Veröffentlicht: 2023 | Zuletzt überprüft: Mai 2026

Techniken zur Dissoziation von Zellkulturen

Die Dissoziation von Zellkulturen ist ein entscheidender Schritt bei der Pflege von Zellkulturen. Dabei werden die Zellen von ihrer Wachstumsoberfläche abgelöst, um eine Subkultivierung oder Ernte zu ermöglichen. In diesem Abschnitt werden zwei Hauptmethoden beschrieben: die Verwendung von enzymfreien Dissoziationspuffern und die Verwendung von enzymatischen Reagenzien.

Verwendung von enzymfreien Zelldissoziationspuffern

Diese Methode ist schonend und bewahrt die Zellintegrität ohne den Einsatz von Enzymen:

1. Vorbereitung
   • Stellen Sie sicher, dass alle Reagenzien vor der Verwendung auf 37 °C erwärmt sind, um einen Schock für die Zellen zu vermeiden.
2. Entfernen des Wachstumsmediums:
   • Entfernen Sie das alte Wachstumsmedium aus dem Kulturgefäß.
3. Spülen
   • Spülen Sie die Zellmonolayer mit 5 ml kalzium- und magnesiumfreiem PBS pro T75-Flasche oder 100-mm-Schale.
   • Schütteln Sie das Gefäß 30 bis 60 Sekunden lang vorsichtig bei Raumtemperatur.
   • Die Spüllösung absaugen und entsorgen.
   • Wiederholen Sie diesen Spülschritt noch einmal.
4. Dissoziation
   • Geben Sie etwa 5 ml enzymfreien Zelldissoziationspuffer in das Gefäß.
   • Bei Raumtemperatur 1 bis 2 Minuten lang leicht schütteln und die Dissoziation unter dem Mikroskop überprüfen.
   • Klopfen Sie den Kolben oder die Schale gegen die Hand, um die Zellen gegebenenfalls zu lösen.
   • Sollten die Zellen noch anhaftend sein, lassen Sie sie weitere 2 bis 5 Minuten bei Raumtemperatur stehen und klopfen Sie sie bei Bedarf erneut ab, wobei Sie mehr Dissoziationspuffer verwenden.
   • Sobald sich die Zellen gelöst haben, geben Sie mindestens 5 ml vollständiges Wachstumsmedium hinzu, um den Dissoziationspuffer zu neutralisieren und die Zellen zu resuspendieren.
5. Lebensfähigkeitsprüfung
   • Überwachen Sie die Zellviabilität während der Subkultivierung und stellen Sie sicher, dass sie über 90 % bleibt.

Verwendung anderer Reagenzien zur Dissoziation

Diese Methode ermöglicht die Verwendung verschiedener Dissoziationsreagenzien:

1. Entfernen des verbrauchten Mediums
   • Entsorgen Sie das alte Medium aus dem Kulturgefäß.
2. Waschen der Zellen
   • Waschen Sie die Zellen mit einer ausgewogenen Salzlösung, die frei von Calcium und Magnesium ist, oder verwenden Sie EDTA.
   • Geben Sie die Waschlösung vorsichtig auf der den Zellen gegenüberliegenden Seite hinzu und schütteln Sie das Gefäß 1 bis 2 Minuten lang, bevor Sie die Waschlösung verwerfen.
3. Dissoziation
   • Geben Sie 2 bis 3 ml der gewählten Dissoziationslösung pro 25 cm² Wachstumsfläche hinzu und achten Sie darauf, dass die Zellschicht vollständig bedeckt ist.
   • Inkubieren Sie das Gefäß bei 37 °C und schütteln Sie es vorsichtig. Die Dissoziation erfolgt in der Regel innerhalb von 5 bis 15 Minuten, je nach Zelllinie.
   • Bei hartnäckigen Zellen kann das Klopfen auf das Gefäß den Prozess beschleunigen.
   • Beobachten Sie die Zellen sorgfältig, um eine Überbelichtung und mögliche Schäden zu vermeiden.
4. Ernte der Zellen
   • Sobald sich die Zellen vollständig abgelöst haben, lassen Sie sie am Boden des Gefäßes sammeln, indem Sie dieses aufrecht stellen.
   • Fügen Sie Komplettmedium hinzu, dispergieren Sie die Zellen anschließend und sammeln Sie sie durch Pipettieren über die Zellschicht.
   • Zählen Sie die Zellen und fahren Sie mit der Subkultivierung fort.

Bei beiden Methoden ist es wichtig, die optimalen Bedingungen für jede Zelllinie durch empirische Beobachtung zu ermitteln. Der Prozess sollte die Zellviabilität erhalten, die während der Subkultivierung routinemäßig überprüft werden sollte und über 90 % liegen sollte. Diese Verfahren bilden eine Grundlage, die Forscher an die spezifischen Anforderungen und Eigenschaften ihrer Zelllinien anpassen können.

Übersicht über Techniken zur Subkultivierung adhärenter Zellen

Eine effektive Subkultivierung adhärenter Zellen erfordert deren Ablösung vom Kulturgefäß. Es werden verschiedene Methoden angewendet, die jeweils für unterschiedliche Zelltypen und Bedingungen geeignet sind. Bei der Auswahl einer Dissoziationsmethode ist es entscheidend, die spezifischen Anforderungen der Zelllinie und die Ziele des Experiments zu berücksichtigen. Eine regelmäßige Überwachung der Zellviabilität mit dem Ziel, zum Zeitpunkt der Subkultivierung einen Wert von über 90 % zu erreichen, ist für die anhaltende Gesundheit und Produktivität der Kultur unerlässlich. Hier ist ein Überblick über diese Verfahren: