Panduan Komprehensif untuk Membekukan Sel: Memastikan Kelangsungan Hidup dan Kemandulan
Membekukan sel adalah proses penting dalam manajemen kultur sel, memastikan penyimpanan jangka panjang dan pengawetan garis sel yang berharga. Baik bekerja dengan sel manusia atau hewan, mengikuti protokol yang tepat dan mempertahankan teknik aseptik yang ketat adalah hal yang paling penting untuk mencapai kriopreservasi yang sukses.
Panduan ini memberikan petunjuk terperinci tentang bahan, reagen, dan prosedur langkah demi langkah yang diperlukan untuk membekukan sel secara efektif sekaligus menjaga kelangsungan hidup dan kemandulannya. Dengan mengikuti panduan ini, para peneliti dapat dengan percaya diri menyimpan dan menghidupkan kembali kultur sel dengan kehilangan viabilitas sel yang minimal, menjaga integritas dan keandalan hasil eksperimen mereka.
Untuk memulai, sangat penting untuk membangun lingkungan kerja yang steril. Teknik aseptik yang tepat memainkan peran penting dalam mencegah kontaminasi dan memastikan kemandulan kultur.
Teknik Aseptik
Ikuti teknik aseptik selama proses berlangsung untuk memastikan sterilitas kultur.
Proses Pembekuan Sel yang Komprehensif
Diagram alir ini memberikan panduan visual terperinci tentang langkah-langkah penting yang terlibat dalam pembekuan sel yang tepat. Ikuti prosedur ini untuk memastikan viabilitas dan integritas sel yang tinggi selama proses kriopreservasi.
Persiapan Media Pembekuan
Siapkan media pembekuan krioprotektif sesuai dengan jenis sel:
- Kultur media yang mengandung FBS: 90% FBS + 10% DMSO atau media pertumbuhan 70%, 20% FBS dan 10% DMSO
- Sel yang membutuhkan gliserol: 90% FBS + 10% gliserol
Pertimbangkan untuk membeli media beku yang telah diformulasikan sebelumnya:
- Media PembekuanCM-1: Untuk protokol yang membutuhkan media yang mengandung Fetal Bovine Serum (FBS)
- Media pembekuan CM-ACF - bebas serum: Untuk alternatif bebas FBS
Pelabelan dan Dokumentasi
Beri label kriovial dengan detail berikut:
- Tanggal
- Nama peneliti
- Nomor sel
- Nomor bagian
- Jenis sel
- Informasi tambahan apa pun (misalnya, modifikasi genetik)
Persiapan Sel
Untuk Sel yang Patuh:
- Pantau sel hingga mencapai 85-95% pertemuan
- Aspirasi media kultur lama
- Bilas lapisan tunggal sel dengan PBS bebas kalsium dan magnesium
- Lepaskan sel dengan Accutase, tripsin, atau tripsin-EDTA dan netralkan dengan media kultur jika diperlukan
- Pindahkan suspensi sel ke dalam tabung Falcon 50 mL
Untuk Sel Suspensi:
- Periksa kepadatan dan kesehatan sel di bawah mikroskop
- Pindahkan suspensi sel secara langsung ke dalam tabung Falcon 50 mL
Penghitungan dan Sentrifugasi Sel
- Hitung sel menggunakan hemositometer atau penghitung sel otomatis
- Sentrifugasi dengan kecepatan 300g selama 3-5 menit pada suhu kamar untuk membuat pelet sel
- Aspirasi supernatan dengan hati-hati, hindari gangguan pada pelet sel
- Hangatkan media pembekuan yang telah disiapkan hingga 37°C sebelum digunakan
Kriopreservasi
- Resuspensi pelet sel dalam media pembekuan dengan kepadatan 2,0 juta sel/mL untuk sel yang melekat, dan 5 juta sel/mL untuk sel suspensi, atau konsentrasi yang Anda inginkan
- Aliquot 1,0 mL (atau lebih sesuai kebutuhan) dari suspensi sel ke dalam kriovial berlabel
- Gunakan metode pembekuan lambat sebelum memindahkan sel ke penyimpanan jangka panjang
| ? Metode | ? Langkah-langkah |
|---|---|
|
❄️ Pembekuan Manual |
1️⃣ Tempatkan sel dalam media pembekuan di dalam freezer 4°C selama 40 menit. 2️⃣ Pindahkan ke dalam freezer -80°C selama 24 jam. 3️⃣ Simpan sel dalam nitrogen cair untuk pengawetan jangka panjang |
|
? Menggunakan Tn. Frosty |
1️⃣ Siapkan sel dalam kriovial dengan media pembekuan. 2️⃣ Tempatkan cryovial di dalam wadah Mr. 3️⃣ Simpan pada suhu -80°C selama 24 jam sebelum dipindahkan ke nitrogen cair |
|
? Pembeku Suhu Terkendali |
1️⃣ Program perangkat untuk menurunkan suhu secara bertahap. 2️⃣ Tempatkan sel yang telah disiapkan di dalam freezer. 3️⃣ Setelah siklus pembekuan, pindahkan sel ke nitrogen cair |
- Simpan kriovial pada suhu di bawah -130 ° C atau dalam nitrogen cair untuk pengawetan jangka panjang.
Bahan dan Reagen
- 1-2 mL larutan kriovial
- Unit pembekuan CoolCell® atau pembeku dengan laju terkontrol
- Media pembekuan krioprotektif (misalnya, media krioprotektan buatan sendiri, CM-1, CM-ACF, atau media khusus)
- Fetal Bovine Serum (FBS) atau media yang dikondisikan
- DMSO atau gliserol
- PBS bebas kalsium dan magnesium
- Accutase, Tripsin, atau Tripsin-EDTA (untuk sel yang melekat)
- tabung Falcon 15 mL atau 50 mL
- Hemositometer atau penghitung sel otomatis
- Mesin sentrifugasi