Primaire menselijke cellen

Wat zijn primaire menselijke cellen?

Primaire cellen zijn de zuiverste weergave van hun respectieve weefsels. Ze worden uit het weefsel geïsoleerd en zodanig bewerkt dat ze zich onder ideale omstandigheden in een kweekomgeving kunnen vestigen. Ze bootsen de in vivo-toestand beter na en vertonen een normale fysiologie, omdat ze afkomstig zijn uit weefsel en niet gemodificeerd zijn. Hierdoor kunnen ze dienen als nuttige modellen voor onderzoek naar cellulaire farmacologie, toxicologie en fysiologie (waaronder studies naar metabolisme, veroudering en signaaltransductie). Houd er rekening mee dat primaire cellen moeilijker te kweken en in stand te houden zijn dan een continue cellijn, omdat ze een kortere levensduur hebben en na een bepaald aantal celdelingen stoppen met delen (of verouderen). Onderzoek naar celsignaleringsroutes wordt bemoeilijkt door de inherente variabiliteit van primaire cellen die afkomstig zijn van donoren en door subcultuurpraktijken. Voordat onderzoekers beginnen met signaalonderzoek, voeren ze vaak een screening uit om te bepalen of de cellen al dan niet reageren op veelgebruikte stimuli. Om verspilling van tijd en geld te voorkomen, kunnen primaire cellen worden gestimuleerd om belangrijke signaalroutes te activeren voordat ze worden gescreend.

Waarom menselijke primaire cellen gebruiken?

Onsterfelijke cellijnen worden vaak gebruikt als celassay. Wetenschappers erkennen echter dat biologische veranderingen als gevolg van het gebruik van cellijnen schadelijk kunnen zijn voor het onderzoek naar de fysiologische betekenis ervan. Het gebruik van menselijke primaire cellen verhoogt de fysiologische waarde van gegevens die via celculturen worden verkregen, en deze cellen worden in toenemende mate beschouwd als belangrijk voor het bestuderen van biologische processen, het verloop van ziekten en de ontwikkeling van geneesmiddelen.

Menselijke primaire cellen worden op grote schaal gebruikt in in-vitro-onderzoek naar intercellulaire en intracellulaire communicatie, ontwikkelingsbiologie en de mechanismen die ten grondslag liggen aan kanker, de ziekte van Parkinson en diabetes, naast vele andere preklinische en onderzoekgerichte biologische onderzoeksgebieden. Onderzoekers maken al lang gebruik van geïmmortaliseerde cellijnen om weefselfuncties te bestuderen; cellijnen met duidelijke mutaties en chromosomale afwijkingen zijn echter mogelijk geen goede vervanging voor normale cellen en het ziekteverloop in de vroege stadia. Een nauwkeuriger model van een specifiek weefselceltype kan nu worden verkregen door gebruik te maken van menselijke primaire cellen die uit dat weefsel zijn geïsoleerd en worden gekweekt in kweekmedia en supplementen voor primaire cellen.

Wat is primaire celkweek?

In plaats van onsterfelijke cellijnen te gebruiken, worden bij primaire celcultuur cellen rechtstreeks uit een meercellig organisme buiten het lichaam gekweekt. In sommige landen, zoals het Verenigd Koninkrijk, wordt wettelijk erkend dat primaire celculturen representatiever zijn voor in vivo weefsels dan cellijnen. Niettemin hebben primaire cellen het juiste substraat en de juiste voedingsstoffen nodig om te groeien, en na een bepaald aantal delingen ontwikkelen ze een senescent fenotype waardoor ze definitief stoppen met delen. Deze twee factoren vormen de drijfveer voor het creëren van cellijnen. Zowel natuurlijk onsterfelijk gemaakte primaire cellen (bijv. HeLa-cellen) als kunstmatig onsterfelijk gemaakte primaire cellen (bijv. HEK-cellen) kunnen voor onbepaalde tijd in celcultuur worden gekweekt.

Menselijke primaire cellen per weefseltype

Epitheelcellen, fibroblasten, keratinocyten, melanocyten, endotheelcellen, spiercellen, immuuncellen en stamcellen zoals mesenchymale stamcellen behoren tot de meest gebruikte menselijke primaire cellen in wetenschappelijk onderzoek. Om te beginnen zijn de culturen heterogeen (ze vertegenwoordigen een mix van celtypen die in het weefsel aanwezig zijn) en kunnen ze in vitro slechts gedurende een bepaalde tijd in leven worden gehouden. Transformatie is een in-vitroproces waarmee menselijke primaire cellen zodanig kunnen worden gemanipuleerd dat onbeperkte subculturen mogelijk zijn. Transformatie kan op natuurlijke wijze plaatsvinden, of worden geïnduceerd door chemicaliën of virussen. Na genetische transformatie kan een primaire kweek zich oneindig blijven delen tot een onsterfelijke secundaire cellijn, mits er voldoende voedingsstoffen en ruimte beschikbaar zijn.

Endotheelcellen

Kankerbehandeling, wondgenezing, onderzoek naar celsignalering, high-throughput- en high-content-screening en toxicologische screening zijn slechts enkele van de gebieden die baat kunnen hebben bij het gebruik van primaire endotheelcellen als onderzoeksinstrument.

Keratinocyten

Keratinocyten, afkomstig uit de opperhuid van de volwassen menselijke huid of de voorhuid van pasgeborenen, spelen een cruciale rol bij het onderzoek naar huidaandoeningen zoals psoriasis en kanker.

Epitheelcellen

Van kankeronderzoek tot toxicologisch onderzoek: primaire epitheelcellen zijn van onschatbare waarde gebleken voor het modelleren van de natuurlijke afweer van het lichaam.

Fibroblasten

Het induceren van pluripotente stamcellen (iPS-cellen) en het bestuderen van wondgenezing zijn slechts enkele van de vele toepassingen van primaire fibroblasten.

Immuuncellen

Perifere mononucleaire bloedcellen, kortweg PBMC's, zijn mononucleaire bloedcellen met een ronde celkern. Ze bestaan voornamelijk uit lymfocyten en monocyten, die belangrijke functies vervullen tijdens een immuunrespons. Mononucleaire cellen uit perifeer bloed worden vaak gebruikt om infecties te diagnosticeren of om mogelijke bescherming door vaccinatie vast te stellen. Inzicht in de cellulaire immuunrespons, gemedieerd door T-cellen, is vaak van cruciaal belang.

Melanocyten

Melanocyten, de gespecialiseerde huidcellen die het pigment melanine produceren, zijn nuttig als modellen voor onderzoek naar onderwerpen zoals wondgenezing, toxiciteit, melanoom, de reactie van de huid op ultraviolette (UV) straling, huidaandoeningen en cosmetica.

Stamcellen

Stamcellen hebben het vermogen om zich te differentiëren tot een breed scala aan celtypen. Dankzij dit differentiatievermogen bieden ze nieuwe mogelijkheden voor het modelleren van menselijk weefsel en gezondheidstoestanden.

Mesenchymale stamcellen

Mesenchymale stamcellen, ook wel MSC's genoemd, kunnen worden verkregen uit verschillende menselijke bronnen, zoals beenmerg, vet (adipose weefsel), navelstrengweefsel (Wharton's Jelly) en vruchtwater (de vloeistof rondom de foetus), en kunnen in vitro worden vermeerderd. Deze volwassen stromale stamcellen hebben het vermogen om zich te ontwikkelen tot een breed scala aan celtypen. Enkele van deze celtypen zijn botcellen, kraakbeencellen, spiercellen, zenuwcellen, huidcellen en hoornvliescellen.

Gladde spiercellen

In holle organen bekleden primaire gladde spiercellen (SMC's) de binnenwand en zorgen ze voor de contractiliteit. Naast kanker en andere ziekten kunnen SMC's worden gebruikt om hypertensie en fibrose te modelleren.

Primaire cellen en cellijnen

Hetzij door spontane mutatie, zoals bij getransformeerde kankercellijnen, hetzij door opzettelijke verandering, zoals bij de kunstmatige productie van kankergenen, hebben continue cellijnen het vermogen verworven om zich eindeloos te vermenigvuldigen (vereeuwigd). In de regel zijn continue cellijnen betrouwbaarder en gemakkelijker te hanteren dan primaire cellen. Ze kunnen zich oneindig uitbreiden en bieden snelle toegang tot essentiële gegevens. Het gebruik van continue cellijnen kent bepaalde beperkingen, waaronder het feit dat ze genetisch gemodificeerd/getransformeerd zijn, waardoor fysiologische kenmerken kunnen veranderen en ze mogelijk niet overeenkomen met de in vivo-toestand, en dat dit in de loop van de tijd door veelvuldig passeren verder kan veranderen.

Vooruitgang in de kweek van primaire cellen

Primaire cellen staan erom bekend dat ze moeilijk te hanteren zijn. Het proces wordt echter eenvoudiger dan ooit tevoren dankzij ontwikkelingen in de primaire celkweek, de beschikbaarheid van commerciële primaire cellen met volledig geoptimaliseerde protocollen en nieuwe analysetechnieken die minder inspanning vergen.

De overgang van tweedimensionale naar driedimensionale celkweek wordt beschouwd als een belangrijke mijlpaal op dit gebied. Weefselspecifieke architectuur, cel-celinteracties en mechanische/biochemische signalering kunnen in een 2D-kweek verzwakt zijn. Daardoor is er een limiet aan de biologische waarde van deze kweken.

Aan de andere kant stelt 3D-celkweek cellen in staat zich uit te breiden en te interageren met een 3D-extracellulair raamwerk. Hierdoor kunnen cellen met elkaar en met de extracellulaire matrix interageren, waardoor 3D-culturen fysiologisch relevanter zijn. De nauwkeurigheid van deze methode bij het voorspellen van in vivo reacties heeft ervoor gezorgd dat deze een revolutie teweeg heeft gebracht in vakgebieden zoals het ontdekken en ontwikkelen van geneesmiddelen. Hierdoor bieden geavanceerde technologieën, zoals organoïden afkomstig van patiënten en ‘organs-on-a-chip’, zeer contextuele modellen voor het screenen en ontwikkelen van geneesmiddelen.

Het genereren van primaire cellen vormt een knelpunt in de primaire kweek. Om dit te ondervangen is doorgaans een grotere hoeveelheid weefsel nodig, wat lastig te verkrijgen kan zijn. Verbeterde analytische gevoeligheid biedt echter een uitweg. Zo wordt de noodzaak om grote hoeveelheden primaire cellen te kweken verminderd door het gebruik van single-cell-technologie, waaronder sequentiebepaling, western blotting en massacyto-metrie.

Veelbelovende vooruitzichten voor primaire celkweek

De algemene moeilijkheden bij primaire celkweek worden verzacht door technologische vooruitgang. Deze methode vervangt op haar beurt in hoog tempo andere methoden als de gouden standaard in onderzoek en praktijk op het gebied van cellulaire en moleculaire biologie. Vaccinproductie, orgaanvervanging, stamceltherapieën, kankeronderzoek en nog veel meer zullen naar verwachting enorm profiteren van de voortdurende vooruitgang in de primaire celkweek.

Tips en trucs voor primaire celcultuur

De behoeften van celvermeerdering

De twee meest gangbare methoden voor het kweken van primaire cellen zijn in suspensie of op een oppervlak (2D). Sommige cellen kunnen vrij in de bloedbaan zweven zonder zich ooit aan een oppervlak te hechten (bijvoorbeeld cellen afkomstig uit perifeer bloed). Er zijn verschillende cellijnen ontwikkeld die goed gedijen in suspensieculturen, waar ze dichtheden kunnen bereiken die onder 2D-groeiomstandigheden onbereikbaar zijn. Primaire cellen die verankering nodig hebben om in vitro te groeien, worden hechtende cellen genoemd en omvatten onder meer cellen die in solide weefsels voorkomen. Om de hechtingseigenschappen te verbeteren en andere signalen te leveren die nodig zijn voor groei en differentiatie, worden deze cellen doorgaans gekweekt in een vlak, ongecoat plastic vat, maar soms ook op een microdrager. Deze laatste optie kan worden gecoat met extracellulaire matrixeiwitten (zoals collageen en laminine). Het medium dat in de celkweek wordt gebruikt, bestaat uit een basismedium dat is aangevuld met de juiste groeifactoren en cytokines. Een celincubator is een speciaal type laboratoriumincubator dat wordt gebruikt om cellen te kweken en in stand te houden bij een specifieke temperatuur en een specifiek gasmengsel (doorgaans 37 °C, 5% CO₂ voor zoogdiercellen). Afhankelijk van het type cel dat wordt gekweekt, kunnen de optimale omstandigheden sterk verschillen. Afhankelijk van de soorten cellen die worden gekweekt, zal het optimale groeimedium een unieke combinatie van factoren bevatten, waaronder, maar niet beperkt tot, pH, glucoseconcentratie, groeifactoren en de aanwezigheid van andere voedingsstoffen.

Antibiotica in het groeimedium zijn cruciaal tijdens het opzetten van een primaire kweek om besmetting vanuit het gastheerweefsel te voorkomen. Sommige antibioticaregimes bestaan uit een combinatie van gentamicine, penicilline, streptomycine en amfotericine B. Het gebruik van antibiotica gedurende een langere periode wordt echter afgeraden, omdat sommige middelen (zoals amfotericine B) op de lange termijn toxisch kunnen zijn voor cellen.

De meeste primaire cellen ondergaan senescentie en stoppen met delen na een bepaald aantal populatieverdubbelingen, waardoor het cruciaal is om ze na isolatie in leven te houden. Voor celviabiliteit op lange termijn zijn deskundige celkweektechnieken en ideale kweekomstandigheden vereist (waaronder het juiste medium, de juiste temperatuur, het juiste gasmengsel, de juiste pH, de juiste concentratie groeifactoren, de aanwezigheid van voedingsstoffen en de aanwezigheid van glucose). Aangezien veel van de groeifactoren die worden gebruikt om media aan te vullen, worden verkregen uit dierlijk bloed (de uit bloed afkomstige ingrediënten kunnen mogelijk besmettingsbronnen zijn), wordt aanbevolen het gebruik ervan tot een minimum te beperken of helemaal te vermijden. Het is ook belangrijk om een aseptische techniek te gebruiken.

Subcultuur en onderhoud

Wanneer geïsoleerde cellen zich hechten aan het oppervlak van de kweekschaal, markeert dit het begin van de onderhoudsfase. Hechting vindt doorgaans 24 uur na het starten van de kweek plaats. Cellen moeten worden overgeplant wanneer ze een bepaald confluentiepercentage hebben bereikt en zich actief vermenigvuldigen. Aangezien post-confluente cellen differentiatie kunnen ondergaan en na passage een tragere proliferatie vertonen, is het het beste om primaire celculturen over te planten voordat ze 100% confluentie bereiken.

Subcultivering in vers medium handhaaft de exponentiële groei van aanhechtingsafhankelijke cellen. Het subcultiveren van monolaagjes verstoort de inter- en intracellulaire interacties aan het celoppervlak. Er worden lage concentraties proteolytische enzymen, zoals trypsine/EDTA, gebruikt om aanhechtende primaire cellen uit monolaagjes of weefsels te extraheren. Nadat de cellen zijn gedissocieerd en verdund tot een oplossing van afzonderlijke cellen, worden ze geteld en overgebracht naar verse kweekrecipiënten om zich opnieuw te hechten en te vermenigvuldigen.

Cryopreservatie en herstel

Cryopreservatie conserveert levende cellen door ze bij lage temperaturen in te vriezen. Het cryopreserveren en ontdooien van menselijke primaire cellen voorkomt celdood en schade tijdens opslag en gebruik. Menselijke primaire cellen worden cryoprotectief behandeld met DMSO of glycerol (bij de juiste temperatuur en met een gecontroleerde invriessnelheid). Het invriesproces moet geleidelijk verlopen, met een afkoeling van -1 °C per minuut, om de vorming van ijskristallen te voorkomen. Voor langdurige opslag is vloeibare stikstof (-196 °C) of temperaturen onder -130 °C vereist.

Het onderdompelen van bevroren cellen in een waterbad van 37 °C gedurende ongeveer 1 tot 2 minuten is voldoende om cryogepreserveerde cellen te ontdooien. Menselijke primaire cellen mogen na het ontdooien uit de vriezer niet worden gecentrifugeerd (aangezien ze uiterst gevoelig zijn voor beschadiging tijdens het herstel na cryopreservatie). Het is geschikt om cellen direct na het ontdooien uit te platen, en het bevordert de hechting in kweek tijdens de eerste 24 uur na het uitplaten. 1 Nadat de cryogepreserveerde primaire cellen zich hebben gehecht, moet het gebruikte medium worden verwijderd (aangezien DMSO schadelijk is voor primaire cellen en een daling van de levensvatbaarheid na het ontdooien kan veroorzaken).