Nisäkässolujen viljely: Perusteet ja tekniikat
Nisäkässoluviljely on biologisen tutkimuksen kulmakivitekniikka, jonka avulla tutkijat voivat tutkia soluja kontrolloidussa ympäristössä elävien organismien ulkopuolella. Tässä prosessissa soluja eristetään kudoksista, niitä ylläpidetään tarkoin valvotuissa olosuhteissa ja niitä kasvatetaan erilaisia kokeellisia tarkoituksia varten. Nisäkässoluviljelmät ovat ratkaisevan tärkeitä soluprosessien ja sairauksien mekanismien ymmärtämisessä sekä uusien hoitomuotojen kehittämisessä, mukaan lukien kuolemattomia solulinjoja käyttävät hoidot
Keskeiset asiat:
- Soluja voidaan eristää kudoksista entsymaattisen pilkkomisen tai eksplanttiviljelymenetelmien avulla
- Primäärisolujen elinikä on rajallinen, kun taas kuolemattomat solulinjat voivat lisääntyä loputtomiin
- Viljelyolosuhteet, mukaan lukien kasvualustan koostumus, ovat kriittisiä solujen selviytymisen ja lisääntymisen kannalta
- Soluja voidaan kasvattaa suspensioviljelminä tai adheesioviljelminä solutyypin ja tutkimustarpeiden mukaan
- Yleisiä kasvatusmedioita ovat MEM, DMEM ja RPMI 1640, jotka on räätälöity tietyille solutyypeille
- Tyypilliset kasvuolosuhteet ovat 37 °C:n lämpötila, 5 % CO2 ja 95 % suhteellinen kosteus
- Seerumivaihtoehtoja, kuten ihmisen verihiutaleiden lysaattia (hPL), käytetään yhä useammin mahdollisten kontaminaatio-ongelmien välttämiseksi
Solujen eristämistekniikat
Soluviljelmän perustaminen alkaa solujen eristämisellä kudoksista. Tähän on olemassa useita menetelmiä, joista kukin soveltuu eri kudostyyppeihin ja tutkimustavoitteisiin. Verinäytteiden osalta solujen eristäminen on suhteellisen yksinkertaista, ja valkosolut ovat ensisijainen viljelykohde niiden kasvukyvyn vuoksi. Kiinteät kudokset vaativat monimutkaisempia eristystekniikoita. Yksi yleinen menetelmä on entsymaattinen pilkkominen, jossa entsyymejä, kuten kollagenaasia, trypsiiniä tai pronaasia, käytetään solunulkoisen matriisin hajottamiseen, jolloin yksittäiset solut vapautuvat suspensiona. Vaihtoehtoisesti tutkijat voivat käyttää eksplanttiviljelymenetelmää, jossa pienet kudospalat asetetaan suoraan kasvualustaan, jolloin solut voivat siirtyä ulos ja lisääntyä. Valinta näiden menetelmien välillä riippuu usein kudostyypistä, halutusta solupopulaatiosta ja aiotusta kokeellisesta käytöstä. On tärkeää huomata, että suoraan organismista eristettyjä soluja kutsutaan primaarisoluiksi, ja joitakin poikkeuksia, kuten kasvaimesta peräisin olevia soluja, lukuun ottamatta niillä on tyypillisesti rajallinen elinikä viljelyssä ennen kuin ne vanhenevat
Nisäkässolujen viljelyyn tarvittavat tuotteet
| Tuotteen nimi | Tuotenumero | Kategoria | Käyttökohde |
|---|---|---|---|
| DMEM, w: 4,5 g/l glukoosia, w: 4 mM L-glutamiinia, w: 1,5 g/l NaHCO3, w: 1,0 mM natriumpyruvaattia | 820300a | Viljelymediat | Yleiskäyttöinen väliaine eri nisäkässolutyypeille |
| DMEM:Ham's F12 (1:1), w: 3,1 g/L glukoosia, w: 1,6 mM L-glutamiinia, w: 15 mM HEPES, w: 1,0 mM natriumpyruvaattia, w: 1,2 g/L NaHCO3 | 820400a | Viljelymediat | Soveltuu monille nisäkässoluille, erityisesti epiteelisoluille |
| RPMI 1640, w: 2,1 mM stabiilia glutamiinia, w: 2,0 g/L NaHCO3 | 820700a | Viljelymedia | Käytetään yleisesti lymfaattisille soluille ja hybridisolulinjoille |
| Accutase | 830100 | Solujen dissosiaatio | Hellävarainen solujen irrotusliuos tarttuville soluille |
| Freeze Medium CM-1 | 800150 | Kryosäilytys | Nisäkässolujen jäädyttämiseen ja pitkäaikaiseen varastointiin |
| Jäädytysmedium CM-ACF, seerumiton | 800650 | Kryosäilytys | Eläinkomponentiton väliaine solujen pakastamiseen |
| PBS | 860015 | Puskuriliuos | Solujen pesuun ja pH-tasapainon ylläpitämiseen |
| Endoteelisolujen kasvualusta | 820731 | Erikoistunut väliaine | Optimoitu endoteelisolujen viljelyyn |
| Mykoplasmatestaus | 900159 | Laadunvalvonta | Välttämätön mykoplasmakontaminaation havaitsemiseksi viljelmissä |
| Solulinjojen todennus - Ihminen | 900154 | Laadunvalvonta | Varmentaa ihmisen solulinjojen identiteetin |
Tässä taulukossa on valikoima nisäkässolujen soluviljelyssä välttämättömiä tuotteita. Koko soluviljelytuotevalikoimamme, mukaan lukien erikoisalustat ja -reagenssit, on luokkasivullamme Media and Reagents.
Accutase on käyttövalmis, steriilisti suodatettu solujen irrotusliuos, joka on suunniteltu hellävaraiseksi vaihtoehdoksi trypsiinille/EDTA:lle kiinnittyneiden nisäkässolujen irrottamiseksi tavallisista kudosviljelymuovivälineistä ja tarttuviksi pinnoitetuista pinnoista. Se yhdistää proteolyyttisen ja kollageenolyyttisen entsyymiaktiivisuuden tasapainotetussa suolaliuoksessa tehokkaan mutta hallitun irrottamisen aikaansaamiseksi, säilyttäen solupinnan proteiinit ja tukien korkeaa elinkelpoisuutta siirron jälkeen sekä nopeaa uudelleenkiinnittymistä.
Accutase-valmiste perustuu Dulbeccon fosfaattipuskuroituun suolaliuokseen (DPBS), jossa on EDTA:ta ja fenolipunainen visuaalisena pH-indikaattorina. Entsyymit ovat peräisin muista kuin nisäkkäistä tai bakteereista, minkä vuoksi Accutase sopii erityisen hyvin kantasolututkimukseen, rokotetyönkulkuihin ja muihin sovelluksiin, joissa eläin
- tai mikrobiperäisten kontaminanttien määrä on minimoitava. Liuos estää itsensä 37 °C:ssa, joten irrottamisen jälkeen ei tarvita neutraloivia reagensseja tai seerumia sisältävää elatusainetta – solut voidaan siirtää suoraan tuoreeseen elatusaineeseen.
Tärkeimmät ominaisuudet
Käyttövalmis 1x steriilisuodatettu neste – laimentamista tai rekonstituointia ei tarvita
Yhdistetty proteolyyttinen ja kollageenolyyttinen entsyymiaktiivisuus hellävaraista irrottamista varten
Jokainen erä on standardoitu määriteltyyn irrottamisaktiivisuuteen eräkohtaisen yhdenmukaisuuden varmistamiseksi
Entsyymit eivät ole peräisin nisäkkäistä tai bakteereista
Inhiboi itsensä 37 °C:ssa – neutralointiliuosta ei tarvita
Valmistettu Dulbeccon PBS:ssä EDTA:n kanssa
Sisältää fenolipunaisen visuaalisena pH-indikaattorina
pH 6,8–7,8
Tyypillisiä käyttökohteita
Accutase irrottaa hellävaraisesti monenlaisia kiinnittyneitä ja herkkiä solutyyppejä, mukaan lukien ihmisen alkion kantasolut (hESCs), ihmisen indusoidut pluripotentit kantasolut (iPSCs), hermoston kantasolut, primaariset neuronit sekä rutiinikäytössä olevat kiinnittyneet solulinjat, kuten HeLa, HEK 293, CHO, MDCK, Vero, NIH/3T3, BHK-21 ja A549. Tyypillisiä käyttötapauksia ovat:
Adheesiivisten nisäkässolujen rutiininen aliviljely ja siirto
HES-solujen, iPS-solujen ja muiden herkkien solulinjojen hellävarainen yksittäisten solujen irrottaminen
Näytteiden valmistelu virtaussytometriaa ja FACS-analyysiä varten
Solupintamarkkerien analysointi, jossa epitopin eheys on tärkeää
Solujen migraatio-, proliferaatio
- ja apoptoosimääritykset
Lepotilan määritykset seerumin puutteella ja onkogeenien transfektiotutkimukset
Kasvainsolujen ja hermostopäällysteen solujen migraatiomääritykset
Tuotannon laajentaminen bioreaktoriprosesseissa
Rutiinityössä levitä noin 10 ml Accutasea 75 cm2:n viljelypinta-alaa kohti ja inkuboi 5–10 minuuttia huoneenlämmössä. Optimaalinen inkubointiaika on määritettävä kullekin solulinjalle erikseen, eikä se saa ylittää yhtä tuntia. Ennen lisäystä huuhtele solukerros Ca2+/Mg2+-vapaalla suolaliuoksella, kuten kalsiumia ja magnesiumia sisältämättömällä DPBS:llä, jotta poistat jäljellä olevan seerumin ja kaksiarvoiset kationit.
Käsittely ja säilytys
Säilytä avaamatonta pulloa pakastettuna -15 °C:ssa tai sitä alemmassa lämpötilassa. Sulata joko huoneenlämmössä tai yön yli +2 °C:ssa – +8 °C:ssa. Älä sulata Accutasea 37 °C:n vesihauteessa, sillä korkeat lämpötilat heikentävät entsyymiaktiivisuutta. Sulatuksen jälkeen liuosta voidaan säilyttää enintään 2 kuukautta +2 °C:ssa – +8 °C:ssa; älä säilytä huoneenlämmössä. Älä lämmitä reagenssia 37 °C:seen ennen käyttöä – lisää se suoraan pestyihin soluihin huoneenlämmössä. Pitkän säilyvyyden takaamiseksi suositellaan kertakäyttöisten alikvojen käyttöä, jotta vältytään toistuvilta sulatusjaksoilta. Työskentele aina aseptisissa olosuhteissa.
Laatu
Valmistettu tiukkojen laatustandardien mukaisesti. Jokainen Accutase-erä on steriilisuodatettu ja testattu steriilisyyden, pH:n, ulkonäön ja dissosiaatioaktiivisuuden osalta, jotta varmistetaan erästä toiseen yhdenmukainen ja toistettava suorituskyky.
Tuotetiedot
Tekniset tiedot
Yksityiskohdat
TuotetyyppiSolujen irrottamis-/dissosiaatioreagenssi
MuotoSteriilisuodatettu neste, käyttövalmis
Tilavuus100 ml
Käyttökonsentraatio1x (käyttövalmis)
EntsyymiaktiivisuusYhdistetty proteolyyttinen ja kollageenolyyttinen
Entsyymin alkuperäEi-nisäkäs
- ja ei-bakteeriperäinen
PuskurijärjestelmäDulbeccon PBS ja EDTA
pH-indikaattoriFenolipunainen
pH-alue6,8 – 7,8
UlkonäköKirkas, vaaleanpunainen tai oranssi liuos
Säilytyslämpötila-15 °C tai alle
Stabiilius sulatuksen jälkeenEnintään 2 kuukautta +2 °C – +8 °C:ssa
Suositeltu käyttömäärä~10 ml / 75 cm² viljelypintaa
Tyypillinen inkubointiaika5–10 minuuttia huoneenlämmössä
KuljetusolosuhteetPakastettu kuivajäällä
KäyttötarkoitusVain tutkimuskäyttöön ja jatkovalmistukseen
Koostumus (koostumus litraa kohti)
Komponentti
Pitoisuus (mg/l)
Epäorgaaniset suolat
Natriumkloridi (NaCl)8000,00
Dinatriumvetyfosfaatti (Na2HPO4)1150,00
Kaliumkloridi (KCl)200,00
Kaliumdihydrogeenifosfaatti (KH2PO4)200,00
Muut komponentit
EDTA · 4Na (tetranatrium-EDTA)220,00
Fenolipunainen3,00
Patentoitu entsyymiseos (proteolyyttinen ja kollageenolyyttinen aktiivisuus)1x
Accutase on Innovative Cell Technologies, Inc:n rekisteröity tavaramerkki.
Fosfaattipuskuroitu suolaliuos (PBS) on laajalti käytetty puskuriliuos biologisessa ja kemiallisessa tutkimuksessa. Sillä on ratkaiseva merkitys pH-tasapainon ja osmolaarisuuden ylläpitämisessä erilaisten kokeellisten toimenpiteiden aikana, mukaan lukien kudosten käsittely ja soluviljely. PBS-liuoksemme on valmistettu huolellisesti erittäin puhtaista ainesosista vakauden ja luotettavuuden varmistamiseksi jokaisessa kokeessa. PBS-liuoksemme osmolaarisuus ja ionipitoisuudet jäljittelevät läheisesti ihmiskehon osmolaarisuutta ja ionipitoisuuksia, joten se on isotoninen ja myrkytön useimmille soluille.
PBS-liuoksemme koostumus
PBS-liuoksemme on pH-säädetty sekoitus erittäin puhdasta laatua olevia fosfaattipuskureita ja suolaliuoksia. Se sisältää 1-kertaisena käyttökonsentraationa:
8000 mg/l natriumkloridia (NaCl)
200 mg/l kaliumkloridia (KCl)
1150 mg/L natriumfosfaattidibasinen vedetön (Na2HPO4)
200 mg/L Kaliumfosfaatti, monobasinen, vedetön (KH2PO4)
Tämä koostumus takaa optimaalisen pH
- ja ionitasapainon, joka soveltuu monenlaisiin biologisiin sovelluksiin.
PBS-liuoksemme käyttökohteet
PBS-liuoksemme soveltuu erinomaisesti erilaisiin biologisen tutkimuksen sovelluksiin. Sen isotonisten ja myrkyttömien ominaisuuksien ansiosta se soveltuu aineiden laimentamiseen ja solusäiliöiden huuhteluun. EDTA:ta sisältävät PBS-liuokset irrottavat tehokkaasti kiinnittyneet ja kyhmyiset solut. PBS:ään ei kuitenkaan pitäisi lisätä kaksiarvoisia metalleja, kuten sinkkiä, sillä ne voivat aiheuttaa saostumista. Tällaisissa tapauksissa suositellaan Goodin puskureita. Lisäksi PBS-liuoksemme on hyväksyttävä vaihtoehto virusten kuljetusalustalle RNA-virusten, kuten SARS-CoV-2:n, kuljetuksessa ja säilytyksessä.
Laadunvalvonta
Steriilisuodatettu
Varastointi ja säilyvyys
Säilytetään +2 °C:n ja +25 °C:n välillä valolta suojattuna.
Kun se on avattu, säilytä 2°C-25°C:ssa ja käytä 24 kuukauden kuluessa.
Kuljetusolosuhteet
Ympäristön lämpötila
Huolto
Säilytettävä jääkaapissa +2°C
- +8°C:ssa pimeässä. Vältä pakastamista ja usein tapahtuvaa lämmittämistä +37°C:een, koska se heikentää tuotteen laatua.
Älä lämmitä väliaineen lämpötilaa yli 37°C äläkä käytä kontrolloimattomia lämmönlähteitä, kuten mikroaaltolaitteita.
Jos väliaineesta käytetään vain osa, poista tarvittava määrä ja lämmitä se huoneenlämpöiseksi ennen käyttöä.
Koostumus
Luokka
Ainesosat
Pitoisuus (mg/l)
Suolat
Kaliumkloridi
200
Kaliumfosfaattimonobasinen vedetön kaliumfosfaatti
200
Natriumkloridi
8000
Vedetön dibasinen natriumfosfaatti
1150
Analyysimenetelmä
CLS tarjoaa sekä lyhyen että pitkän aikavälin testejä mykoplasman osoittamiseksi. Ensin mainitussa tapauksessa näytteet testataan välittömästi niiden saapumisen jälkeen, kun taas jälkimmäisessä tapauksessa soluviljely aloitetaan ja solut testataan 14 päivän antibioottivapaan viljelyn jälkeen. Mykoplasmatestaus suoritetaan käyttämällä kaksipisteistä osoitusjärjestelmää, jossa käytetään sekä PlasmoTest™
- Mycoplasma Detection Kit (Invivogen) että Certus QC
- mycoADVANCED detection kit (Certus).
Näytteet
Pikatestiä varten on toimitettava vähintään 50 µl solususpensiota, joka sisältää 50 000 solua. Solususpensio voidaan toimittaa huoneenlämmössä.
Premium-testiä varten toimitetaan vähintään 1 miljoona solua sopivassa pakastusmediassa, jotta varmistetaan kestävä ja terve viljely solujen viljelyä ja myöhempää testausta varten. Toimita näytteet kuivajäässä.
Täytä Mycoplasma Testing Sample Form -näytelomake ja liitä se näytelähetyksen mukana.
Kolorimetrinen raportointitesti
Tämä testi on solupohjainen kolorimetrinen määritys. Mykoplasman läsnä ollessa reportterisolulinja käynnistää signaalikaskadin, joka saa aikaan värinmuutoksen väliaineessa punaisesta siniseksi. Määritys tehdään 96-kuoppaisissa monikuoppalevyissä. Signaalit havaitaan mikrolevyn spektrofotometrillä 620-655 nm:ssä. Kaikki mykoplasma
- ja akoleplasmalajit, mutta myös muut soluviljelmissä esiintyvät epäpuhtaudet, kuten bakteerit, havaitaan.
Isoterminen monistus
Isoterminen amplifikaatio on nopea ja luotettava testi, joka perustuu mykoplasmaspesifisen DNA:n isotermiseen amplifikaatioon yhdistettynä reaaliaikaiseen havaitsemiseen DNA:n interkaloivan väriaineen avulla. Testillä voidaan havaita kuusi yleisintä lajia, jotka muodostavat > 95 prosenttia kontaminaatioista: M. orale, M. hyorhinis, M. arginini, M. fermentans, M. hominis ja A. laidlawii. Sekvenssihomologian vuoksi myös muita mykoplasmalajeja havaitaan (M.pneumoniae, M.gallisepticum ja M.synoviae). Jotta voidaan tunnistaa, onko näyte mykoplasmapositiivinen vai -negatiivinen, tutkitaan sulamislämpötila (Tm).
Johtopäätökset: Nisäkässoluviljelyn keskeinen rooli nykyaikaisessa tutkimuksessa
Nisäkässoluviljely on mullistanut biologisen ja lääketieteellisen tutkimuksen, sillä se on tarjonnut tutkijoille tehokkaita välineitä monimutkaisten soluprosessien, tautimekanismien ja mahdollisten terapeuttisten toimenpiteiden tutkimiseen. Tästä tekniikasta on tullut välttämätön osa nykyaikaista tieteellistä työkalupakkia aina primaarisolujen eristämisestä kuolemattomien solulinjojen kehittämiseen
Nisäkässoluviljelyn matka alkaa huolellisilla eristystekniikoilla, jatkuu solujen huolellisella ylläpitämisellä erikoistuneissa väliaineissa ja huipentuu laajaan valikoimaan sovelluksia eri tutkimusaloilla. Olipa kyse sitten syöpätutkimuksesta, lääkkeiden löytämisestä tai solubiologian perustutkimuksesta, kyky kasvattaa ja manipuloida nisäkässoluja in vitro on avannut ennennäkemättömiä mahdollisuuksia tieteelliseen tutkimukseen
Nisäkässoluviljelyn onnistumisen kannalta keskeisiä ovat tarkoin valvotut olosuhteet, joissa soluja ylläpidetään. Kasvatusmedian koostumuksesta inkubaattoreiden tarkkoihin ympäristöparametreihin kaikki osa-alueet on optimoitu jäljittelemään solujen luonnollisia olosuhteita mahdollisimman tarkasti. Tämä yksityiskohtiin kiinnitetty huomio takaa kokeiden luotettavuuden ja toistettavuuden, joka on hyvän tieteellisen käytännön kulmakivi
Immortalisoitujen solulinjojen, kuten laajalti käytettyjen HeLa-solujen, kehittäminen on laajentanut soluviljelyn mahdollisuuksia entisestään. Nämä solulinjat tarjoavat johdonmukaisia, helposti saatavilla olevia solumalleja, jotka ovat nopeuttaneet tutkimusta useilla tieteenaloilla
Tulevaisuutta ajatellen nisäkässolujen soluviljely kehittyy edelleen. Edistykset 3D-viljelytekniikoissa, organoidien kehittämisessä ja kemiallisesti määriteltyjen väliaineiden käytössä laajentavat soluviljelyn mahdollisuuksia. Tämä kehitys lupaa tuoda in vitro -mallit entistä lähemmäksi in vivo -järjestelmien monimutkaisuutta, mikä saattaa mullistaa lääkkeiden löytämisen, yksilöllisen lääketieteen ja ihmisen biologian ymmärtämisen
Yhteenvetona voidaan todeta, että nisäkässoluviljely on edelleen dynaaminen ja olennainen tekniikka biotieteellisessä tutkimuksessa. Sen jatkuvalla jalostamisella ja soveltamisella on epäilemättä ratkaiseva merkitys biologian ja lääketieteen kiireellisimpien kysymysten ratkaisemisessa, ja se edistää tieteellistä edistystä tulevina vuosina