Sel Primer Manusia

Apa itu sel primer manusia?

Sel primer adalah representasi paling murni dari jaringan masing-masing. Sel ini diisolasi dari jaringan dan diproses sehingga dapat ditumbuhkan dalam lingkungan kultur dengan kondisi yang ideal. Sel primer lebih dekat meniru keadaan in vivo dan menampilkan fisiologi normal karena berasal dari jaringan dan bukan dimodifikasi. Oleh karena itu, mereka dapat berfungsi sebagai model yang berguna untuk penelitian farmakologi seluler, toksikologi, dan fisiologi (termasuk studi metabolisme, penuaan, dan transduksi sinyal). Perlu diingat bahwa sel primer lebih sulit untuk dikultur dan dipelihara daripada garis sel kontinu karena memiliki umur yang lebih pendek dan akan berhenti membelah (atau mengalami penuaan) setelah sejumlah pembelahan sel. Studi tentang jalur pensinyalan sel diperumit oleh variabilitas yang melekat pada sel primer yang diperoleh dari donor dan melalui praktik subkultur. Sebelum memulai studi pensinyalan, para peneliti sering melakukan skrining untuk menentukan apakah sel merespons rangsangan yang umum digunakan atau tidak. Untuk menghindari pemborosan waktu dan biaya, sel primer dapat distimulasi untuk mengaktifkan jalur pensinyalan utama sebelum disaring.

Mengapa menggunakan sel primer manusia?

Garis sel yang diawetkan biasanya digunakan sebagai uji sel. Meskipun para ilmuwan telah mengakui bahwa perubahan biologis karena garis sel mungkin berbahaya dalam mempelajari signifikansi fisiologisnya. Penggunaan sel primer manusia meningkatkan nilai fisiologis data yang diperoleh melalui kultur sel, dan semakin dianggap penting untuk mempelajari proses biologis, perkembangan penyakit, dan pengembangan obat.

Sel primer manusia banyak digunakan dalam studi in vitro tentang komunikasi antar sel dan intraseluler, biologi perkembangan, dan mekanisme yang mendasari kanker, penyakit Parkinson, dan diabetes, di antara banyak bidang penelitian biologis praklinis dan investigasi lainnya. Para peneliti telah lama menggunakan garis sel yang diawetkan untuk mempelajari fungsi jaringan; namun, garis sel dengan mutasi yang jelas dan kelainan kromosom mungkin bukan merupakan pengganti yang baik untuk sel normal dan perkembangan penyakit pada tahap awal. Model yang lebih akurat dari jenis sel jaringan tertentu sekarang dapat dicapai dengan menggunakan sel primer manusia yang diisolasi dari jaringan tersebut dan dipelihara dalam media kultur sel primer dan suplemen.

Apa yang dimaksud dengan kultur sel primer?

Alih-alih menggunakan garis sel yang diawetkan, kultur sel primer melibatkan pertumbuhan sel secara langsung dari organisme multiseluler di luar tubuh. Pengakuan hukum ada di beberapa negara, seperti Inggris, untuk fakta bahwa kultur sel primer lebih mewakili jaringan in vivo daripada garis sel. Meskipun demikian, sel primer membutuhkan substrat dan nutrisi yang tepat untuk tumbuh, dan setelah sejumlah pembelahan, mereka mengembangkan fenotipe senescent yang menyebabkan mereka berhenti membelah secara permanen. Kedua faktor ini memotivasi penciptaan garis sel. Baik sel primer yang diawetkan secara alami (misalnya, sel HeLa) dan sel primer yang diawetkan secara artifisial (misalnya, sel HEK) dapat dibudidayakan tanpa batas waktu dalam kultur sel.

Sel primer manusia berdasarkan jenis jaringan

Sel epitel, fibroblas, keratinosit, melanosit, melanosit, sel endotel, sel otot, sel imun, dan sel punca seperti sel punca mesenkim adalah beberapa sel primer manusia yang paling sering digunakan dalam studi ilmiah. Pertama-tama, kultur bersifat heterogen (mewakili campuran jenis sel yang ada dalam jaringan), dan hanya dapat dipertahankan secara in vitro untuk jangka waktu tertentu. Transformasi adalah proses in vitro yang memungkinkan sel primer manusia dimanipulasi untuk subkultur yang tidak terbatas. Transformasi dapat terjadi secara alami, atau dapat diinduksi oleh bahan kimia atau virus. Setelah mengalami transformasi genetik, kultur primer dapat membelah tanpa batas waktu menjadi garis sel sekunder yang diabadikan jika diberi nutrisi dan ruang yang cukup.

Sel endotel

Pengobatan kanker, penyembuhan luka, penelitian pensinyalan sel, skrining dengan hasil tinggi dan konten tinggi, dan skrining toksikologi hanyalah beberapa bidang yang dapat memperoleh manfaat dari penggunaan sel endotel primer sebagai alat penelitian.

Keratinosit

Keratinosit, yang berasal dari epidermis kulit manusia dewasa atau kulup bayi baru lahir, memainkan peran penting dalam studi penyakit kulit seperti psoriasis dan kanker.

Sel epitel

Dari penelitian kanker hingga penyelidikan toksikologi, sel epitel primer telah terbukti menjadi sumber daya yang tak ternilai untuk memodelkan pertahanan alami tubuh.

Fibroblas

Menginduksi sel punca pluripoten (iPS) dan mempelajari penyembuhan luka hanyalah beberapa dari sekian banyak kegunaan fibroblas primer.

Sel kekebalan

Sel mononuklear darah tepi, disingkat PBMC, adalah sel mononuklear darah dengan inti sel bulat. Sel ini terutama mencakup limfosit dan monosit, yang memiliki fungsi penting dalam proses respons imun. Sel mononuklear darah tepi sering digunakan untuk mendiagnosis infeksi atau untuk mendeteksi kemungkinan perlindungan vaksinasi. Wawasan mengenai respons imun seluler yang dimediasi oleh sel T sering kali sangat penting.

Melanosit

Melanosit, sel kulit khusus yang memproduksi pigmen melanin, sangat membantu sebagai model untuk penelitian topik-topik seperti penyembuhan luka, toksisitas, melanoma, respons kulit terhadap radiasi ultraviolet (UV), penyakit kulit, dan kosmetik.

Sel punca

Sel punca memiliki potensi untuk berdiferensiasi menjadi berbagai jenis sel. Karena kemampuannya untuk berdiferensiasi, sel punca memberikan peluang baru untuk memodelkan jaringan dan kondisi kesehatan manusia.

Sel punca mesenkim

Sel punca mesenkimal, juga dikenal sebagai MSC, dapat diperoleh dari berbagai sumber manusia seperti sumsum tulang, lemak (jaringan adiposa), jaringan tali pusat (Wharton's Jelly), dan cairan ketuban (cairan yang mengelilingi janin) dan dapat dikembangkan secara in vitro. Sel punca stroma dewasa ini memiliki kemampuan untuk berkembang menjadi berbagai jenis sel. Beberapa jenis sel ini termasuk sel tulang, sel tulang rawan, sel otot, sel saraf, sel kulit, dan sel kornea.

Sel otot polos

Di dalam organ berongga, sel otot polos primer (SMC) melapisi bagian dalam dan menjadi perantara kontraktilitas. Selain kanker dan penyakit lainnya, SMC dapat digunakan untuk memodelkan fibrosis hipertensi.

Sel primer dan garis sel

Baik melalui mutasi spontan, seperti pada garis sel kanker yang ditransformasikan, atau melalui perubahan yang disengaja, seperti pada produksi buatan gen kanker, garis sel kontinu memiliki potensi untuk bereproduksi tanpa henti (diabadikan). Biasanya, garis sel kontinu lebih dapat diandalkan dan nyaman untuk ditangani daripada sel primer. Mereka dapat berkembang tanpa batas waktu dan menyediakan akses cepat ke data penting. Penggunaan garis sel kontinu memiliki keterbatasan tertentu, termasuk fakta bahwa mereka dimodifikasi secara genetik / ditransformasikan, yang mungkin mengubah fitur fisiologis dan tidak sesuai dengan kondisi in vivo, dan ini dapat berubah lebih lanjut dari waktu ke waktu dengan perjalanan yang signifikan.

Kemajuan dalam kultur sel primer

Sel primer memiliki reputasi yang terkenal karena sulit untuk dikerjakan. Namun, prosesnya menjadi lebih mudah daripada sebelumnya berkat perkembangan dalam kultur sel primer, ketersediaan sel primer komersial dengan protokol yang dioptimalkan sepenuhnya, dan teknik analisis baru yang membutuhkan lebih sedikit input.

Pergeseran dari kultur sel dua dimensi ke tiga dimensi dianggap sebagai tonggak utama dalam bidang ini. Arsitektur spesifik jaringan, interaksi sel-sel, dan pensinyalan mekanis/biokimia dapat dilemahkan dalam kultur 2D. Dengan demikian, ada batas atas nilai biologis dari kultur ini.

Di sisi lain, kultur sel 3D memungkinkan sel untuk berkembang dan berinteraksi dengan kerangka ekstraseluler 3D. Hal ini memungkinkan sel untuk berinteraksi satu sama lain dan matriks ekstraseluler, membuat kultur 3D lebih relevan secara fisiologis. Keakuratan metode ini dalam memprediksi respons in vivo telah menjadikannya revolusioner dalam bidang-bidang seperti penemuan dan pengembangan obat. Oleh karena itu, teknologi mutakhir, seperti organoid yang berasal dari pasien dan organ-on-a-chip, memberikan model yang sangat kontekstual untuk penyaringan dan pengembangan obat.

Pembuatan sel primer merupakan hambatan dalam kultur primer. Volume jaringan yang lebih besar biasanya diperlukan untuk mengatasi hal ini, yang dapat menjadi tantangan untuk dicapai. Namun, sensitivitas analitik yang lebih baik memberikan jalan ke depan. Sebagai contoh, kebutuhan untuk membiakkan sel primer dalam jumlah besar dapat dikurangi dengan menggunakan teknologi sel tunggal, yang meliputi pengurutan, western blotting, dan sitometri massa.

Prospek yang menjanjikan untuk kultur sel primer

Kesulitan kultur sel primer secara keseluruhan sedang dikurangi oleh kemajuan teknologi. Pada gilirannya, metode ini dengan cepat menggantikan metode lain sebagai standar emas dalam studi dan praktik biologi seluler dan molekuler. Pembuatan vaksin, penggantian organ, terapi sel punca, penelitian kanker, dan masih banyak lagi yang mendapatkan keuntungan besar dari kemajuan yang terus berlanjut dalam kultur sel primer.

Kiat dan trik kultur sel primer

Kebutuhan ekspansi sel

Dua metode yang paling umum untuk menumbuhkan sel primer adalah dalam suspensi atau pada permukaan (2D). Beberapa sel dapat mengapung bebas di dalam aliran darah tanpa harus melekat pada permukaan (misalnya yang berasal dari darah tepi). Garis sel yang berbeda telah direkayasa untuk berkembang dalam kultur suspensi, di mana mereka dapat mencapai kepadatan yang tidak dapat dicapai dalam kondisi pertumbuhan 2D. Sel primer yang membutuhkan tempat berlabuh untuk tumbuh secara in vitro disebut sel adheren dan termasuk yang ditemukan dalam jaringan padat. Untuk meningkatkan sifat adhesi dan memasok sinyal lain yang diperlukan untuk pertumbuhan dan diferensiasi, sel-sel ini biasanya dibudidayakan dalam bejana plastik datar yang tidak dilapisi, tetapi kadang-kadang menggunakan pembawa mikro. Pilihan terakhir ini dapat dilapisi dengan protein matriks ekstraseluler (seperti kolagen dan laminin). Media yang digunakan dalam kultur sel terdiri dari media dasar yang telah dilengkapi dengan faktor pertumbuhan dan sitokin yang tepat. Inkubator sel adalah jenis inkubator laboratorium khusus yang digunakan untuk menumbuhkan dan memelihara sel pada suhu dan campuran gas tertentu (biasanya 37°C, 5% CO2 untuk sel mamalia). Tergantung pada jenis sel yang dikultur, kondisi optimal bisa sangat berbeda. Tergantung pada jenis sel yang ditumbuhkan, media pertumbuhan yang optimal akan memiliki kombinasi faktor yang unik, termasuk tetapi tidak terbatas pada pH, konsentrasi glukosa, faktor pertumbuhan, dan keberadaan nutrisi lainnya.

Antibiotik dalam media pertumbuhan sangat penting selama pembentukan kultur primer untuk mencegah kontaminasi dari jaringan inang. Beberapa rejimen antibiotik memiliki kombinasi gentamisin, penisilin, streptomisin, dan amfoterisin B. Penggunaan antibiotik untuk jangka waktu yang lama tidak disarankan, namun, karena beberapa reagen (seperti amfoterisin B) dapat menjadi racun bagi sel dalam jangka panjang.

Sebagian besar sel primer mengalami penuaan dan berhenti membelah setelah sejumlah penggandaan populasi, sehingga sangat penting untuk menjaganya tetap hidup setelah diisolasi. Kelangsungan hidup sel dalam jangka panjang membutuhkan teknik kultur sel yang ahli dan kondisi kultur yang ideal (termasuk media yang tepat, suhu yang tepat, campuran gas yang tepat, pH yang tepat, konsentrasi faktor pertumbuhan yang tepat, adanya nutrisi, dan adanya glukosa). Karena banyak faktor pertumbuhan yang digunakan untuk melengkapi media diperoleh dari darah hewan (bahan yang berasal dari darah memiliki potensi kontaminasi), disarankan agar penggunaannya diminimalkan atau dihindari sama sekali. Penting juga untuk menggunakan teknik aseptik.

Subkultur dan pemeliharaan

Ketika sel dalam isolasi menempel pada permukaan cawan kultur, ini menandai dimulainya fase pemeliharaan. Penempelan biasanya terjadi 24 jam setelah inisiasi kultur. Sel harus disubkultur ketika mereka telah mencapai persentase pertemuan tertentu dan secara aktif bereplikasi. Karena sel pasca-konfluen dapat mengalami diferensiasi dan menunjukkan proliferasi yang lebih lambat setelah lewat, yang terbaik adalah mensubkultur kultur sel primer sebelum mencapai 100% pertemuan.

Subkultur dalam media segar mempertahankan pertumbuhan eksponensial sel yang bergantung pada jangkar. Subkultur monolayer mengganggu interaksi permukaan sel antar dan intraseluler. Konsentrasi rendah enzim proteolitik, seperti tripsin / EDTA, digunakan untuk mengekstrak sel primer yang melekat dari monolayer atau jaringan. Setelah dipisahkan dan diencerkan menjadi larutan sel tunggal, sel dihitung dan dipindahkan ke wadah kultur segar untuk dilekatkan kembali dan berkembang biak.

Kriopreservasi dan pemulihan

Kriopreservasi mengawetkan sel hidup dengan membekukannya pada suhu rendah. Kriopreservasi dan pencairan sel primer manusia mencegah kematian dan kerusakan sel selama penyimpanan dan penggunaan. Sel primer manusia dikriopreservasi menggunakan DMSO atau gliserol (pada suhu yang tepat dan dengan laju pembekuan yang terkendali). Proses pembekuan harus dilakukan secara progresif, pada suhu -1 °C setiap menit, untuk mencegah pembentukan kristal es. Penyimpanan jangka panjang membutuhkan nitrogen cair (-196 °C) atau suhu di bawah -130 °C.

Perendaman sel beku dalam penangas air bersuhu 37°C selama sekitar 1 hingga 2 menit adalah yang diperlukan untuk mencairkan sel kriopreservasi. Sel primer manusia tidak boleh disentrifugasi setelah dicairkan dari freezer (karena sel ini sangat sensitif terhadap kerusakan selama pemulihan dari kriopreservasi). Ini cocok untuk melapisi sel segera setelah pencairan, dan mendorong perlekatan dalam kultur selama 24 jam pertama setelah pelapisan. 1 Setelah sel primer kriopreservasi menempel, media yang digunakan harus dibuang (karena DMSO berbahaya bagi sel primer dan dapat menyebabkan penurunan viabilitas pasca-pencairan).