies naar intercellulaire en intracellulaire communicatie, ontwikkelingsbiologie en de mechanismen die ten grondslag liggen aan kanker, de ziekte van Parkinson en diabetes, naast vele andere preklinische en onderzoeksgebieden van biologisch onderzoek. Onderzoekers maken al lange tijd gebruik van geïmmortaliseerde cellijnen om de functie van weefsels te bestuderen; cellijnen met duidelijke mutaties en chromosomale afwijkingen zijn echter mogelijk geen goede surrogaten voor normale cellen en de ontwikkeling van ziekten in de vroege stadia. Een nauwkeuriger model van een specifiek weefselceltype kan nu worden bereikt door gebruik te maken van menselijke primaire cellen geïsoleerd uit dat weefsel en onderhouden in primaire celkweekmedia en supplementen.

Wat is primaire celkweek?

In plaats van geïmmortaliseerde cellijnen te gebruiken, worden bij primaire celkweek cellen rechtstreeks gekweekt uit een meercellig organisme buiten het lichaam. In sommige landen, zoals het Verenigd Koninkrijk, wordt wettelijk erkend dat primaire celculturen representatiever zijn voor in vivo weefsels dan cellijnen. Primaire cellen hebben echter het juiste substraat en de juiste voedingsstoffen nodig om te groeien en na een bepaald aantal delingen ontwikkelen ze een senescent fenotype waardoor ze definitief stoppen met delen. Deze twee factoren motiveren de creatie van cellijnen. Zowel natuurlijk geïmmortaliseerde primaire cellen (bijv. HeLa-cellen) als kunstmatig geïmmortaliseerde primaire cellen (bijv. HEK-cellen) kunnen voor onbepaalde tijd worden gekweekt in celkweek.

Menselijke primaire cellen per weefseltype

Epitheelcellen, fibroblasten, keratinocyten, melanocyten, endotheelcellen, spiercellen, immuuncellen en stamcellen zoals mesenchymale stamcellen behoren tot de meest gebruikte humane primaire cellen in wetenschappelijk onderzoek. Om te beginnen zijn de culturen heterogeen (ze vertegenwoordigen een mix van celtypen die in het weefsel aanwezig zijn) en kunnen ze slechts gedurende een bepaalde tijd in vitro in leven worden gehouden. Transformatie is een in vitro proces waarmee menselijke primaire cellen gemanipuleerd kunnen worden voor onbeperkte subculturen. Transformatie kan op natuurlijke wijze gebeuren of kan worden geïnduceerd door chemicaliën of virussen. Na het ondergaan van genetische transformatie kan een primaire cultuur zich oneindig delen in een geïmmortaliseerde secundaire cellijn als deze voldoende voedingsstoffen en ruimte krijgt.

Endotheelcellen

Behandeling van kanker, wondgenezing, onderzoek naar celsignalering, high-throughput en high-content screening en toxicologische screening zijn slechts enkele van de gebieden die baat kunnen hebben bij het gebruik van primaire endotheelcellen als onderzoeksinstrument.

Keratinocyten

Keratinocyten, afkomstig van de opperhuid van ofwel volwassen menselijke huid of neonatale voorhuid, spelen een cruciale rol in het onderzoek naar huidziekten zoals psoriasis en kanker.

Epitheelcellen

Van kankeronderzoek tot toxicologisch onderzoek, hebben primaire epitheelcellen bewezen van onschatbare waarde te zijn voor het modelleren van de natuurlijke afweer van het lichaam.

Fibroblasten

Het induceren van pluripotente stamcellen (iPS) en het bestuderen van wondgenezing zijn slechts enkele van de vele toepassingen van primaire fibroblasten.

Immuuncellen

Perifere bloedmononucleaire cellen, afgekort PBMC, zijn mononucleaire cellen van het bloed met een ronde celkern. Ze bestaan voornamelijk uit lymfocyten en monocyten, die belangrijke functies vervullen in de loop van een immuunrespons. Perifere bloedmononucleaire cellen worden vaak gebruikt om infecties vast te stellen of om mogelijke bescherming door vaccinatie te detecteren. Inzicht in de cellulaire immuunrespons gemedieerd door T-cellen is vaak cruciaal.

Melanocyten

Melanocyten, de gespecialiseerde huidcellen die het pigment melanine produceren, zijn nuttig als modellen voor onderzoek naar onderwerpen als wondgenezing, toxiciteit, melanoom, de reactie van de huid op ultraviolette (UV) straling, huidziekten en cosmetica.

Stamcellen

Stamcellen kunnen zich differentiëren in een groot aantal celtypen. Door hun differentiatievermogen bieden ze nieuwe mogelijkheden voor het modelleren van menselijk weefsel en gezondheidstoestanden.

Mesenchymale stamcellen

Mesenchymale stamcellen, ook bekend als MSC's, kunnen worden verkregen uit verschillende menselijke bronnen zoals beenmerg, vet (vetweefsel), navelstrengweefsel (Wharton's Jelly) en vruchtwater (het vocht rondom een foetus) en kunnen in vitro worden geëxpandeerd. Deze volwassen stromale stamcellen kunnen zich ontwikkelen tot een grote verscheidenheid aan celtypen. Enkele van deze celtypen zijn botcellen, kraakbeencellen, spiercellen, neurale cellen, huidcellen en hoornvliescellen.

Gladde spiercellen

In holle organen bekleden primaire gladde spiercellen (SMC's) het inwendige en zorgen voor de contractiliteit. Naast kanker en andere ziekten kunnen SMC's worden gebruikt om hypertensie fibrose te modelleren.

Primaire cellen en cellijnen

Ofwel door spontane mutatie, zoals bij getransformeerde kankercellijnen, ofwel door opzettelijke verandering, zoals bij de kunstmatige productie van kankergenen, hebben doorlopende cellijnen het vermogen gekregen om zich eindeloos te reproduceren (geïmmortaliseerd). In de regel zijn doorlopende cellijnen betrouwbaarder en handiger om mee te werken dan primaire cellen. Ze kunnen zich onbeperkt uitbreiden en bieden snelle toegang tot essentiële gegevens. Het gebruik van continue cellijnen heeft bepaalde beperkingen, waaronder het feit dat ze genetisch gemodificeerd/getransformeerd zijn, waardoor fysiologische kenmerken kunnen veranderen en niet overeenkomen met de in vivo toestand, en dat dit in de loop van de tijd nog verder kan veranderen met significante passaging.

Vooruitgang in primaire celkweek

Primaire cellen hebben de beruchte reputatie moeilijk te zijn om mee te werken. Het proces wordt echter eenvoudiger dan ooit tevoren dankzij ontwikkelingen in primaire celkweek, de beschikbaarheid van commerciële primaire cellen met volledig geoptimaliseerde protocollen en nieuwe analysetechnieken die minder input vereisen.

De verschuiving van tweedimensionale naar driedimensionale celkweek wordt gezien als een belangrijke mijlpaal op dit gebied. Weefselspecifieke architectuur, cel-cel interacties en mechanische/biochemische signalering kunnen worden verzwakt in een 2D cultuur. Er is dus een plafond aan de biologische waarde van deze culturen.

Aan de andere kant stelt een 3D celcultuur cellen in staat om uit te breiden en te interageren met een 3D extracellulair kader. Hierdoor kunnen cellen met elkaar en met de extracellulaire matrix interageren, waardoor 3D-culturen fysiologisch relevanter zijn. De nauwkeurigheid van deze methode bij het voorspellen van in vivo reacties heeft deze revolutionair gemaakt op gebieden zoals het ontdekken en ontwikkelen van medicijnen. Hierdoor bieden geavanceerde technologieën, zoals organoïden afkomstig van patiënten en organen-op-een-chip, zeer contextuele modellen voor het screenen en ontwikkelen van medicijnen.

Het genereren van primaire cellen is een knelpunt in primaire kweken. Om dit te ondervangen is meestal een groter volume weefsel nodig, wat een uitdaging kan zijn om te bereiken. Verbeterde analytische gevoeligheid biedt echter een oplossing. De noodzaak om grote hoeveelheden primaire cellen te kweken wordt bijvoorbeeld verminderd door gebruik te maken van single-cell technologie, waaronder sequentiebepaling, Western blotting en massa-cytometrie.

Veelbelovende vooruitzichten voor primaire celkweek

De algemene moeilijkheden van primaire celkweek worden verzacht door technologische vooruitgang. Op zijn beurt vervangt deze methode snel andere methoden als de gouden standaard in cellulaire en moleculaire biologiestudie en -praktijk. Vaccinproductie, orgaanvervanging, stamceltherapieën, kankeronderzoek en nog veel meer zullen sterk profiteren van de voortdurende vooruitgang in primaire celkweek.

Tips en trucs voor primaire celkweek

De behoeften van celexpansie

De twee meest gebruikte methoden voor het kweken van primaire cellen zijn in suspensie of op een oppervlak (2D). Sommige cellen kunnen vrij in de bloedbaan zweven zonder zich ooit aan een oppervlak te hechten (bijvoorbeeld cellen uit perifeer bloed). Verschillende cellijnen zijn ontwikkeld om te gedijen in suspensieculturen, waar ze dichtheden kunnen bereiken die onbereikbaar zijn onder 2D groeiomstandigheden. Primaire cellen die verankering nodig hebben om in vitro te groeien, worden adherente cellen genoemd en omvatten de cellen in vaste weefsels. Om de adhesie-eigenschappen te verbeteren en andere signalen te leveren die nodig zijn voor groei en differentiatie, worden deze cellen meestal gekweekt in een plat plastic vat zonder coating, maar soms ook in een microdrager. Deze laatste optie kan gecoat zijn met extracellulaire matrixproteïnen (zoals collageen en laminine). De media die in de celkweek worden gebruikt, bestaan uit een basismedium dat is aangevuld met de juiste groeifactoren en cytokinen. Een celbroedstoof is een speciaal type laboratoriumbroedstoof dat wordt gebruikt om cellen te kweken en te houden bij een specifieke temperatuur en gasmengsel (meestal 37 °C, 5% CO2 voor zoogdiercellen). Afhankelijk van het type cel dat gekweekt wordt, kunnen de optimale omstandigheden heel verschillend zijn. Afhankelijk van het type cellen dat gekweekt wordt, zal het optimale groeimedium een unieke combinatie van factoren hebben, inclusief maar niet beperkt tot pH, glucoseconcentratie, groeifactoren en de aanwezigheid van andere voedingsstoffen.

Antibiotica in het groeimedium zijn cruciaal tijdens het opzetten van de primaire kweek om besmetting door het gastheerweefsel te voorkomen. Sommige antibioticaregimes bestaan uit een combinatie van gentamicine, penicilline, streptomycine en amfotericine B. Het gebruik van antibiotica voor een langere periode wordt echter afgeraden, omdat sommige reagentia (zoals amfotericine B) op de lange termijn toxisch kunnen zijn voor de cellen.

De meeste primaire cellen gaan door senescentie en stoppen met delen na een bepaald aantal populatieverdubbelingen, waardoor het cruciaal is om ze in leven te houden na isolatie. Levensvatbaarheid van de cellen op lange termijn vereist deskundige celkweektechnieken en ideale kweekomstandigheden (waaronder het juiste medium, de juiste temperatuur, het juiste gasmengsel, de juiste pH, de juiste concentratie groeifactoren, de aanwezigheid van voedingsstoffen en de aanwezigheid van glucose). Aangezien veel van de groeifactoren die worden gebruikt om media aan te vullen worden verkregen uit dierlijk bloed (de van bloed afgeleide ingrediënten bezitten het potentieel voor besmetting), wordt het aanbevolen om het gebruik ervan te minimaliseren of helemaal te vermijden. Het is ook belangrijk om een aseptische techniek te gebruiken.

Subcultuur en onderhoud

Wanneer cellen in isolatie aan het oppervlak van het kweekschaaltje hechten, markeert dit het begin van de onderhoudsfase. Aanhechting vindt meestal plaats 24 uur na de start van de kweek. Cellen moeten gesubcultiveerd worden wanneer ze een bepaald confluentiepercentage bereikt hebben en actief aan het repliceren zijn. Aangezien post-confluente cellen differentiatie kunnen ondergaan en een tragere proliferatie vertonen na passage, is het het beste om primaire celkweken te subculturen voordat ze 100% confluentie bereiken.

Doorkweken in verse media handhaaft de exponentiële groei van ankerplaatsafhankelijke cellen. Het subkweken van monolagen verstoort inter- en intracellulaire celoppervlakinteracties. Lage concentraties proteolytische enzymen, zoals trypsine/EDTA, worden gebruikt om aanhangende primaire cellen uit monolagen of weefsels te extraheren. Nadat de cellen gedissocieerd en verdund zijn tot een eencellige oplossing, worden ze geteld en overgebracht naar verse kweekcontainers om zich opnieuw te hechten en te vermenigvuldigen.

Cryopreservatie en herstel

Cryopreservatie bewaart levende cellen door ze bij lage temperaturen in te vriezen. Cryopreserveren en ontdooien van humane primaire cellen voorkomt celdood en schade tijdens opslag en gebruik. Menselijke primaire cellen worden cryobeveiligd met DMSO of glycerol (bij de juiste temperatuur en met een gecontroleerde vriessnelheid). Het vriesproces moet progressief zijn, elke minuut -1 °C, om ijskristalvorming te voorkomen. Langdurige opslag vereist vloeibare stikstof (-196 °C) of temperaturen lager dan -130 °C.

Het onderdompelen van bevroren cellen in een waterbad van 37 °C gedurende ongeveer 1 tot 2 minuten is voldoende om gecryopreserveerde cellen te ontdooien. Menselijke primaire cellen mogen niet worden gecentrifugeerd nadat ze uit de vriezer zijn ontdooid (omdat ze extreem gevoelig zijn voor schade tijdens het herstel uit cryopreservatie). Het is geschikt voor het uitplaten van cellen onmiddellijk na het ontdooien, en het bevordert de hechting in culturen gedurende de eerste 24 uur na het uitplaten. 1 Nadat de gecryopreserveerde primaire cellen zijn aangehecht, moet de gebruikte media worden verwijderd (omdat DMSO schadelijk is voor primaire cellen en een daling van de levensvatbaarheid na ontdooien kan veroorzaken).