Primære humane celler

Hvad er primære celler fra mennesker?

Primære celler er den reneste repræsentation af deres respektive væv. De isoleres fra vævet og behandles, så de kan etablere sig i en kultur med ideelle betingelser. De efterligner i højere grad in vivo-tilstanden og udviser normal fysiologi, fordi de stammer fra væv i stedet for at blive modificeret. Derfor kan de fungere som nyttige modeller for forskning i cellulær farmakologi, toksikologi og fysiologi (herunder undersøgelser af metabolisme, aldring og signaltransduktion). Husk, at primære celler er mere udfordrende at dyrke og vedligeholde end en kontinuerlig cellelinje, fordi de har en kortere levetid og holder op med at dele sig (eller bliver ældre) efter et vist antal celledelinger. Undersøgelser af cellesignalveje kompliceres af den iboende variation i primære celler, der er erhvervet fra donorer og gennem subkulturpraksis. Før forskerne går i gang med signalstudier, foretager de ofte en screening for at afgøre, om cellerne reagerer på almindeligt anvendte stimuli eller ej. For at undgå spild af tid og penge kan primære celler stimuleres til at aktivere de vigtigste signalveje, før de screenes.

Hvorfor bruge humane primærceller?

Immortaliserede cellelinjer bruges ofte som celleassay. Selvom forskere har erkendt, at biologiske ændringer på grund af cellelinjer kan være skadelige, når man undersøger deres fysiologiske betydning. Brugen af humane primærceller forbedrer den fysiologiske værdi af data opnået gennem cellekulturer, og de anses i stigende grad for at være vigtige for studiet af biologiske processer, sygdomsudvikling og lægemiddeludvikling.

Humane primærceller bruges i vid udstrækning til in vitro-studier af intercellulær og intracellulær kommunikation, udviklingsbiologi og de mekanismer, der ligger til grund for kræft, Parkinsons sygdom og diabetes, blandt mange andre prækliniske og undersøgende biologiske forskningsområder. Forskere har længe brugt udødelige cellelinjer til at studere vævsfunktioner, men cellelinjer med tydelige mutationer og kromosomafvigelser er måske ikke gode erstatninger for normale celler og udvikling af sygdom i de tidlige stadier. En mere præcis model af en specifik vævscelletype kan nu opnås ved at bruge humane primærceller, der er isoleret fra det pågældende væv og vedligeholdt i primære cellekulturmedier og -tilskud.

Hvad er primær cellekultur?

I stedet for at bruge udødeliggjorte cellelinjer involverer primær celledyrkning dyrkning af celler direkte fra en multicellulær organisme uden for kroppen. I nogle lande, f.eks. Storbritannien, er det juridisk anerkendt, at primære cellekulturer er mere repræsentative for in vivo-væv end cellelinjer. Ikke desto mindre har primære celler brug for det rette substrat og de rette næringsstoffer for at vokse, og efter et vist antal delinger udvikler de en senescent fænotype, der får dem til permanent at holde op med at dele sig. Disse to faktorer motiverer skabelsen af cellelinjer. Både naturligt udødeliggjorte primærceller (f.eks. HeLa-celler) og kunstigt udødeliggjorte primærceller (f.eks. HEK-celler) kan dyrkes på ubestemt tid i cellekultur.

Humane primærceller efter vævstyper

Epitelceller, fibroblaster, keratinocytter, melanocytter, endotelceller, muskelceller, immunceller og stamceller som mesenkymale stamceller er blandt de mest almindeligt anvendte humane primærceller i videnskabelige undersøgelser. Til at begynde med er kulturerne heterogene (de repræsenterer en blanding af de celletyper, der findes i vævet), og de kan kun holdes i live in vitro i et bestemt tidsrum. Transformation er en in vitro-proces, der gør det muligt at manipulere humane primærceller til ubegrænsede subkulturer. Transformation kan ske naturligt, eller den kan induceres af kemikalier eller vira. Efter at have gennemgået en genetisk transformation kan en primærkultur dele sig i det uendelige til en udødeliggjort sekundær cellelinje, hvis den får nok næring og plads.

Endotheliale celler

Kræftbehandling, sårheling, forskning i cellesignalering, high-throughput og high-content screening samt toksikologisk screening er blot nogle af de områder, der kan drage fordel af brugen af primære endotelceller som forskningsværktøj.

Keratinocytter

Keratinocytter, der stammer fra overhuden hos enten voksne mennesker eller neonatal forhud, spiller en afgørende rolle i studiet af hudsygdomme som psoriasis og kræft.

Epitheliale celler

Fra kræftundersøgelser til toksikologiske undersøgelser har primære epitelceller vist sig at være uvurderlige ressourcer til modellering af kroppens naturlige forsvar.

Fibroblaster

Inducering af pluripotente stamceller (iPS) og studier af sårheling er blot nogle få af de mange anvendelser af primære fibroblaster.

Immunceller

Mononukleære celler i perifert blod, forkortet PBMC, er mononukleære celler i blodet med en rund cellekerne. De omfatter hovedsageligt lymfocytter og monocytter, som påtager sig vigtige funktioner i løbet af en immunrespons. Mononukleære celler i perifert blod bruges ofte til at diagnosticere infektioner eller til at påvise mulig vaccinationsbeskyttelse. Indsigt i det cellulære immunrespons, der medieres af T-celler, er ofte afgørende.

Melanocytter

Melanocytter, de specialiserede hudceller, der producerer pigmentet melanin, er nyttige som modeller til forskning i emner som sårheling, toksicitet, melanom, hudens reaktion på ultraviolet (UV) stråling, hudsygdomme og kosmetik.

Stamceller

Stamceller har potentiale til at differentiere sig til en lang række forskellige celletyper. På grund af deres evne til at differentiere sig giver de nye muligheder for at modellere menneskeligt væv og sundhedstilstande.

Mesenkymale stamceller

Mesenkymale stamceller, også kendt som MSC'er, kan udvindes fra forskellige menneskelige kilder som knoglemarv, fedt (fedtvæv), navlestrengsvæv (Whartons gelé) og fostervand (den væske, der omgiver et foster) og kan ekspanderes in vitro. Disse voksne stromale stamceller har evnen til at udvikle sig til en lang række forskellige celletyper. Nogle af disse celletyper omfatter knogleceller, bruskceller, muskelceller, nerveceller, hudceller og hornhindeceller.

Glatte muskelceller

I hule organer beklæder primære glatte muskelceller (SMC'er) det indre og formidler kontraktilitet. Ud over kræft og andre sygdomme kan SMC'er bruges til at modellere hypertensionsfibrose.

Primære celler og cellelinjer

Enten ved spontan mutation, som i transformerede kræftcellelinjer, eller ved forsætlig ændring, som i den kunstige produktion af kræftgener, har kontinuerlige cellelinjer fået potentialet til at reproducere sig uendeligt (udødeliggjort). Som regel er kontinuerlige cellelinjer mere pålidelige og praktiske at have med at gøre end primære celler. De kan udvides på ubestemt tid og giver hurtig adgang til vigtige data. Brugen af kontinuerlige cellelinjer har visse begrænsninger, herunder det faktum, at de er genetisk modificerede/transformerede, hvilket kan ændre fysiologiske egenskaber og ikke matche in vivo-tilstanden, og at dette kan ændre sig yderligere over tid med betydelig passage.

Fremskridt inden for primær cellekultur

Primære celler har et notorisk ry for at være vanskelige at arbejde med. Processen er dog blevet lettere end nogensinde før takket være udviklingen inden for primær celledyrkning, tilgængeligheden af kommercielle primære celler med fuldt optimerede protokoller og nye analyseteknikker, der kræver mindre input.

Skiftet fra todimensionel til tredimensionel cellekultur betragtes som en vigtig milepæl inden for området. Vævsspecifik arkitektur, celle-celle-interaktioner og mekanisk/biokemisk signalering kan dæmpes i en 2D-kultur. Derfor er der et loft for den biologiske værdi af disse kulturer.

På den anden side giver 3D-cellekulturer cellerne mulighed for at ekspandere og interagere med en ekstracellulær 3D-ramme. Det giver cellerne mulighed for at interagere med hinanden og den ekstracellulære matrix, hvilket gør 3D-kulturer mere fysiologisk relevante. Denne metodes nøjagtighed i forhold til at forudsige in vivo-responser har gjort den revolutionerende inden for områder som lægemiddelopdagelse og -udvikling. På grund af dette giver de nyeste teknologier, som organoider fra patienter og organer-på-en-chip, meget kontekstuelle modeller til screening og udvikling af lægemidler.

Generering af primære celler er en flaskehals i primærkulturer. Der kræves normalt en større mængde væv for at overvinde dette, hvilket kan være en udfordring at opnå. Forbedret analytisk følsomhed er dog en vej frem. For eksempel reduceres behovet for at dyrke store mængder primære celler ved at bruge enkeltcelleteknologi, som omfatter sekventering, western blotting og massecytometri.

Lovende udsigter for primær celledyrkning

De generelle vanskeligheder ved primær celledyrkning afhjælpes af teknologiske fremskridt. Til gengæld erstatter denne metode hurtigt andre som den gyldne standard inden for cellulær og molekylærbiologisk undersøgelse og praksis. Vaccineproduktion, organerstatning, stamcelleterapi, kræftforskning og meget mere vil få stor gavn af de fortsatte fremskridt inden for primær celledyrkning.

Tips og tricks til primær celledyrkning

Behovet for celleekspansion

De to mest almindelige metoder til dyrkning af primære celler er i suspension eller på en overflade (2D). Nogle celler er i stand til at flyde frit i blodbanen uden nogensinde at klæbe til en overflade (f.eks. dem, der stammer fra perifert blod). Forskellige cellelinjer er blevet konstrueret til at trives i suspensionskulturer, hvor de kan nå tætheder, der er uopnåelige under 2D-vækstbetingelser. Primære celler, der har brug for forankring for at vokse in vitro, kaldes adhærente celler og omfatter dem, der findes i fast væv. For at forbedre adhæsionsegenskaberne og tilføre andre signaler, der er nødvendige for vækst og differentiering, dyrkes disse celler typisk i en flad, ubelagt plastbeholder, men af og til i en mikrobærer. Sidstnævnte kan være belagt med ekstracellulære matrixproteiner (f.eks. kollagen og laminin). De medier, der bruges til celledyrkning, består af et basismedium, der er blevet suppleret med de rette vækstfaktorer og cytokiner. En celleinkubator er en særlig type laboratorieinkubator, der bruges til at dyrke og vedligeholde celler ved en bestemt temperatur og gasblanding (typisk 37 °C, 5 % CO2 for pattedyrsceller). Afhængigt af den celletype, der dyrkes, kan de optimale betingelser være meget forskellige. Afhængigt af de celletyper, der dyrkes, vil det optimale vækstmedium have en unik kombination af faktorer, herunder, men ikke begrænset til, pH, glukosekoncentration, vækstfaktorer og tilstedeværelsen af andre næringsstoffer.

Antibiotika i vækstmediet er afgørende under etablering af primærkulturen for at forhindre kontaminering fra værtsvævet. Nogle antibiotikaregimer indeholder en kombination af gentamicin, penicillin, streptomycin og amfotericin B. Det frarådes dog at bruge antibiotika i længere tid, fordi nogle reagenser (som f.eks. amfotericin B) kan være giftige for cellerne i det lange løb.

De fleste primære celler gennemgår senescens og holder op med at dele sig efter et vist antal populationsfordoblinger, hvilket gør det afgørende at holde dem i live efter isolering. Langvarig cellelevedygtighed kræver ekspertteknikker til celledyrkning og ideelle dyrkningsbetingelser (herunder det rigtige medium, den rigtige temperatur, den rigtige gasblanding, den rigtige pH-værdi, den rigtige koncentration af vækstfaktorer, tilstedeværelsen af næringsstoffer og tilstedeværelsen af glukose). Da mange af de vækstfaktorer, der bruges til at supplere medier, stammer fra dyreblod (de blodbaserede ingredienser har potentiale til at blive kontamineret), anbefales det, at brugen af dem minimeres eller helt undgås. Det er også vigtigt at bruge en aseptisk teknik.

Subkultur og vedligeholdelse

Når isolerede celler klæber til overfladen af dyrkningsskålen, markerer det begyndelsen på vedligeholdelsesfasen. Tilhæftning sker typisk 24 timer efter kulturstart. Cellerne skal subkultiveres, når de har nået en vis konfluensprocent og replikerer aktivt. Da postkonfluente celler kan undergå differentiering og udvise langsommere proliferation efter passage, er det bedst at subkultivere primære cellekulturer, før de når 100 % konfluens.

Subkulturer i friske medier opretholder den eksponentielle vækst af ankerafhængige celler. Subkultur af monolag forstyrrer inter- og intracellulære celleoverfladeinteraktioner. Lave koncentrationer af proteolytiske enzymer, såsom trypsin/EDTA, anvendes til at udtrække adhærente primærceller fra monolag eller væv. Efter dissociation og fortynding til en enkeltcelleopløsning tælles cellerne og overføres til friske kulturbeholdere for at sætte sig fast igen og formere sig.

Kryopræservering og gendannelse

Kryopræservering bevarer levende celler ved at fryse dem ved lave temperaturer. Kryopræservering og optøning af humane primærceller forhindrer celledød og skader under opbevaring og brug. Humane primærceller kryobeskyttes ved hjælp af DMSO eller glycerol (ved den korrekte temperatur og med en kontrolleret frysehastighed). Fryseprocessen skal være progressiv, ved -1 °C hvert minut, for at forhindre dannelse af iskrystaller. Langtidsopbevaring kræver flydende nitrogen (-196 °C) eller temperaturer under -130 °C.

Det er tilstrækkeligt at nedsænke frosne celler i et 37 °C vandbad i ca. 1 til 2 minutter for at optø kryopræserverede celler. Humane primærceller bør ikke centrifugeres efter optøning fra fryseren (da de er ekstremt følsomme over for skader under genopretning fra kryopræservering). Det er velegnet til udpladning af celler umiddelbart efter optøning, og det fremmer vedhæftning i kulturer i løbet af de første 24 timer efter udpladning. 1 Når de kryopræserverede primærceller har sat sig fast, skal det brugte medie fjernes (da DMSO er skadeligt for primærceller og kan forårsage et fald i levedygtigheden efter optøning).