Bioprinttaus solulinjojen avulla: 2D:stä 3D-tulostettuihin kudosrakenteisiin

Kolmiulotteinen bioprinttaus on vallankumouksellinen tekniikka, joka mahdollistaa elävien solujen, biomateriaalien ja bioaktiivisten molekyylien tarkan tilallisen sijoittamisen, jotta voidaan valmistaa kudosrakenteita, joilla on määritelty arkkitehtuuri ja jotka jäljittelevät natiivia kudosorganisaatiota. Cytionissa tiedämme, että vakiintuneet solulinjat tarjoavat bioprinting-sovelluksissa merkittäviä etuja verrattuna primaarisoluihin, kuten rajoittamaton laajentumiskapasiteetti, hyvin karakterisoitu käyttäytyminen, tasainen laatu ja vähäisemmät eettiset rajoitukset. Siirtyminen perinteisestä kaksiulotteisesta monokerrosviljelystä soluja ja solulinjoja hyödyntäviin kolmiulotteisiin biopainettuihin konstruktioihin edellyttää huolellista harkintaa biosinkkien formuloinnissa, painatusmenetelmissä, solujen reaktioissa mekaaniseen rasitukseen laskeutumisen aikana ja painatuksen jälkeisissä kypsytysprotokollissa. Tämä edistyksellinen valmistusmenetelmä mahdollistaa monimutkaisten kudosmallien valmistamisen lääkeseulontoja, sairauksien mallintamista ja biologista perustutkimusta varten, ja solujen koostumusta, tilajärjestelyjä ja mikroarkkitehtuurin piirteitä voidaan hallita ennennäkemättömällä tavalla.

Biomusteen formulointi ja reologiset ominaisuudet

Bioaineksen formulointi on kriittisin tekijä, joka määrittää bioprinttauksen onnistumisen, ja se edellyttää huolellista tasapainoa painettavuusominaisuuksien, solujen yhteensopivuuden ja painamisen jälkeisen rakenteellisen eheyden välillä. Ihanteelliset bioainesmateriaalit käyttäytyvät leikkausohenteisesti, jolloin viskositeetti pienenee ekstruusiossa käytetyn leikkausjännityksen vaikutuksesta ja palautuu nopeasti laskeutumisen jälkeen, jotta tulostetun rakenteen uskollisuus säilyy. Viskositeetti vaihtelee tyypillisesti 30-6×10⁷ mPa-s tulostusmenetelmästä riippuen, ja ekstruusiopohjaiset järjestelmät edellyttävät korkeampaa viskositeettia (≥1000 mPa-s) muodon säilyttämiseksi verrattuna mustesuihkutekniikkaan, joka edellyttää matalaa viskositeettia (3-12 mPa-s) pisaranmuodostuksen vuoksi. Solupitoisuus bioaineksissa vaihtelee tyypillisesti välillä 1 × 10⁶ - 2 × 10⁷ solua millilitrassa, jolloin kudoksen muodostumiseen riittävä solutiheys ja tulostussuuttimien mahdollinen tukkeutuminen sekä liiallinen materiaalin viskositeetti ovat tasapainossa. Yleisiä biomusteen perusmateriaaleja ovat alginaatti, gelatiini, gelatiinimetakrylaatti (GelMA), hyaluronihappo ja agaroosi, jotka usein yhdistetään monikomponenttisiksi koostumuksiksi mekaanisten ominaisuuksien, hajoamiskinetiikan ja biologisen aktiivisuuden optimoimiseksi. Cytionin solujen ja solulinjojen osalta biomusteen koostumuksen empiirinen optimointi on välttämätöntä, jotta voidaan ottaa huomioon solutyyppikohtaiset adheesiovaatimukset ja herkkyys mekaaniselle rasitukselle tulostuksen aikana.

Ekstruusiopohjaiset bioprinttausjärjestelmät

Ekstruusiopohjainen bioprinttaus on laajimmin käytössä oleva tekniikka, koska sen laitekustannukset ovat suhteellisen alhaiset, se on yhteensopiva korkeaviskositeettisten biosinkkien ja suurten solutiheyksien kanssa ja se on skaalautuva ja mahdollistaa senttimetrien kokoisten konstruktioiden valmistamisen. Nämä järjestelmät annostelevat soluja sisältävän materiaalin jatkuvia filamentteja halkaisijaltaan 100-500 mikrometrin kokoisten sylinterimäisten suuttimien läpi, ja laskeutumista ohjataan paineilmatoimisella paineella, mekaanisella ruuvivetoisella siirtymisellä tai mäntäpohjaisella toimilaitteella. Ensisijainen huolenaihe on solujen kokema leikkausjännitys suuttimen puristamisen aikana, jonka suuruus riippuu suuttimen halkaisijasta, käytetystä paineesta ja biomusteen viskositeetista nestemekaniikan periaatteiden mukaisesti. Solut kokevat suuttimen seinämässä huippuvääntöä, joka voi aiheuttaa kalvovaurioita, heikentää elinkelpoisuutta ja muuttaa geeniekspressioprofiilia, jos se on liiallinen. Optimointi edellyttää suuttimen halkaisijan ja ekstruusiopaineen tasapainottamista, jotta saavutetaan haluttu resoluutio ja säilytetään solujen elinkelpoisuus tyypillisesti yli 80 %. Monimateriaaliset bioprinttausominaisuudet mahdollistavat eri solutyyppien ja materiaalien samanaikaisen tai peräkkäisen laskeutumisen, mikä helpottaa heterogeenisten kudosrakenteiden valmistusta alueellisesti määritellyillä koostumuksilla. Koaksiaaliset suutinkonfiguraatiot mahdollistavat onttojen putkimaisten rakenteiden suoran tulostamisen, jotka ovat hyödyllisiä verisuonituksessa, ja ydinmateriaali poistetaan myöhemmin, jotta voidaan luoda endoteelisoluilla vuorattuja avoimia luumeneita.

Mustesuihku- ja pisarapohjainen bioprinttaaminen

Mustesuihkubiotulostustekniikat, jotka on mukautettu kaupallisista asiakirjojen tulostusjärjestelmistä, mahdollistavat pikolitran tilavuuden suuruisten soluja sisältävien pisaroiden täsmällisen laskeutumisen, mikä mahdollistaa korkean resoluution tilakuvioinnin ja nopeat tulostusnopeudet, jotka soveltuvat suurten läpimenojen sovelluksiin. Termiset mustesuihkujärjestelmät tuottavat höyrykuplia resistiivisten lämmityselementtien avulla, jolloin syntyy painepulsseja, jotka paiskaavat pisaroita tulostuspäästä, kun taas pietsosähköiset järjestelmät hyödyntävät pietsosähköisten kiteiden jännitteen aiheuttamaa muodonmuutosta tuottaakseen akustisia aaltoja, jotka liikuttavat pisaroita. Solujen elinkelpoisuuteen liittyvät huolenaiheet rajoittivat aluksi lämpömustesuihkutekniikoiden käyttöönottoa lämpötilan ohimenevien nousujen vuoksi, mutta optimoidut järjestelmät osoittavat, että lämpövauriot ovat minimaalisia, kun lämpötilat pidetään kriittisten kynnysarvojen alapuolella ja altistumisen kesto rajoittuu mikrosekuntiin. Pietsosähköisillä järjestelmillä vältetään lämpörasitus, mutta ne vaativat akustisten parametrien huolellista virittämistä, jotta pisaranmuodostuksen luotettavuus ja soluihin kohdistuva mekaaninen rasitus saadaan tasapainoon. Mustesuihkujärjestelmissä käytettävän biomusteen viskositeetin on pysyttävä alle noin 12 mPa-s, jotta pisaranmuodostus olisi mahdollista, mikä rajoittaa materiaalivaihtoehtoja verrattuna ekstruusiopohjaisiin lähestymistapoihin ja edellyttää tyypillisesti laskeutumisen jälkeistä silloittamista rakenteellisen vakauden saavuttamiseksi. Mustesuihkubiotulostuksen suuri tarkkuus ja läpimeno tekevät siitä erityisen sopivan sovelluksiin, joissa tarvitaan useiden solutyyppien määriteltyjä tilakuvioita, kuten yhteiskulttuurimalleja tai gradienttien luomista lääkeseulontoja varten HeLa-soluilla ja muilla vakiintuneilla solulinjoilla.

Laseravusteinen bioprinttaus ja korkean resoluution kuviointi

Laseravusteisella bioprinttauksella (LAB), jota kutsutaan myös laserindusoiduksi eteenpäin siirtämiseksi, saavutetaan bioprinttaustekniikoista korkein alueellinen resoluutio, joka mahdollistaa yksittäisten solujen tai pienten soluryhmien asettamisen mikrometrin tarkkuudella. LAB-järjestelmä koostuu pulssitetusta laserlähteestä, energiaa absorboivalla materiaalilla ja soluja sisältävällä biomusteella päällystetystä luovuttajalasista ja vastaanottajasta, joka on sijoitettu lähelle luovuttajalasia luovuttajalasiin nähden. Keskitetyt laserpulssit höyrystävät energiaa absorboivan kerroksen, mikä synnyttää korkeapaineisia kuplia, jotka työntävät soluja sisältäviä pisaroita luovuttajalevyltä vastaanottavaan substraattiin tarkan tilakontrollin avulla. Optimoiduilla parametreilla voidaan saavuttaa 10-50 mikrometrin resoluutio ja yli 95 prosentin solujen elinkelpoisuus, mikä on huomattavasti parempi kuin muilla bioprinttausmenetelmillä. LAB:n suuttimeton luonne eliminoi puristamiseen liittyvän leikkausjännityksen ja estää tukkeutumisongelmat, jotka vaivaavat suuttimiin perustuvia järjestelmiä, kun tulostetaan korkeaviskositeettisia tai tiheitä solususpensioita. LAB-järjestelmät edellyttävät kuitenkin kehittyneitä optisia laitteita ja laserparametrien, kuten aallonpituuden, pulssin keston, energiatiheyden ja polttopisteen koon, huolellista optimointia, jotta tulostuksen luotettavuus ja solujen elinkelpoisuus saadaan tasapainoon. Kyky tulostaa soluja yksittäisen solun tarkkuudella tekee LAB-järjestelmästä erityisen arvokkaan sovelluksissa, jotka edellyttävät tarkkaa tilajärjestelyä, kuten neuronien ja solujen yhteiskulttuureissa tai solujen ja solujen välisen signaloinnin tutkimisessa määritellyillä etäisyyksillä.

Stereolitografia ja digitaalinen valonkäsittely

Stereolitografiassa (SLA) ja digitaalisessa valonkäsittelyssä (DLP) bioprinttauksessa hyödynnetään soluja sisältävien valoyhteensitoutuvien hydrogeelien kerros kerrokselta tapahtuvaa fotopolymerisaatiota monimutkaisten kolmiulotteisten geometrioiden valmistamiseksi nopeasti 25-100 mikrometrin resoluutiolla. Toisin kuin laskeutumiseen perustuvissa menetelmissä, joissa rakenteita rakennetaan peräkkäisellä materiaalin sijoittelulla, valoon perustuvissa menetelmissä kokonaisia kerroksia silloitetaan samanaikaisesti, mikä lyhentää huomattavasti monimutkaisten geometrioiden valmistusaikaa. DLP-järjestelmät heijastavat valokuvioita, jotka vastaavat kokonaisia kerrosten poikkileikkauksia digitaalisten mikropeilirakenteiden avulla, kun taas SLA-järjestelmät skannaavat fokusoituja lasersäteitä kerrosmallien jäljittämiseksi, ja DLP-järjestelmät tarjoavat yleensä nopeampia tulostusnopeuksia. Valon kanssa ristisilloitettavat bioainekset sisältävät fotoinitiaattoreita, jotka tuottavat valolle altistuessaan reaktiivisia lajeja, jotka laukaisevat hydrogeelin esiasteiden, kuten gelatiinimetakrylaatin, polyetyleeniglykolidiakrylaatin tai hyaluronihappometakrylaatin, polymerisaation tai ristisilloituksen. Solujen elinkelpoisuus riippuu ratkaisevasti fotoinitiaattorin pitoisuudesta, valon intensiteetistä ja valotuksen kestosta, sillä fotoinitiaation aikana syntyvät reaktiiviset happilajit voivat vahingoittaa solujen komponentteja. Optimoidut järjestelmät saavuttavat 75-95 prosentin elinkelpoisuuden painamisen jälkeen käyttämällä soluyhteensopivia näkyvän valon fotoinitiaattoreita (litiumfenyyli-2,4,6-trimetyylibentsoyylifosfinaatti), alhaisia fotoinitiaattorikonsentraatioita (0,05-0,5 %) ja minimoimalla valolle altistumisen. Kyky valmistaa nopeasti monimutkaisia verisuoniverkostoja ja monimutkaisia kudosarkkitehtuureja tekee SLA/DLP:stä erityisen lupaavan elimen-siru-sovelluksiin ja kudostekniikkaan, vaikka se edellyttää yhteensopivia valoyhteensitoutuvia materiaaleja ja valopolymerisaatiokinetiikan huolellista hallintaa.

Tulostuksen jälkeinen kypsytys ja viljelyn optimointi

Biopainetuilla konstruktioilla on välittömästi valmistuksen jälkeen tyypillisesti rajallinen solujen ja solujen välinen vuorovaikutus, solunulkoisen matriksin vähäinen laskeutuminen ja mekaaniset ominaisuudet, joita hallitsee pikemminkin biosinkkimateriaali kuin biologiset kudosominaisuudet. Tulostuksen jälkeinen kypsytysviljely on välttämätöntä, jotta solut voivat levitä alun perin pallomaisesta morfologiastaan, solu-soluliitokset muodostuvat, endogeeninen solunulkoinen matriisi erittyy ja organisoituu ja kudospesifiset toiminnot kehittyvät. Viljelyn kestovaatimukset vaihtelevat päivistä viikkoihin solutyypin, rakenteen monimutkaisuuden ja aiotun käyttötarkoituksen mukaan, ja aineenvaihdunnallisesti aktiiviset solut vaativat tyypillisesti tiheämpää väliaineen vaihtoa ravinteiden ehtymisen ja aineenvaihduntatuotteiden kertymisen estämiseksi. Soluviljelyä voidaan nopeuttaa kypsyttämällä soluviljelyaineita kudosspesifisillä kasvutekijöillä, hormoneilla ja muilla bioaktiivisilla molekyyleillä ja parantamalla toiminnallisia ominaisuuksia, vaikka erityisvaatimukset riippuvat solutyypistä ja halutusta fenotyypistä. Mekaaninen stimulaatio perfuusiovirtauksen, syklisen venytyksen tai puristuksen avulla edistää kudoksen kypsymistä ja toiminnallista kehitystä mekaanisesti herkkien solutyyppien osalta jäljittelemällä fysiologisia kuormitusolosuhteita. Biohajoavia komponentteja sisältävien bioinkkien osalta mekaanisten ominaisuuksien ajallinen kehitys heijastaa sekä matriisin hajoamista että solujen erittämän matriisin kertymistä, mikä edellyttää huolellista tasapainoa hajoamiskinetiikan ja matriisin kerrostumisnopeuden välillä. Kypsymisen seuraaminen morfologisen arvioinnin, geeniekspressioanalyysin ja toiminnallisten määritysten avulla mahdollistaa viljelyolosuhteiden optimoinnin ja sopivien ajankohtien määrittämisen biopainettujen kudosmallien kokeellista tutkimista varten.

Sovellukset lääkkeiden seulonnassa ja sairauksien mallintamisessa

Biopainetut kudoskonstruktiot, joissa käytetään Cytionin luettelosta löytyviä vakiintuneita solulinjoja, tarjoavat tehokkaita alustoja lääkeaineiden seulontaan ja sairauksien mallintamiseen, joilla on parempi fysiologinen merkitys kuin perinteisillä kaksiulotteisilla viljelmillä. Kyky kontrolloida tarkasti solujen koostumusta, tilajärjestelyjä ja mikroarkkitehtuurin ominaisuuksia mahdollistaa rakenne-toimintasuhteiden systemaattisen tutkimisen ja sellaisten toistettavien kudosmallien tuottamisen, jotka soveltuvat korkean läpimenon seulontatyönkulkuihin. Syöpämallit, joihin on painettu bioprintattuna kasvainsolulinjoja, strooman fibroblasteja ja endoteelisoluja määritellyissä tilajärjestelyissä, jäljittelevät paremmin kasvaimen mikroympäristön ominaisuuksia, kuten hypoksisia gradientteja, heterogeenista lääkeaineiden tunkeutumista ja strooman ja kasvaimen välisiä vuorovaikutuksia, jotka vaikuttavat terapeuttiseen vasteeseen. Maksakudosmallit, joihin sisältyy hepatosyyttisolulinjoja määritellyissä arkkitehtuurissa, osoittavat tavanomaisiin viljelmiin verrattuna parempaa sytokromi P450:n ilmentymistä ja aineenvaihdunnan toimintaa, mikä parantaa ennustetarkkuutta hepatotoksisuuden seulonnassa. Biopainetut hermokudosmallit, joissa on tarkka hermosolu-glia-organisaatio, mahdollistavat neurodegeneratiivisten sairauksien mekanismien tutkimisen ja neuroprotektiivisten yhdisteiden seulonnan. Bioprinttauksen edut toistettavuudessa verrattuna manuaalisesti tuotettuihin kolmiulotteisiin viljelmiin helpottavat standardointia, joka on välttämätöntä sääntelyn hyväksymisen ja lääkekehitysputkiin integroinnin kannalta, vaikka validointi in vivo -tuloksiin verrattuna on edelleen olennaista, jotta voidaan luottaa ennustuskykyyn.