Sel Primer Manusia

Apa itu sel primer manusia?

Sel primer merupakan representasi paling murni dari jaringan masing-masing. Sel-sel ini diisolasi dari jaringan dan diproses agar dapat berkembang biak dalam lingkungan kultur dengan kondisi yang ideal. Sel-sel ini lebih mirip dengan kondisi in vivo dan menunjukkan fisiologi normal karena berasal langsung dari jaringan, bukan hasil modifikasi. Karena itu, sel-sel ini dapat berfungsi sebagai model yang berguna untuk penelitian farmakologi seluler, toksikologi, dan fisiologi (termasuk studi tentang metabolisme, penuaan, dan transduksi sinyal). Perlu diingat bahwa sel primer lebih sulit untuk dikultur dan dipelihara dibandingkan dengan garis sel kontinu karena memiliki umur sel yang lebih pendek dan akan berhenti membelah (atau mengalami senesens) setelah sejumlah pembelahan sel tertentu. Studi tentang jalur pensinyalan sel menjadi rumit karena variabilitas yang melekat pada sel primer yang diperoleh dari donor dan melalui praktik subkultur. Sebelum memulai studi pensinyalan, peneliti sering kali melakukan penyaringan untuk menentukan apakah sel-sel tersebut merespons rangsangan yang umum digunakan atau tidak. Untuk menghindari pemborosan waktu dan uang, sel primer dapat dirangsang untuk mengaktifkan jalur pensinyalan utama sebelum disaring.

Mengapa menggunakan sel primer manusia?

Garis sel yang diimortalkan umumnya digunakan sebagai media uji sel. Meskipun para ilmuwan telah mengakui bahwa perubahan biologis akibat penggunaan garis sel tersebut dapat merugikan dalam mempelajari signifikansi fisiologisnya. Penggunaan sel primer manusia meningkatkan nilai fisiologis data yang diperoleh melalui kultur sel, dan sel-sel ini semakin dianggap penting untuk mempelajari proses biologis, perkembangan penyakit, serta pengembangan obat.

Sel primer manusia banyak digunakan dalam studi in vitro mengenai komunikasi antar sel dan intraseluler, biologi perkembangan, serta mekanisme yang mendasari kanker, penyakit Parkinson, dan diabetes, di antara banyak bidang penelitian biologi praklinis dan investigatif lainnya. Para peneliti telah lama menggunakan garis sel yang diimortalkan untuk mempelajari fungsi jaringan; namun, garis sel dengan mutasi yang jelas dan kelainan kromosom mungkin bukan pengganti yang baik untuk sel normal dan perkembangan penyakit pada tahap awalnya. Model yang lebih akurat dari jenis sel jaringan tertentu kini dapat dicapai dengan menggunakan sel primer manusia yang diisolasi dari jaringan tersebut dan dipelihara dalam media kultur sel primer serta suplemen.

Apa itu kultur sel primer?

Alih-alih menggunakan garis sel yang diimortalkan, kultur sel primer melibatkan pertumbuhan sel secara langsung dari organisme multiseluler di luar tubuh. Di beberapa negara, seperti Inggris, terdapat pengakuan hukum bahwa kultur sel primer lebih representatif terhadap jaringan in vivo dibandingkan garis sel. Meskipun demikian, sel primer memerlukan substrat dan nutrisi yang tepat untuk tumbuh, dan setelah sejumlah pembelahan tertentu, sel-sel tersebut mengembangkan fenotipe senesens yang menyebabkan mereka berhenti membelah secara permanen. Kedua faktor ini mendorong pengembangan garis sel. Baik sel primer yang diimortalkan secara alami (misalnya, sel HeLa) maupun sel primer yang diimortalkan secara artifisial (misalnya, sel HEK) dapat dikultur tanpa batas waktu dalam kultur sel.

Sel primer manusia berdasarkan jenis jaringan

Sel epitel, fibroblas, keratinosit, melanosit, sel endotel, sel otot, sel imun, dan sel punca seperti sel punca mesenkimal termasuk di antara sel primer manusia yang paling sering digunakan dalam penelitian ilmiah. Pada awalnya, kultur tersebut bersifat heterogen (mewakili campuran jenis sel yang terdapat dalam jaringan), dan hanya dapat dipertahankan hidup in vitro selama jangka waktu tertentu. Transformasi adalah proses in vitro yang memungkinkan sel primer manusia dimanipulasi untuk subkultur tanpa batas. Transformasi dapat terjadi secara alami, atau dapat diinduksi oleh bahan kimia atau virus. Setelah menjalani transformasi genetik, kultur primer dapat membelah tanpa batas menjadi garis sel sekunder yang diabadi jika diberi nutrisi dan ruang yang cukup.

Sel endotel

Pengobatan kanker, penyembuhan luka, penelitian pensinyalan sel, penyaringan throughput tinggi dan konten tinggi, serta penyaringan toksikologi hanyalah beberapa bidang yang dapat memperoleh manfaat dari penggunaan sel endotel primer sebagai alat penelitian.

Keratinosit

Keratinosit, yang berasal dari epidermis kulit manusia dewasa atau kulup bayi baru lahir, memainkan peran penting dalam studi penyakit kulit seperti psoriasis dan kanker.

Sel epitel

Mulai dari studi kanker hingga penelitian toksikologi, sel epitel primer telah terbukti menjadi sumber daya yang sangat berharga untuk memodelkan pertahanan alami tubuh.

Fibroblas

Sel induk pluripotent terinduksi (iPS) dan studi penyembuhan luka hanyalah beberapa dari banyak kegunaan sel fibroblast primer.

Sel imun

Sel mononuklear darah tepi, disingkat PBMC, adalah sel mononuklear dalam darah yang memiliki inti sel berbentuk bulat. Sel-sel ini terutama terdiri dari limfosit dan monosit, yang memainkan peran penting dalam proses respons imun. Sel mononuklear darah tepi sering digunakan untuk mendiagnosis infeksi atau mendeteksi kemungkinan perlindungan vaksinasi. Pemahaman mendalam tentang respons imun seluler yang dimediasi oleh sel T seringkali sangat penting.

Melanosit

Melanosit, sel kulit khusus yang memproduksi pigmen melanin, berguna sebagai model untuk penelitian mengenai topik-topik seperti penyembuhan luka, toksisitas, melanoma, respons dermal terhadap radiasi ultraviolet (UV), penyakit kulit, dan kosmetik.

Sel punca

Sel punca memiliki potensi untuk berdiferensiasi menjadi berbagai jenis sel. Karena kemampuannya untuk berdiferensiasi, sel punca memberikan peluang baru untuk memodelkan jaringan manusia dan kondisi kesehatan.

Sel punca mesenkimal

Sel punca mesenkim, yang juga dikenal sebagai MSC, dapat diperoleh dari berbagai sumber pada manusia seperti sumsum tulang, lemak (jaringan adiposa), jaringan tali pusat (Wharton's Jelly), dan cairan amnion (cairan yang mengelilingi janin), serta dapat diperbanyak secara in vitro. Sel punca stroma dewasa ini memiliki kemampuan untuk berkembang menjadi berbagai jenis sel. Beberapa jenis sel tersebut antara lain sel tulang, sel tulang rawan, sel otot, sel saraf, sel kulit, dan sel kornea.

Sel otot polos

Di dalam organ berongga, sel otot polos primer (SMC) melapisi bagian dalam dan memediasi kontraktilitas. Selain untuk kanker dan penyakit lainnya, SMC dapat digunakan untuk memodelkan fibrosis hipertensi.

Sel primer dan garis sel

Baik melalui mutasi spontan, seperti pada garis sel kanker yang tertransformasi, maupun melalui modifikasi sengaja, seperti dalam produksi buatan gen kanker, garis sel kontinu telah memperoleh potensi untuk beregenerasi tanpa henti (diabadi). Secara umum, garis sel kontinu lebih andal dan praktis untuk ditangani dibandingkan sel primer. Baris sel kontinu dapat berkembang biak tanpa batas dan memberikan akses cepat ke data penting. Penggunaan baris sel kontinu memiliki batasan tertentu, termasuk fakta bahwa sel-sel tersebut telah dimodifikasi/ditransformasi secara genetik, yang mungkin mengubah karakteristik fisiologis dan tidak sesuai dengan kondisi in vivo, serta hal ini dapat berubah lebih lanjut seiring waktu akibat pemindahan yang signifikan.

Kemajuan dalam kultur sel primer

Sel primer dikenal sulit untuk ditangani. Namun, prosesnya kini menjadi lebih mudah daripada sebelumnya berkat perkembangan dalam kultur sel primer, ketersediaan sel primer komersial dengan protokol yang sepenuhnya dioptimalkan, serta teknik analisis baru yang membutuhkan lebih sedikit input.

Peralihan dari kultur sel dua dimensi ke tiga dimensi dianggap sebagai tonggak penting dalam bidang ini. Arsitektur spesifik jaringan, interaksi antar sel, serta sinyal mekanis/biokimia mungkin tereduksi dalam kultur 2D. Oleh karena itu, terdapat batasan pada nilai biologis kultur-kultur tersebut.

Di sisi lain, kultur sel 3D memungkinkan sel untuk berkembang biak dan berinteraksi dengan kerangka ekstraseluler 3D. Hal ini memungkinkan sel untuk berinteraksi satu sama lain dan dengan matriks ekstraseluler, sehingga membuat kultur 3D lebih relevan secara fisiologis. Akurasi metode ini dalam memprediksi respons in vivo telah menjadikannya revolusioner di bidang-bidang seperti penemuan dan pengembangan obat. Karena itu, teknologi mutakhir, seperti organoid yang berasal dari pasien dan organ-on-a-chip, menyediakan model yang sangat kontekstual untuk penyaringan dan pengembangan obat.

Pembuatan sel primer merupakan hambatan dalam kultur primer. Biasanya diperlukan volume jaringan yang lebih besar untuk mengatasi hal ini, yang mungkin sulit dicapai. Namun, peningkatan sensitivitas analitis memberikan jalan ke depan. Misalnya, kebutuhan untuk membiakkan sel primer dalam jumlah besar berkurang dengan menggunakan teknologi sel tunggal, yang mencakup sekuensing, western blotting, dan sitometri massa.

Prospek menjanjikan untuk kultur sel primer

Kesulitan umum dalam kultur sel primer sedang diatasi oleh kemajuan teknologi. Pada gilirannya, metode ini dengan cepat menggantikan metode lain sebagai standar emas dalam studi dan praktik biologi seluler dan molekuler. Produksi vaksin, penggantian organ, terapi sel punca, penelitian kanker, dan banyak hal lainnya akan mendapat manfaat besar dari kemajuan berkelanjutan dalam kultur sel primer.

Kiat dan trik kultur sel primer

Kebutuhan ekspansi sel

Dua metode paling umum untuk membudidayakan sel primer adalah dalam suspensi atau pada permukaan (2D). Beberapa sel mampu mengapung bebas dalam aliran darah tanpa pernah menempel pada permukaan (misalnya sel yang berasal dari darah perifer). Berbagai garis sel telah dimodifikasi agar dapat berkembang dengan baik dalam kultur suspensi, di mana mereka dapat mencapai kepadatan yang tidak dapat dicapai dalam kondisi pertumbuhan 2D. Sel primer yang memerlukan penempelan untuk tumbuh in vitro disebut sel adheren dan mencakup sel-sel yang ditemukan dalam jaringan padat. Untuk meningkatkan sifat adhesi dan menyediakan sinyal lain yang diperlukan untuk pertumbuhan dan diferensiasi, sel-sel ini biasanya dikultur dalam wadah plastik datar yang tidak dilapisi, namun kadang-kadang menggunakan mikro-pembawa. Opsi terakhir ini dapat dilapisi dengan protein matriks ekstraseluler (seperti kolagen dan laminin). Media yang digunakan dalam kultur sel terdiri dari media dasar yang telah ditambahkan faktor pertumbuhan dan sitokin yang sesuai. Inkubator sel adalah jenis khusus inkubator laboratorium yang digunakan untuk membudidayakan dan memelihara sel pada suhu dan campuran gas tertentu (biasanya 37 °C, 5% CO₂ untuk sel mamalia). Tergantung pada jenis sel yang dikultur, kondisi optimalnya bisa sangat berbeda. Bergantung pada jenis sel yang ditumbuhkan, media pertumbuhan yang optimal akan memiliki kombinasi faktor yang unik, termasuk namun tidak terbatas pada pH, konsentrasi glukosa, faktor pertumbuhan, dan keberadaan nutrisi lainnya.

Antibiotik dalam media pertumbuhan sangat penting selama pembentukan kultur primer untuk mencegah kontaminasi dari jaringan inang. Beberapa regimen antibiotik mencakup kombinasi gentamisin, penisilin, streptomisin, dan amfoterisin B. Namun, penggunaan antibiotik dalam jangka waktu yang lama tidak disarankan karena beberapa reagen (seperti amfoterisin B) dapat menjadi toksik bagi sel dalam jangka panjang.

Sebagian besar sel primer mengalami penuaan dan berhenti membelah setelah sejumlah tertentu penggandaan populasi, sehingga sangat penting untuk menjaga kelangsungan hidup sel-sel tersebut setelah isolasi. Viabilitas sel jangka panjang memerlukan teknik kultur sel yang ahli serta kondisi kultur yang ideal (termasuk media yang tepat, suhu yang tepat, campuran gas yang tepat, pH yang tepat, konsentrasi faktor pertumbuhan yang tepat, ketersediaan nutrisi, dan ketersediaan glukosa). Karena banyak faktor pertumbuhan yang digunakan untuk melengkapi media diperoleh dari darah hewan (bahan-bahan yang berasal dari darah berpotensi terkontaminasi), disarankan agar penggunaannya diminimalkan atau dihindari sama sekali. Penting juga untuk menggunakan teknik aseptik.

Subkultur dan pemeliharaan

Ketika sel-sel yang diisolasi menempel pada permukaan cawan kultur, hal ini menandai dimulainya fase pemeliharaan. Penempelan biasanya terjadi 24 jam setelah dimulainya kultur. Sel harus disubkultur ketika telah mencapai persentase konfluensi tertentu dan sedang bereplikasi secara aktif. Karena sel pasca-konfluen dapat mengalami diferensiasi dan menunjukkan proliferasi yang lebih lambat setelah pemindahan, sebaiknya kultur sel primer disubkultur sebelum mencapai konfluensi 100%.

Subkultur dalam media segar mempertahankan pertumbuhan eksponensial sel yang bergantung pada perlekatan. Subkultur pada lapisan tunggal mengganggu interaksi antar dan intraseluler pada permukaan sel. Enzim proteolitik dengan konsentrasi rendah, seperti tripsin/EDTA, digunakan untuk mengekstraksi sel primer yang melekat dari lapisan tunggal atau jaringan. Setelah terdisosiasi dan diencerkan menjadi larutan sel tunggal, sel-sel tersebut dihitung dan dipindahkan ke wadah kultur baru untuk menempel kembali dan berkembang biak.

Kriopreservasi dan pemulihan

Kriopreservasi melestarikan sel hidup dengan membekukannya pada suhu rendah. Kriopreservasi dan pencairan sel primer manusia mencegah kematian dan kerusakan sel selama penyimpanan dan penggunaan. Sel primer manusia dilindungi dari efek pembekuan menggunakan DMSO atau gliserol (pada suhu yang tepat dan dengan laju pembekuan yang terkendali). Proses pembekuan harus dilakukan secara bertahap, yaitu turun 1 °C setiap menit, untuk mencegah pembentukan kristal es. Penyimpanan jangka panjang memerlukan nitrogen cair (-196 °C) atau suhu di bawah -130 °C.

Cukup merendam sel beku dalam bak air bersuhu 37 °C selama sekitar 1 hingga 2 menit untuk mencairkan sel yang diawetkan secara kriogenik. Sel primer manusia tidak boleh disentrifugasi setelah dicairkan dari freezer (karena sel-sel ini sangat rentan terhadap kerusakan selama pemulihan dari kriopreservasi). Media ini cocok untuk penanaman sel segera setelah pencairan, dan mendorong perlekatan dalam kultur selama 24 jam pertama setelah penanaman. 1 Setelah sel primer yang diawetkan secara kriogenik melekat, media bekas harus dibuang (karena DMSO berbahaya bagi sel primer dan dapat menyebabkan penurunan viabilitas pasca-pencairan).