Ga naar de startpagina
Winkelwagen € 0,00*
Toon alle categorieën HEK-celgebaseerde high-throughput GPCR-screeningplatforms Terug

HEK-celgebaseerde hoge-doorvoer GPCR Screening Platforms

G eiwit-gekoppelde receptoren (GPCR's) vertegenwoordigen de grootste familie van membraaneiwitten in het menselijk genoom en vormen ongeveer 34% van alle drug targets. Bij Cytion weten we dat voor het ontwikkelen van effectieve GPCR-gerichte geneesmiddelen robuuste celgebaseerde screeningsplatforms nodig zijn die receptoractivering van duizenden tot miljoenen verbindingen nauwkeurig kunnen meten. HEK293 cellen hebben zich ontpopt als de geprefereerde gastheer voor GPCR expressie en functionele screening, en bieden een unieke combinatie van efficiënte receptorexpressie, lage endogene receptorachtergrond en compatibiliteit met diverse testformaten.

Belangrijke opmerkingen

  • HEK293 cellen bieden een ideale achtergrond voor heterologe GPCR expressie met minimale interferentie van endogene receptoren
  • Meerdere testformaten - calcium flux, cAMP, β-arrestine rekrutering - maken uitgebreide pathway ondervraging mogelijk
  • Geautomatiseerde vloeistofverwerking en plaatlezers maken screening mogelijk van meer dan 100.000 verbindingen per dag
  • Stabiele strategieën voor de ontwikkeling van cellijnen brengen verwerkingsvereisten in balans met assayconsistentie
  • Detectie van vooringenomen agonisme vereist multiplexmetingen van verschillende signaalcascades
HEK293-gebaseerd GPCR high-throughput screening platform GPCR signaalwegen GPCR Gαs ↑cAMP Gαq ↑Ca²⁺ β-arr Werven Assay Technologieën Calcium flux Fluo-4/Fura-2 FLIPR/Plaatlezer cAMP Assays HTRF/AlphaScreen GloSensor β-Arrestine PathHunter BRET/NanoBiT Reportergen CRE-Luc NFAT-Luc HTS Werkstroom Cel zaaien 384/1536-wells Samenstelling Toevoeging Detectie Uitlezing Analyse Hit Selectie HEK293 Voordelen voor GPCR Screening Lage achtergrond Minimale endogene GPCR expressie Schoon signaal/ruis Hoge expressie Efficiënte transfectie Sterke CMV-promotors 10⁵-10⁶ receptoren/cel Volledige signalering Alle G-eiwitsubtypes Adaptoreiwitten aanwezig Koppeling van natuurlijke paden Assay compatibel Robuust in microtiterplaten Aanpassing aan suspensie Geautomatiseerde verwerking Screening doorvoer statistieken Formaat Putjes/Plaat Samenstellingen/Dag 96-wells 96 5,000-10,000 384-wells 384 20,000-50,000 1536-put 1536 100,000-500,000 3456-put 3456 500,000-1,000,000+ Ontwikkeling van stabiele cellijnen 1. Vectorontwerp met selectiemarker 2. Transfectie van HEK293 oudercellen 3. Antibioticaselectie (2-4 weken) 4. Klonen van eencellige cellen (FACS/limiting dilution) 5. Screening van kloon op expressie/functie 6. Celbankieren en stabiliteitstesten Tijdlijn: 3-6 maanden © Cytion - GPCR-geneesmiddelenonderzoek mogelijk maken

Waarom HEK293 cellen uitblinken in GPCR Screening

HEK293 cellen zijn de de facto standaard geworden voor GPCR functionele testen vanwege verschillende intrinsieke voordelen. Ten eerste, hun relatief lage endogene GPCR expressie minimaliseert achtergrond signalering die heterologe receptor studies zou kunnen verstoren. In tegenstelling tot bepaalde van kanker afgeleide cellijnen die talrijke GPCR's tot expressie brengen op functioneel relevante niveaus, bieden HEK293 cellen een schoon canvas voor receptorexpressie.

Ten tweede brengen HEK293 cellen alle belangrijke G eiwit subklassen (Gαs, Gαi, Gαq, Gα12/13) tot expressie op niveaus die voldoende zijn om verschillende receptorkoppelingen te ondersteunen. Dit complete signaleringsrepertoire maakt het mogelijk om eigen receptor-G eiwit interacties te onderzoeken zonder dat hiervoor co-expressie van specifieke G eiwit subeenheden nodig is.

Ten derde transfecteren HEK293 cellen efficiënt met meerdere soorten reagentia, waarbij transfectiesnelheden van meer dan 90% worden bereikt. Deze efficiëntie vertaalt zich in hoge receptorexpressieniveaus-typisch 10⁵ tot 10⁶ receptoren per cel-producerende robuuste signaalvensters zelfs voor receptoren met een bescheiden koppelingsrendement.

Onze HEK293T-cellen (300189) bieden een bijzonder hoge transfectie-efficiëntie voor voorbijgaande GPCR-expressie, waardoor ze ideaal zijn voor initiële receptorkarakterisering en testontwikkeling voordat er een stabiele cellijn wordt gegenereerd.

Assay-formaat selectie voor GPCR Screening

Calcium Flux Assays: Gαq gekoppelde receptoren activeren fosfolipase C, waardoor calcium vrijkomt uit intracellulaire voorraden. Calciumgevoelige fluorescerende kleurstoffen zoals Fluo-4, Fura-2 of genetisch gecodeerde calciumindicatoren maken real-time meting van deze respons mogelijk. Plaat-gebaseerde fluorescentielezers zoals FLIPR kunnen gelijktijdig calciumtransiënten meten over hele 384- of 1536-wellsplaten, waardoor een verwerkingscapaciteit van meer dan 100.000 datapunten per dag wordt bereikt.

cAMP-tests: Gαs gekoppelde receptoren stimuleren adenylyl cyclase, waardoor intracellulair cAMP toeneemt, terwijl Gαi-gekoppelde receptoren de cAMP-productie remmen. Verschillende testtechnologieën detecteren veranderingen in cAMP, waaronder competitieve immunoassays (HTRF, AlphaScreen), benaderingen op basis van biosensoren (GloSensor) en reportergen-tests (CRE-luciferase). Elk van deze methoden biedt duidelijke voordelen op het gebied van gevoeligheid, kinetiek en verwerkingscapaciteit.

β-arrestine rekrutering: Activering van GPCR leidt tot rekrutering van β-arrestine naar de receptor, een proces dat meetbaar is met eiwitcomplementatietests. Technologieën zoals PathHunter (enzymatische fragmentaanvulling) en NanoBiT (gesplitste luciferase) bieden gevoelige, padonafhankelijke metingen die toepasbaar zijn op receptorklassen, ongeacht de voorkeur voor G-eiwitkoppeling.

Reporter Gen Assays: Transcriptionele reportersystemen meten downstream signaalgebeurtenissen en bieden een versterking die de gevoeligheid verhoogt. CRE-luciferase reporters detecteren cAMP pathway activatie, NFAT-luciferase reageert op calcium signalering, en SRE-luciferase controleert meerdere pathways. Hoewel ze langzamer zijn dan directe metingen van tweede boodschappers, bieden reporter-tests uitstekende signaal-achtergrondverhoudingen.

Strategieën voor de ontwikkeling van stabiele cellijnen

Voor high-throughput screeningcampagnes zijn doorgaans stabiele cellijnen nodig die de GPCR-doelgroep op consistente niveaus uitdrukken in miljarden testputjes. De ontwikkeling van stabiele lijnen begint met het vectorontwerp dat zowel de receptor als een selecteerbare marker bevat, waardoor aanrijking van stabiel getransfecteerde cellen mogelijk wordt.

Onze HEK293-cellen (300192) dienen als de standaardouderlijn voor het genereren van stabiele cellijnen. Na transfectie en antibioticaselectie (meestal 2-4 weken) worden overlevende cellen gekloond met één cel door middel van limiterende verdunning of fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS). Individuele klonen worden vervolgens geëxpandeerd en gekarakteriseerd op receptorexpressieniveau, functionele respons en assay robuustheid.

Kritische kwaliteitsattributen voor het screenen van cellijnen zijn onder andere stabiliteit van de expressie bij langdurige passage, consistente farmacologie in vergelijking met referentiestandaarden en robuuste prestaties in geminiaturiseerde plaatformaten. Banken met gekwalificeerde cellen moeten vroeg in de screeningscampagne worden aangelegd om consistente prestaties te garanderen.

Voor versnelde tijdlijnen maken onze HEK293 EBNA-cellen (300264) stabiele expressie vanuit episomale vectoren mogelijk, waardoor de ontwikkelingstijd kan worden verkort met behoud van consistente expressie.

Miniaturisatie en automatisering

Het maximaliseren van de doorvoer van screening vereist miniaturisatie tot 384-wells, 1536-wells of zelfs 3456-wells formaten. HEK293 cellen passen zich goed aan high-density plating in gereduceerde volumes aan, hoewel optimalisatie van celdichtheid, plating condities en incubatietijden nodig kunnen zijn voor elke formaatovergang.

Suspensie-aangepaste HEK293 cellen bieden voordelen voor geautomatiseerde screening workflows. Onze HEK293 suspensie-aangepaste (300686) cellen kunnen direct worden gedistribueerd van kweekvaten in testplaten zonder trypsinisatie, waardoor de handling stappen worden verminderd en de consistentie wordt verbeterd. Deze compatibiliteit met geautomatiseerde vloeistof handlers maakt echte walkaway screening campagnes mogelijk.

De stabiliteitseisen voor testplaten variëren per formaat. Calcium flux assays vereisen meestal een meting binnen enkele uren na het laden van de kleurstof, terwijl cAMP en β-arrestine assays een incubatie van een nacht kunnen toestaan voor het aflezen. Inzicht in deze beperkingen geeft informatie over de screeninglogistiek en de planning van de apparatuur.

Gegevensanalyse en Hit Identificatie

GPCR screening campagnes genereren enorme datasets die robuuste analyse pipelines vereisen. Statistische parameters zoals de Z'-factor, signaal-achtergrondverhouding en variatiecoëfficiënt beoordelen de kwaliteit van de platen per plaat. Platen die niet voldoen aan de kwaliteitsdrempels moeten worden herhaald in plaats van geanalyseerd.

Hit-identificatiecriteria wegen gevoeligheid af tegen vals-positieve percentages. Activiteitsdrempels van 50% activering of inhibitie ten opzichte van referentiekoppelingen bieden redelijke startpunten, hoewel optimale drempels afhangen van de samenstelling van de bibliotheek en de programmadoelstellingen. Bevestiging van concentratie-respons van primaire hits elimineert artefacten en rangschikt verbindingen voor follow-up.

Bij de ontdekking van moderne GPCR-geneesmiddelen ligt de nadruk steeds meer op vooringenomen agonisme - verbindingen die bepaalde signaalwegen bij voorkeur activeren in plaats van andere. Om vooringenomen verbindingen te detecteren zijn parallelle assays nodig die meerdere pathways meten (bijv. activering van G-eiwitten versus rekrutering van β-arrestine) met zorgvuldige aandacht voor de gevoeligheid en kinetiek van de assay om technische vooringenomenheid te voorkomen.

Aanbevolen producten voor GPCR Screening:

Deze website maakt gebruik van cookies om ervoor te zorgen dat u de beste ervaring krijgt op onze website... Meer informatie.
- Imprint

We hebben vastgesteld dat u zich in een ander land bevindt of een andere browsertaal gebruikt dan momenteel is geselecteerd. Wilt u de voorgestelde instellingen accepteren?

Sluit