Diterbitkan: 2023 | Terakhir diperbarui: Mei 2026

Panduan Lengkap Pembekuan Sel: Memastikan Viabilitas dan Sterilitas

Pembekuan sel merupakan proses kritis dalam pengelolaan kultur sel, yang memastikan penyimpanan jangka panjang dan pelestarian garis sel yang berharga. Baik bekerja dengan sel manusia maupun hewan, mengikuti protokol yang tepat dan menjaga teknik aseptik yang ketat sangat penting untuk mencapai kriopreservasi yang sukses.

Panduan ini memberikan petunjuk terperinci mengenai bahan dan reagen yang diperlukan, serta prosedur langkah demi langkah untuk membekukan sel secara efektif sambil mempertahankan viabilitas dan sterilitasnya. Dengan mematuhi pedoman ini, para peneliti dapat dengan percaya diri menyimpan dan kemudian menghidupkan kembali kultur sel dengan kehilangan viabilitas sel yang minimal, sehingga menjaga integritas dan keandalan hasil eksperimen mereka.

Pertama-tama, penting untuk menyiapkan lingkungan kerja yang steril. Teknik aseptik yang tepat berperan penting dalam mencegah kontaminasi dan memastikan sterilitas kultur.

Teknik Aseptik

Ikuti teknik aseptik selama proses berlangsung untuk memastikan sterilitas kultur.

Proses Pembekuan Sel yang Komprehensif

Bagan alur ini memberikan panduan visual terperinci mengenai langkah-langkah penting yang terlibat dalam pembekuan sel yang tepat. Ikuti prosedur ini untuk memastikan viabilitas dan integritas sel yang tinggi selama proses kriopreservasi.

Persiapan Media Pembekuan

Siapkan media pembekuan krioprotektif sesuai dengan jenis sel:

Kultur media yang mengandung FBS: 90% FBS + 10% DMSO atau 70% media pertumbuhan, 20% FBS, dan 10% DMSO
Sel yang memerlukan gliserol: 90% FBS + 10% gliserol

Pertimbangkan untuk membeli media pembekuan yang telah diformulasikan sebelumnya:

Media Pembekuan CM-1: Untuk protokol yang memerlukan media yang mengandung Serum Sapi Janin (FBS)
Media pembekuan CM-ACF - bebas serum: Untuk alternatif bebas FBS

Pelabelan dan Dokumentasi

Berikan label pada tabung kriogenik dengan detail berikut:

Tanggal
Nama peneliti
Nomor sel
Nomor generasi
Jenis sel
Informasi tambahan (misalnya, modifikasi genetik)

Persiapan Sel

Untuk Sel Adheren:

Pantau sel hingga mencapai kepadatan 85–95%
Sedot medium kultur lama
Bilas lapisan tunggal sel dengan PBS bebas kalsium dan magnesium
Lepaskan sel dengan Accutase, tripsin, atau tripsin-EDTA dan netralkan dengan media kultur jika diperlukan
Pindahkan suspensi sel ke tabung Falcon 50 mL

Untuk Sel Suspensi:

Periksa kepadatan dan kesehatan sel di bawah mikroskop
Pindahkan suspensi sel langsung ke tabung Falcon 50 mL

Penghitungan Sel dan Sentrifugasi

Hitung sel menggunakan hemocytometer atau alat penghitung sel otomatis
Sentrifugasi pada 300g selama 3-5 menit pada suhu kamar untuk memekatkan sel
Sedot supernatannya dengan hati-hati, hindari mengganggu endapan sel
Panaskan media pembekuan yang telah disiapkan hingga 37°C sebelum digunakan

Kriopreservasi

Resuspensi endapan sel dalam media pembekuan hingga kepadatan 2,0 juta sel/mL untuk sel yang melekat, dan 5 juta sel/mL untuk sel suspensi, atau konsentrasi yang Anda inginkan
Tuangkan 1,0 mL (atau lebih sesuai kebutuhan) suspensi sel ke dalam tabung kriopreservasi yang telah diberi label
Gunakan metode pembekuan lambat sebelum memindahkan sel ke penyimpanan jangka panjang

? Metode: ? Langkah-langkah
❄️ Pembekuan Manual: 1️⃣ Tempatkan sel dalam media pembeku di dalam freezer bersuhu 4°C selama 40 menit.
2️⃣ Pindahkan ke freezer bersuhu -80°C selama 24 jam.
3️⃣ Simpan sel dalam nitrogen cair untuk pelestarian jangka panjang.
? Menggunakan Mr. Frosty: 1️⃣ Siapkan sel dalam tabung kriogenik dengan media pembekuan.
2️⃣ Letakkan tabung kriogenik dalam wadah Mr. Frosty.
3️⃣ Simpan pada suhu -80°C selama 24 jam sebelum dipindahkan ke nitrogen cair.
? Freezer dengan Kecepatan Terkendali: 1️⃣ Atur perangkat untuk menurunkan suhu secara bertahap.
2️⃣ Letakkan sel yang telah disiapkan di dalam freezer.
3️⃣ Setelah siklus pembekuan selesai, pindahkan sel ke nitrogen cair.

Simpan cryovial pada suhu di bawah -130°C atau dalam nitrogen cair untuk penyimpanan jangka panjang.

Bahan dan Reagen

Tabung kriogenik 1–2 mL
Unit pembeku CoolCell® atau freezer dengan laju pembekuan terkontrol
Media pembekuan pelindung kriogenik (misalnya, media pelindung kriogenik buatan sendiri, CM-1, CM-ACF, atau media khusus)
Serum Sapi Janin (FBS) atau media yang telah dikondisikan
DMSO atau gliserol
PBS bebas kalsium dan magnesium
Accutase, Trypsin, atau Trypsin-EDTA (untuk sel yang melekat)
Tabung Falcon 15 mL atau 50 mL
Hemocytometer atau penghitung sel otomatis
Sentrifugasi