Techniques de dissociation des cultures cellulaires

La dissociation des cultures cellulaires est une étape critique dans la maintenance des cultures cellulaires. Elle consiste à détacher les cellules de leur surface de croissance pour permettre la sous-culture ou la récolte. Cette section présente deux méthodes principales : l'utilisation de tampons de dissociation sans enzymes et l'utilisation de réactifs enzymatiques.

1.utilisation de tampons de dissociation cellulaire sans enzymes

Cette méthode est douce et préserve l'intégrité cellulaire sans utiliser d'enzymes :

1. Préparation
   • Veiller à ce que tous les réactifs soient réchauffés à 37°C avant utilisation afin d'éviter tout choc aux cellules.
2. Élimination du milieu de croissance
   • Jeter l'ancien milieu de croissance du récipient de culture.
3. Rinçage
   • Rincer les monocouches cellulaires avec 5 ml de PBS sans calcium ni magnésium par flacon T75 ou boîte de 100 mm.
   • Agiter doucement le récipient pendant 30 à 60 secondes à température ambiante.
   • Aspirer et jeter la solution de rinçage.
   • Répéter cette étape de rinçage une fois de plus.
4. Dissociation
   • Ajouter environ 5 ml de tampon de dissociation cellulaire sans enzyme dans le récipient.
   • Agiter doucement à température ambiante pendant 1 à 2 minutes et vérifier la dissociation au microscope.
   • Tapoter le flacon ou la boîte contre la main pour déloger les cellules si nécessaire.
   • Si les cellules sont adhérentes, les laisser reposer à température ambiante pendant 2 à 5 minutes supplémentaires et tapoter à nouveau si nécessaire, en utilisant davantage de tampon de dissociation.
   • Une fois les cellules détachées, ajouter au moins 5 ml de milieu de croissance complet pour neutraliser le tampon de dissociation et remettre les cellules en suspension.
5. Contrôle de viabilité
   • Contrôler la viabilité des cellules pendant la sous-culture, en s'assurant qu'elle reste supérieure à 90 %.

2.utilisation d'autres réactifs pour la dissociation

Cette méthode permet d'utiliser divers réactifs de dissociation :

1. Élimination du milieu usagé
   • Jeter le milieu usagé du récipient de culture.
2. Lavage des cellules
   • Laver les cellules avec une solution saline équilibrée exempte de calcium et de magnésium, ou utiliser de l'EDTA.
   • Ajouter doucement la solution de lavage du côté opposé aux cellules et agiter le récipient pendant 1 à 2 minutes avant de jeter le liquide de lavage.
3. Dissociation
   • Appliquer 2 à 3 ml de la solution de dissociation choisie par 25 cm² de surface de croissance, en veillant à couvrir le feuillet cellulaire.
   • Incuber le récipient à 37°C et le secouer doucement. La dissociation se produit généralement en 5 à 15 minutes, selon la lignée cellulaire.
   • Pour les cellules récalcitrantes, il est possible d'accélérer le processus en tapotant le récipient.
   • Observer attentivement les cellules pour éviter toute surexposition et tout dommage potentiel.
4. Récolte des cellules
   • Une fois que les cellules sont complètement détachées, les laisser s'accumuler au fond du récipient en le mettant debout.
   • Ajouter le milieu complet, puis disperser et collecter les cellules en pipettant sur la couche cellulaire.
   • Compter et procéder à la sous-culture.

Dans les deux méthodes, il est important de déterminer les conditions optimales pour chaque lignée cellulaire par une observation empirique. Le processus doit préserver la viabilité des cellules, qui doit être régulièrement vérifiée pour dépasser 90 % pendant la sous-culture. Ces procédures constituent une base que les chercheurs peuvent adapter en fonction des exigences et des caractéristiques spécifiques de leurs lignées cellulaires.

3.vue d'ensemble des techniques de repiquage des cellules adhérentes

Pour que la subculture des cellules adhérentes soit efficace, il faut les détacher du récipient de culture. Diverses méthodes sont employées, chacune étant adaptée à des types de cellules et à des conditions différentes. Lors du choix d'une méthode de dissociation, il est essentiel de prendre en compte les besoins spécifiques de la lignée cellulaire et les objectifs de l'expérience. Un contrôle régulier de la viabilité des cellules, avec un objectif de plus de 90 % au moment de la sous-culture, est essentiel pour la santé et la productivité continues de la culture. Voici un aperçu de ces procédures :