Celkweekmedia: een overzicht

Op het gebied van de levenswetenschappen is celkweek een van de belangrijkste methoden. Onder de term 'celkweek' wordt verstaan: het verwijderen van cellen, weefsels of organen uit een dier of plant en het vervolgens implanteren van die cellen, weefsels of organen in een kunstmatige omgeving die gunstig is voor hun overleving en/of groei. De fundamentele omgevingsvereisten voor een optimale celontwikkeling zijn een geregelde temperatuur, een substraat waaraan de cellen zich kunnen hechten, een geschikt groeimedium en een incubator die de optimale pH-waarde en osmolaliteit handhaaft. Cellen hebben deze omstandigheden nodig om zich optimaal te kunnen ontwikkelen.

De keuze van een geschikt groeimedium voor in-vitro-kweek is de fase in de celkweek die zowel het meest cruciaal als het meest essentieel is. Een groeimedium, ook wel kweekmedium genoemd, is een vloeistof of gel die is samengesteld om de ontwikkeling van organismen op microscopisch, cellulair of plantachtig niveau te bevorderen. Het medium dat wordt gebruikt voor het kweken van cellen bevat vaak een voldoende voorraad energie en stoffen die de celcyclus regelen. De belangrijkste bestanddelen van een kweekmedium zijn onder meer aminozuren, vitamines, anorganische zouten, glucose en serum. Het serum wordt aan het medium toegevoegd omdat het fungeert als bron van groeifactoren, hormonen en hechtingsfactoren. Naast het leveren van voedingsstoffen draagt het medium ook bij aan het handhaven van de pH- en osmolaliteitsniveaus.

Soorten media die worden gebruikt in celcultuur

Zowel menselijke als dierlijke cellen kunnen worden gekweekt in een kunstmatig of synthetisch medium, of in een volledig natuurlijk medium dat is aangevuld met natuurlijke elementen. Hieronder geven we u een overzicht van de verschillende momenteel beschikbare mediatypen.

Natuurlijke media

In natuurlijke media komen uitsluitend biologische vloeistoffen voor die in hun natuurlijke staat voorkomen. Natuurlijke media zijn zeer geschikt en eenvoudig te gebruiken voor de kweek van een breed scala aan dierlijke celtypen. Het gebrek aan inzicht in de precieze samenstelling van natuurlijke media is de belangrijkste factor die bijdraagt aan de lage herhaalbaarheid van resultaten die met natuurlijke media worden verkregen.

Kunstmatige media

Bij de bereiding van kunstmatige of synthetische media worden voedingsstoffen (zowel organische als anorganische), serumproteïnen, koolhydraten, cofactoren, vitamines en zouten toegevoegd, evenals O₂- en CO₂-gasfasen [1].

Er zijn verschillende soorten kunstmatige media ontwikkeld om aan een of meer van de volgende functies te voldoen: 1) Onmiddellijke overleving (een uitgebalanceerde zoutoplossing met een nauwkeurige pH-waarde en osmotische druk). 2) Langdurige overleving (een uitgebalanceerde zoutoplossing aangevuld met verschillende samenstellingen van organische chemicaliën en/of serum). 3) Onbeperkte ontwikkeling. 4) Gespecialiseerde functies.

Er zijn vier verschillende classificaties voor kunstmatige media:

Media die serum bevatten

Het meest voorkomende supplement in media voor de kweek van dierlijke cellen is foetaal runderserum. Dit wordt als goedkoop supplement aan het kweekmedium toegevoegd om de best mogelijke groeiomstandigheden te bereiken. Het serum fungeert niet alleen als drager of chelaatvormer voor voedingsstoffen die onstabiel of niet in water oplosbaar zijn, hormonen en groeifactoren, proteaseremmers en andere stoffen, maar bindt en neutraliseert ook schadelijke moleculen.

Serumvrij medium

De aanwezigheid van serum in het medium heeft een aantal nadelen en kan leiden tot ernstige interpretatiefouten in immunologisch onderzoek [2, 3]. Er zijn diverse serumvrije media ontwikkeld [4, 5]. Deze media zijn over het algemeen specifiek samengesteld om de kweek van één bepaald celtype te ondersteunen, zoals Knockout Serum Replacement en Knockout DMEM van Thermo Fisher Scientific, en mTESR-medium van Stem Cell Technologies [6], voor stamcellen [7].

Bovendien bevatten deze media vastgestelde hoeveelheden gezuiverde groeifactoren, lipoproteïnen en andere eiwitten, die anders doorgaans door het serum worden geleverd [8]. Deze media worden vaak „gedefinieerde kweekmedia“ genoemd, aangezien de componenten waaruit deze media bestaan goed bekend zijn.

Chemisch gedefinieerde media

Deze media bevatten ultrazuivere anorganische en organische componenten die niet door enige vorm van verontreiniging zijn aangetast. Ze kunnen ook toevoegingen van zuivere eiwitten bevatten, zoals groeifactoren.

 De genetische modificatie van bacteriën of gist, in combinatie met de toevoeging van bepaalde vetzuren, vitamines, cholesterol en aminozuren, leidt tot de productie van hun samenstellende delen [9].

Eiwitvrije media

Eiwitvrije media zijn media die helemaal geen eiwitten bevatten, maar uitsluitend niet-eiwitelementen. In vergelijking met media waaraan serum is toegevoegd, bevordert het gebruik van media zonder toegevoegde eiwitten een grotere celproliferatie en eiwitexpressie en maakt het het zuiveren van producten die in een downstream-proces worden gegenereerd eenvoudiger [10-12]. Eiwit is niet opgenomen in formuleringen zoals MEM en RPMI-1640. Indien nodig kan echter een eiwitsupplement worden toegediend.

Kweekmedia en hun basiscomponenten

Commercieel kweekmedium is verkrijgbaar in poeder- of vloeibare vorm en bevat vaak diverse voedingsstoffen, zoals aminozuren, glucose, zouten, vitamines en andere voedingssupplementen. 

De behoefte aan deze componenten verschilt per cellijn, en deze variaties zijn verantwoordelijk voor het grote aantal verschillende samenstellingen van media. Elke component vervult een bepaalde functie, die in de volgende paragrafen wordt beschreven:

Buffersystemen

Om optimale groeiomstandigheden te handhaven, moet de pH worden geregeld, wat vaak gebeurt door middel van een van de twee volgende buffersystemen:

Natuurlijk buffersysteem

De CO₂/H₂CO₃-verhouding in de atmosfeer is gelijk aan die van het medium, waardoor een natuurlijk buffermechanisme ontstaat. Om dit natuurlijke buffermechanisme te behouden, moeten culturen worden gehouden in een luchtomgeving met 5-10% CO₂, wat vaak wordt bereikt door gebruik te maken van een CO₂-incubator. Een van de grootste voordelen van het gebruik van een natuurlijke buffer is dat deze goedkoop en veilig is.

HEPES

Chemische buffering met behulp van het zwitterion HEPES heeft een groter bufferend vermogen in het pH-bereik van 7,2–7,4 en vereist geen gereguleerde gasomgeving. Voor bepaalde celtypen kan een hogere dosis HEPES schadelijk zijn. Media die HEPES bevatten, zijn eveneens veel gevoeliger voor de fototoxische effecten van fluorescentielicht [13].

Fenolrood

De pH-indicator fenolrood wordt vaak toegevoegd aan in de handel verkrijgbare kweekmedia, waardoor de pH continu kan worden gecontroleerd. Naarmate de cellen zich vermenigvuldigen, veroorzaken de door deze cellen geproduceerde metabolieten een verschuiving in de pH en daarmee een kleurverandering van het medium. Fenolrood heeft een dubbel effect op de kleur van het medium: bij een zure pH kleurt het geel en bij een basische pH paars. Bij een pH van 7,4 – de optimale waarde voor celkweek – krijgt het medium een fluorescerende rode kleur.

Maar fenolrood heeft enkele nadelen: ten eerste kan fenolrood de werking van een aantal steroïde hormonen nabootsen, met name oestrogeen [14]. Daarom wordt bij het bestuderen van oestrogeengevoelige cellen, zoals borstweefsel, een medium zonder fenolrood aanbevolen. De natrium-kaliumbalans wordt in verschillende serumvrije formuleringen verstoord door de aanwezigheid van fenolrood. Het toevoegen van serum of runderhypofysehormoon aan de media kan dit effect tegengaan [15]. Ten derde wordt de detectie bij flowcytometrische experimenten belemmerd door de aanwezigheid van fenolrood.

Anorganische zouten

Media die anorganische zouten bevatten, zoals natrium-, kalium- en calciumionen, helpen bij het handhaven van het osmotisch evenwicht en het reguleren van de membraanpotentiaal.

Aminozuren

Aangezien aminozuren de fundamentele bouwstenen van eiwitten zijn, vormen ze een essentieel onderdeel van elk celgroeimedium dat ooit is ontwikkeld. Omdat cellen bepaalde aminozuren niet zelf kunnen aanmaken, is het belangrijk dat het kweekmedium essentiële aminozuren bevat. Ze zijn noodzakelijk voor de celproliferatie, en de concentratie waarin ze aanwezig zijn, bepaalt de maximale celdichtheid die kan worden bereikt. Met name L-glutamine, een essentieel aminozuur, is van cruciaal belang.

L-glutamine fungeert als een secundaire energiebron voor het metabolisme en levert stikstof voor de productie van NAD, NADPH en nucleotiden. Aangezien L-glutamine een onstabiel aminozuur is dat na verloop van tijd verandert in een vorm die cellen niet kunnen benutten, moet het aan het medium worden toegevoegd.

Daarnaast kunnen niet-essentiële aminozuren aan het medium worden toegevoegd om de aminozuren aan te vullen die tijdens het groeiproces zijn verbruikt. De groei van de cellen wordt gestimuleerd en hun levensvatbaarheid neemt toe wanneer het groeimedium wordt aangevuld met niet-essentiële aminozuren.

Koolhydraten

Koolhydraten in de vorm van suikers vormen de belangrijkste energiebron. Veel media bevatten naast de meer gangbare suikers glucose en galactose ook maltose en fructose.

Eiwitten en peptiden

Albumine, transferrine en fibronectine zijn de meest gebruikte eiwitten en peptiden. Ze zijn vooral van belang in media die geen serum bevatten. Albumine, transferrine, aprotinine, fetuine en fibronectine zijn enkele van de eiwitten die in serum kunnen worden aangetroffen, dat een rijke bron van eiwitten is.

Albumine is het belangrijkste eiwit in het bloed en heeft als functie het binden en transporteren van diverse stoffen, waaronder water, zouten, vrije vetzuren, hormonen en vitamines, tussen verschillende organen en cellen. Het vermogen van albumine om zich aan chemische stoffen te binden, maakt het een geschikte kandidaat voor het verwijderen van schadelijke verbindingen uit het medium waarin cellen worden gekweekt.

Aprotinine is een beschermend middel in celkweeksystemen, aangezien het stabiel is bij een neutrale en zure pH, en bovendien bestand is tegen hoge temperaturen en de afbraak die kan worden veroorzaakt door proteolytische enzymen. Het is in staat om een aantal serineproteasen te remmen, waaronder onder andere trypsine.

Fetuïne is een glycoproteïne dat in hogere concentraties kan worden aangetroffen in het serum van foetale en pasgeboren dieren in vergelijking met serum van volwassen dieren. Daarnaast fungeert het als een serineproteaseremmer. Het eiwit fibronectine is een essentieel onderdeel van het proces van celadhesie. Transferrine is een eiwit dat ijzer transporteert en verantwoordelijk is voor de afgifte van ijzer aan de celmembranen.

Vetzuren en lipiden

Ze spelen een cruciale rol in serumvrij medium wanneer er geen serum aanwezig is.

Vitaminen

Talrijke vitamines zijn noodzakelijk voor de celontwikkeling en -proliferatie. Vitamines kunnen niet in voldoende hoeveelheden door cellen worden aangemaakt en zijn daarom in weefselcultuur onmisbaar als voedingssupplementen.

In celcultuur is serum de belangrijkste bron van vitamines; media worden echter ook verrijkt met diverse vitamines om ze geschikt te maken voor een specifiek celtype. Meestal worden de vitamines uit de B-groep gebruikt om de celgroei te stimuleren.

Sporenelementen

Chemische elementen zoals koper, zink, selenium en tricarbonzuur-tussenproducten staan bekend als sporenelementen. Sporenelementen worden vaak toegevoegd aan media die geen serum bevatten, ter vervanging van de elementen die doorgaans in serum aanwezig zijn. Deze elementen zijn belangrijke chemische componenten die nodig zijn voor een gezonde celontwikkeling. Veel biochemische reacties zijn afhankelijk van bepaalde micronutriënten, zoals enzymactiviteit.

Mediumsupplementen

Het volledige groeimedium dat voor bepaalde cellijnen wordt aanbevolen, heeft extra componenten nodig die ontbreken in de basismedia en het serum. Deze voedingssupplementen ondersteunen de celgroei en een goede stofwisseling.

Hoewel hormonen, groeifactoren en signaalmoleculen essentieel zijn voor de juiste proliferatie van bepaalde cellijnen, moeten altijd de volgende voorzorgsmaatregelen worden genomen: Aangezien de toevoeging van supplementen de osmolaliteit van het volledige groeimedium kan veranderen, wat de celontwikkeling kan remmen, is het altijd raadzaam om de osmolaliteit te controleren na het toevoegen van supplementen. Voor de meeste cellijnen ligt de optimale osmolaliteit tussen 260 en 320 mOSM/kg.

Antibiotica

Antibiotica worden vaak ingezet om de groei van bacteriële en schimmelverontreinigingen te remmen [16], hoewel ze niet essentieel zijn voor de celgroei. Aangezien antibiotica besmetting met mycoplasma en resistente bacteriën kunnen maskeren, wordt routinematig gebruik ervan bij celculturen afgeraden [17, 18].

Bovendien kunnen antibiotica het metabolisme van overgevoelige cellen verstoren. De penicilline-streptomycine-combinaties van MilliporeSigma en Life Technologies worden vaak gebruikt. Plasmocin is gebruikt bij de kweek van de glioomcellijnen TS603, TS516 en BT260 [19], en is effectief gebleken bij het verwijderen van mycoplasma-besmetting (20).

Serum

Albumine, groeifactoren en groeiremmers zijn allemaal aanwezig in serum. Serum is een van de belangrijkste componenten van celkweekmedium omdat het aminozuren, eiwitten, vitamines (met name in vet oplosbare vitamines zoals A, D, E en K), koolhydraten, lipiden, hormonen, groeifactoren, mineralen en sporenelementen levert.

Serum afkomstig van foetussen en kalveren wordt vaak gebruikt om de ontwikkeling van gekweekte cellen te bevorderen. Foetaal serum is een rijke bron van groeifactoren en is geschikt voor het klonen van cellen en de ontwikkeling van gevoelige cellen. Vanwege zijn verminderde groeibevorderende eigenschappen wordt kalfsserum gebruikt in contactinhibitie-experimenten. Normale kweekmedia bevatten vaak 2% tot 10% serum. De toevoeging van serum aan kweekmedium dient de volgende doelen [21]:

• Het serum levert de essentiële voedingsstoffen voor cellen (zowel in oplossing als gebonden aan eiwitten).

• Serum bevat verschillende groeifactoren en hormonen die betrokken zijn bij groeibevordering en gespecialiseerde celactiviteit.

• Het biedt talrijke bindende eiwitten, zoals albumine en transferrine, die andere stoffen naar de cel transporteren. Albumine brengt bijvoorbeeld vetten, vitamines, hormonen enz. naar de cellen.

• Het levert ook eiwitten, zoals fibronectine, die de celhechting aan het substraat vergroten. Daarnaast produceert het spreidingselementen die helpen bij de celuitbreiding vóór de deling.

• Het levert proteaseremmers die proteolyse in cellen voorkomen.

• Het bevat ook mineralen zoals Na+, K+, Zn2+ en Fe2+.

• Het verhoogt de viscositeit van het medium, waardoor de cellen worden beschermd tegen mechanische beschadiging tijdens het roeren van de suspensiecultuur.

• Het fungeert tevens als buffer.

Referenties

[1] Morgan J, Morton H, Parker R. Voeding van dierlijke cellen in weefselkweek; eerste onderzoeken naar een synthetisch medium. Proc Soc Exp Biol Med. 1950;73:1-8

[2] Kerbel R, Blakeslee D. Snelle adsorptie van een component van foetaal kalfsserum door zoogdiercellen in kweek. Een mogelijke bron van artefacten in onderzoeken naar antiserum tegen celspecifieke antigenen. Immunology. 1976;31:881-91

[3] Sula K, Draber P, Nouza K. Toevoeging van serum aan het medium dat wordt gebruikt voor de bereiding van celsuspensies als mogelijke bron van artefacten bij celgemedieerde reacties, onderzocht met behulp van de popliteale lymfeklierproef. J Immunogenet. 1980;7:483-9

[4] Mariani E, Mariani A, Monaco M, Lalli E, Vitale M, Facchini A. Commerciële serumvrije media: groei van hybridomen en productie van monoklonale antilichamen. J Immunol Methods. 1991;145:175-83

[5] Barnes D, Sato G. Methoden voor de kweek van gekweekte cellen in serumvrij medium. Anal Biochem. 1980;102:255-70

[6] Yu H, Lu S, Gasior K, Singh D, Vazquez Sanchez S, Tapia O, et al. HSP70 begeleidt RNA-vrij TDP-43 naar anisotrope intranucleaire vloeibare bolvormige schillen. Science. 2021;371:

[7] Meharena H, Marco A, Dileep V, Lockshin E, Akatsu G, Mullahoo J, et al. Door het Down-syndroom geïnduceerde senescentie verstoort de nucleaire architectuur van neurale voorlopercellen. Cell Stem Cell. 2022;29:116-130.e7

[8] Iscove N, Melchers F. Volledige vervanging van serum door albumine, transferrine en sojalipiden in culturen van lipopolysaccharide-reactieve B-lymfocyten. J Exp Med. 1978;147:923-33

[9] Stoll T, Muhlethaler K, von Stockar U, Marison I. Systematische verbetering van een chemisch gedefinieerd eiwitvrij medium voor de groei van hybridomen en de productie van monoklonale antilichamen. J Biotechnol. 1996;45:111-23

[10] Darfler F. Een eiwitvrij medium voor de groei van hybridomen en andere cellen van het immuunsysteem. In Vitro Cell Dev Biol. 1990;26:769-78

[11] Barnes D, Sato G. Serumvrije celkweek: een uniforme aanpak. Cell. 1980;22:649-55

[12] Hamilton W, Ham R. Klonale groei van Chinese hamstercellijnen in eiwitvrije media. In Vitro. 1977;13:537-47

[13] Zigler J, Lepe Zuniga J, Vistica B, Gery I. Analyse van de cytotoxische effecten van aan licht blootgesteld HEPES-bevattend kweekmedium. In Vitro Cell Dev Biol. 1985;21:282-7

[14] Berthois Y, Katzenellenbogen J, Katzenellenbogen B. Fenolrood in weefselkweekmedia is een zwak oestrogeen: implicaties voor het onderzoek naar oestrogeen-responsieve cellen in kweek. Proc Natl Acad Sci U S A. 1986;83:2496-500

[15] Karmiol S. Ontwikkeling van serumvrije media. In: Master JRW, red. Animal Cell culture, 3e druk. Oxford: Oxford University Press; 2000.

[16] Perlman D. Het gebruik van antibiotica in celkweekmedia. Methods Enzymol. 1979;58:110-6

[17] McGarrity G. Verspreiding en bestrijding van mycoplasma-infecties in celculturen. In Vitro. 1976;12:643-8

[18] Masters J, Stacey G. Het verversen van medium en het passeren van cellijnen. Nat Protoc. 2007;2:2276-84

[19] Chakraborty A, Laukka T, Myllykoski M, Ringel A, Booker M, Tolstorukov M, et al. Histon-demethylase KDM6A detecteert zuurstof direct om het chromatine en het lot van de cel te regelen. Science. 2019;363:1217-1222

[20] Molla Kazemiha V, Azari S, Amanzadeh A, Bonakdar S, Shojaei Moghadam M, Habibi Anbouhi M, et al. De werkzaamheid van Plasmocin™ op diverse zoogdiercellijnen die zijn geïnfecteerd met mollicutes, vergeleken met veelgebruikte antibiotica in celcultuur: een lokale ervaring. Cytotechnology. 2011;63:609-20

[21] Kragh Hansen U. Moleculaire aspecten van ligandbinding aan serumalbumine. Pharmacol Rev. 1981;33:17-53