Publié : 2023 | Dernière mise à jour : mai 2026
Guide complet sur la congélation des cellules : garantir la viabilité et la stérilité
La congélation des cellules est un processus essentiel dans la gestion des cultures cellulaires, garantissant le stockage et la conservation à long terme de lignées cellulaires précieuses. Que l'on travaille avec des cellules humaines ou animales, il est primordial de suivre des protocoles précis et de respecter des techniques d'asepsie rigoureuses pour réussir la cryoconservation.
Ce guide fournit des instructions détaillées sur le matériel et les réactifs nécessaires, ainsi que des procédures étape par étape pour congeler efficacement les cellules tout en préservant leur viabilité et leur stérilité. En respectant ces directives, les chercheurs peuvent stocker et réactiver ultérieurement leurs cultures cellulaires en toute confiance, avec une perte minimale de viabilité cellulaire, ce qui garantit l'intégrité et la fiabilité de leurs résultats expérimentaux.
Pour commencer, il est essentiel de mettre en place un environnement de travail stérile. Des techniques d'asepsie appropriées jouent un rôle crucial dans la prévention de la contamination et la garantie de la stérilité des cultures.
Technique d'asepsie
Respectez les techniques d'asepsie tout au long du processus afin de garantir la stérilité des cultures.
Processus complet de congélation des cellules
Cet organigramme fournit un guide visuel détaillé des étapes essentielles à la bonne congélation des cellules. Suivez ces procédures pour garantir une viabilité et une intégrité élevées des cellules pendant le processus de cryoconservation.
Préparation du milieu de congélation
Préparez le milieu de congélation cryoprotecteur en fonction du type de cellules :
- Cultures en milieu contenant du FBS : 90 % de FBS + 10 % de DMSO ou 70 % de milieu de croissance, 20 % de FBS et 10 % de DMSO
- Cellules nécessitant du glycérol : 90 % de FBS + 10 % de glycérol
Envisagez d'acheter notre milieu de congélation préformulé :
- Milieu de congélation CM-1 : pour les protocoles nécessitant un milieu contenant du sérum fœtal bovin (FBS)
- Milieu de congélation CM-ACF - sans sérum : pour une alternative sans FBS
Étiquetage et documentation
Étiquetez les cryotubes avec les informations suivantes :
- Date
- Nom du chercheur
- Numéro de cellule
- Numéro de passage
- Type de cellule
- Toute information supplémentaire (par exemple, modifications génétiques)
Préparation des cellules
Pour les cellules adhérentes :
- Surveiller les cellules jusqu’à ce qu’elles atteignent une confluence de 85 à 95 %
- Aspirer l'ancien milieu de culture
- Rincer la monocouche cellulaire avec du PBS sans calcium ni magnésium
- Détachez les cellules à l'aide d'Accutase, de trypsine ou de trypsine-EDTA et neutralisez-les avec du milieu de culture si nécessaire
- Transférer la suspension cellulaire dans un tube Falcon de 50 ml
Pour les cellules en suspension :
- Vérifier la densité et l'état des cellules au microscope
- Transférez la suspension cellulaire directement dans un tube Falcon de 50 ml
Comptage cellulaire et centrifugation
- Comptez les cellules à l'aide d'un hémocytomètre ou d'un compteur cellulaire automatisé
- Centrifuger à 300 g pendant 3 à 5 minutes à température ambiante pour obtenir un culot cellulaire
- Aspirer soigneusement le surnageant, en veillant à ne pas perturber le culot cellulaire
- Réchauffez le milieu de congélation préparé à 37 °C avant utilisation
Cryoconservation
- Remettre le culot cellulaire en suspension dans le milieu de congélation à une densité de 2,0 millions de cellules/mL pour les cellules adhérentes et de 5 millions de cellules/mL pour les cellules en suspension, ou à la concentration souhaitée
- Répartir 1,0 ml (ou plus si nécessaire) de la suspension cellulaire dans des cryotubes étiquetés
- Utilisez une méthode de congélation lente avant de transférer les cellules vers un stockage à long terme
- ? Méthode
- ? Étapes
-
❄️
Congélation manuelle -
1️⃣ Placez les cellules dans un milieu de congélation dans un congélateur à 4 °C pendant 40 minutes.
2️⃣ Transférez-les dans un congélateur à -80 °C pendant 24 heures.
3️⃣ Conservez les cellules dans de l'azote liquide pour une conservation à long terme. -
?
Utilisation de Mr. Frosty -
1️⃣ Préparer les cellules dans des cryotubes avec un milieu de congélation.
2️⃣ Placer les cryotubes dans le récipient Mr. Frosty.
3️⃣ Conserver à -80 °C pendant 24 heures avant de transférer dans de l'azote liquide. -
?
Congélateur à vitesse contrôlée -
1️⃣ Programmez l'appareil pour qu'il diminue progressivement la température.
2️⃣ Placez les cellules préparées dans le congélateur.
3️⃣ Une fois le cycle de congélation terminé, transférez les cellules dans de l'azote liquide.
- Conservez les cryotubes à des températures inférieures à -130 °C ou dans de l'azote liquide pour une conservation à long terme.
Matériel et réactifs
- Cryotubes de 1 à 2 ml
- Unité de congélation CoolCell® ou congélateur à vitesse contrôlée
- Milieu de congélation cryoprotecteur (par exemple, milieu cryoprotecteur DIY, CM-1, CM-ACF ou milieu spécialisé)
- Sérum fœtal bovin (FBS) ou milieux conditionnés
- DMSO ou glycérol
- PBS sans calcium ni magnésium
- Accutase, trypsine ou trypsine-EDTA (pour les cellules adhérentes)
- Tubes Falcon de 15 ml ou 50 ml
- Hémocytomètre ou compteur cellulaire automatisé
- Centrifugeuse