Primære humane celler

Hvad er humane primærceller?

Primærceller er den reneste repræsentation af deres respektive væv. De isoleres fra vævet og behandles, så de kan etableres i en kultur under ideelle betingelser. De efterligner in vivo-tilstanden mere nøjagtigt og udviser normal fysiologi, fordi de stammer fra væv i stedet for at være modificerede. Derfor kan de fungere som nyttige modeller til forskning inden for cellulær farmakologi, toksikologi og fysiologi (herunder studier af stofskifte, aldring og signaltransduktion). Man skal huske på, at primærceller er sværere at dyrke og vedligeholde end en kontinuerlig cellelinje, da de har en kortere levetid og vil stoppe med at dele sig (eller senescere) efter et bestemt antal celledelinger. Undersøgelser af cellesignalveje kompliceres af den iboende variabilitet hos primære celler, der er indhentet fra donorer og gennem subkulturpraksis. Inden man påbegynder signalundersøgelser, foretager forskere ofte en screening for at fastslå, om cellerne reagerer på almindeligt anvendte stimuli. For at undgå spild af tid og penge kan primære celler stimuleres til at aktivere de vigtigste signalveje, inden de screenes.

Hvorfor bruge humane primærceller?

Immortaliserede cellelinjer anvendes ofte som celleassay. Selvom forskere har erkendt, at biologiske ændringer forårsaget af cellelinjer kan være skadelige for undersøgelsen af deres fysiologiske betydning, forbedrer brugen af humane primærceller den fysiologiske værdi af data indhentet gennem cellekulturer, og de betragtes i stigende grad som vigtige for undersøgelsen af biologiske processer, sygdomsforløb og lægemiddeludvikling.

Humane primærceller anvendes i vid udstrækning i in vitro-undersøgelser af intercellulær og intracellulær kommunikation, udviklingsbiologi samt de mekanismer, der ligger til grund for kræft, Parkinsons sygdom og diabetes, blandt mange andre prækliniske og undersøgelsesmæssige biologiske forskningsområder. Forskere har længe anvendt immortalisere cellelinjer til at undersøge vævsfunktion; cellelinjer med tydelige mutationer og kromosomafvigelser er dog muligvis ikke gode erstatninger for normale celler og sygdommens udvikling i de tidlige stadier. Man kan nu opnå en mere nøjagtig model af en specifik vævscelletype ved at anvende humane primærceller, der er isoleret fra det pågældende væv og opretholdes i primærcellekulturmedier og -tilskud.

Hvad er primærcellekultur?

I stedet for at anvende udødeliggjorte cellelinjer indebærer primærcellekultur, at celler dyrkes direkte fra en flercellet organisme uden for kroppen. I nogle lande, såsom Storbritannien, anerkendes det juridisk, at primærcellekulturer er mere repræsentative for in vivo-væv end cellelinjer. Ikke desto mindre har primærceller brug for det rette substrat og næringsstoffer for at vokse, og efter et bestemt antal celledelinger udvikler de en senescent fænotype, der får dem til permanent at stoppe med at dele sig. Disse to faktorer er drivkraften bag oprettelsen af cellelinjer. Både naturligt udødeliggjorte primære celler (f.eks. HeLa-celler) og kunstigt udødeliggjorte primære celler (f.eks. HEK-celler) kan dyrkes på ubestemt tid i cellekultur.

Humane primærceller efter vævstyper

Epithelceller, fibroblaster, keratinocytter, melanocytter, endotelceller, muskelceller, immunceller og stamceller som mesenkymale stamceller er blandt de mest anvendte humane primærceller i videnskabelige studier. Til at begynde med er kulturerne heterogene (de repræsenterer en blanding af de celletyper, der findes i vævet), og de kan kun holdes i live in vitro i en bestemt periode. Transformation er en in vitro-proces, der gør det muligt at manipulere humane primærceller til ubegrænsede subkulturer. Transformation kan ske naturligt, eller den kan fremkaldes af kemikalier eller vira. Efter at have gennemgået genetisk transformation kan en primærkultur dele sig i det uendelige og danne en udødeliggjort sekundær cellelinje, hvis den får tilstrækkeligt med næringsstoffer og plads.

Endotelceller

Kræftbehandling, sårheling, forskning i cellesignalering, højkapacitets- og højindholdsscreening samt toksikologisk screening er blot nogle af de områder, der kan drage fordel af brugen af primære endotelceller som forskningsværktøj.

Keratinocytter

Keratinocytter, der stammer fra epidermis i enten voksen menneskehud eller nyfødt forhud, spiller en afgørende rolle i studiet af hudsygdomme som psoriasis og kræft.

Epithelceller

Fra kræftstudier til toksikologiske undersøgelser har primære epitelceller vist sig at være uvurderlige ressourcer til modellering af kroppens naturlige forsvar.

Fibroblaster

Inducering af pluripotente stamceller (iPS-celler) og undersøgelse af sårheling er blot nogle få af de mange anvendelsesmuligheder for primære fibroblaster.

Immunceller

Mononukleære celler i perifert blod, forkortet PBMC, er mononukleære blodceller med en rund cellekerne. De omfatter hovedsageligt lymfocytter og monocytter, som varetager vigtige funktioner i forbindelse med en immunrespons. Mononukleære celler fra perifert blod anvendes ofte til at diagnosticere infektioner eller til at påvise mulig beskyttelse efter vaccination. Indsigt i det cellulære immunrespons, der formidles af T-celler, er ofte afgørende.

Melanocytter

Melanocytter, de specialiserede hudceller, der producerer pigmentet melanin, er nyttige som modeller i forskning inden for emner som sårheling, toksicitet, melanom, hudens reaktion på ultraviolet (UV) stråling, hudsygdomme og kosmetik.

Stamceller

Stamceller har potentiale til at differentiere sig til en lang række celletyper. På grund af deres evne til at differentiere sig giver de nye muligheder for modellering af humant væv og sundhedstilstande.

Mesenchymale stamceller

Mesenchymale stamceller, også kendt som MSC'er, kan udvindes fra forskellige menneskelige kilder såsom knoglemarv, fedt (fedtvæv), navlestrengsvæv (Whartons gelé) og fostervand (væsken omkring fosteret) og kan dyrkes in vitro. Disse voksne stromale stamceller har evnen til at udvikle sig til en lang række celletyper. Nogle af disse celletyper omfatter knogleceller, bruskceller, muskelceller, nerveceller, hudceller og hornhindeceller.

Glatte muskelceller

I hule organer beklæder primære glatte muskelceller (SMC'er) det indre og medierer kontraktiliteten. Ud over kræft og andre sygdomme kan SMC'er anvendes til at modellere fibrose ved forhøjet blodtryk.

Primære celler og cellelinjer

Enten ved spontan mutation, som i transformerede kræftcellelinjer, eller gennem bevidst ændring, som ved kunstig fremstilling af kræftgener, har kontinuerlige cellelinjer fået evnen til at reproducere sig uendeligt (udødeliggjort). Som regel er kontinuerlige cellelinjer mere pålidelige og praktiske at arbejde med end primære celler. De kan udvides i det uendelige og giver hurtig adgang til vigtige data. Anvendelsen af kontinuerlige cellelinjer har visse begrænsninger, herunder det faktum, at de er genetisk modificerede/transformerede, hvilket kan ændre fysiologiske egenskaber og ikke stemme overens med in vivo-forholdene, og at dette yderligere kan ændre sig over tid ved gentagne passager.

Fremskridt inden for primærcellekultur

Primærceller har et berygtet ry for at være vanskelige at arbejde med. Processen bliver dog nemmere end nogensinde før takket være udviklingen inden for primærcellekultur, tilgængeligheden af kommercielle primærceller med fuldt optimerede protokoller samt nye analyseteknikker, der kræver mindre indsats.

Overgangen fra todimensionel til tredimensionel cellekultur betragtes som en vigtig milepæl inden for området. Vævsspecifik arkitektur, celle-celle-interaktioner og mekanisk/biokemisk signalering kan være svækket i en 2D-kultur. Der er således en begrænsning for den biologiske værdi af disse kulturer.

På den anden side giver 3D-cellekultur cellerne mulighed for at udvide sig og interagere med et tredimensionelt ekstracellulært skelet. Dette gør det muligt for cellerne at interagere med hinanden og den ekstracellulære matrix, hvilket gør 3D-kulturer mere fysiologisk relevante. Denne metodes nøjagtighed i at forudsige in vivo-reaktioner har gjort den revolutionerende inden for områder som lægemiddelforskning og -udvikling. Derfor leverer de nyeste teknologier, såsom organoider afledt af patienter og »organer-på-en-chip«, meget kontekstuelle modeller til lægemiddelscreening og -udvikling.

Generering af primære celler udgør en flaskehals i primærkulturer. Der kræves normalt en større mængde væv for at overvinde dette, hvilket kan være en udfordring at opnå. Imidlertid baner forbedret analytisk følsomhed vejen fremad. For eksempel reduceres behovet for at dyrke store mængder primærceller ved hjælp af enkeltcelleteknologi, som omfatter sekventering, western blotting og masscytometri.

Lovende udsigter for primærcellekulturer

De generelle udfordringer ved primærcellekultur mindskes takket være teknologiske fremskridt. Til gengæld er denne metode hurtigt ved at erstatte andre metoder som den gyldne standard inden for celle- og molekylærbiologisk forskning og praksis. Vaccineproduktion, organtransplantation, stamcelleterapier, kræftforskning og meget mere vil kunne drage stor fordel af de fortsatte fremskridt inden for primærcellekultur.

Tips og tricks til primærcellekultur

Kravene til celleudvidelse

De to mest almindelige metoder til dyrkning af primære celler er i suspension eller på en overflade (2D). Nogle celler er i stand til at svæve frit i blodbanen uden nogensinde at hæfte sig til en overflade (for eksempel celler fra perifert blod). Forskellige cellelinjer er blevet udviklet til at trives i suspensionskulturer, hvor de kan nå tætheder, der er uopnåelige under 2D-vækstbetingelser. Primærceller, der har brug for fastgørelse for at vokse in vitro, kaldes adhærente celler og omfatter dem, der findes i fast væv. For at forbedre vedhæftningsegenskaberne og tilføre andre signaler, der er nødvendige for vækst og differentiering, dyrkes disse celler typisk i et fladt, ubelagt plastkar, men lejlighedsvis på en mikrobærer. Sidstnævnte mulighed kan være belagt med ekstracellulære matrixproteiner (såsom kollagen og laminin). Det medie, der anvendes i cellekulturer, består af et basismedium, der er tilsat de rette vækstfaktorer og cytokiner. En celleinkubator er en særlig type laboratorieinkubator, der anvendes til at dyrke og opretholde celler ved en bestemt temperatur og en bestemt gasblanding (typisk 37 °C, 5 % CO₂ for pattedyrceller). Afhængigt af den celletype, der dyrkes, kan de optimale betingelser variere meget. Afhængigt af de celletyper, der dyrkes, vil det optimale vækstmedium have en unik kombination af faktorer, herunder, men ikke begrænset til, pH, glukosekoncentration, vækstfaktorer og tilstedeværelsen af andre næringsstoffer.

Antibiotika i vækstmediet er afgørende under etableringen af primærkulturen for at forhindre kontaminering fra værtsvævet. Nogle antibiotikabehandlinger består af en kombination af gentamicin, penicillin, streptomycin og amphotericin B. Det frarådes dog at anvende antibiotika i længere tid, da nogle reagenser (såsom amphotericin B) på lang sigt kan være toksiske for cellerne.

De fleste primære celler gennemgår senescens og holder op med at dele sig efter et bestemt antal fordoblinger af populationen, hvilket gør det afgørende at holde dem i live efter isolering. Langvarig celleoverlevelse kræver avancerede cellekultureringsteknikker og optimale dyrkningsbetingelser (herunder det rette medium, den rette temperatur, den rette gasblanding, den rette pH-værdi, den rette koncentration af vækstfaktorer, tilstedeværelsen af næringsstoffer og tilstedeværelsen af glukose). Da mange af de vækstfaktorer, der anvendes til at supplere medier, stammer fra dyreblod (de blodafledte ingredienser indebærer en risiko for kontaminering), anbefales det, at brugen heraf minimeres eller helt undgås. Det er også vigtigt at anvende en aseptisk teknik.

Subkultur og vedligeholdelse

Når isolerede celler fæstner sig til overfladen af dyrkningsskålen, markerer dette begyndelsen på vedligeholdelsesfasen. Fæstningen sker typisk 24 timer efter dyrkningens påbegyndelse. Cellerne bør subkultiveres, når de har nået en bestemt konfluensprocent og replikerer aktivt. Da postkonfluente celler kan gennemgå differentiering og udvise langsommere proliferation efter passage, er det bedst at subkultivere primære cellekulturer, før de når 100 % konfluens.

Subkultivering i frisk medium opretholder den eksponentielle vækst af ankerafhængige celler. Subkultivering af monolag forstyrrer inter- og intracellulære interaktioner på celleoverfladen. Lave koncentrationer af proteolytiske enzymer, såsom trypsin/EDTA, anvendes til at udvinde adhærente primære celler fra monolag eller væv. Efter at cellerne er dissocieret og fortyndet til en enkeltcelleopløsning, tælles de og overføres til friske dyrkningsbeholdere for at genfastgøre sig og formere sig.

Kryopræservering og genopvækst

Kryopræservering bevarer levende celler ved at nedfryse dem ved lave temperaturer. Kryopræservering og optøning af humane primærceller forhindrer celledød og beskadigelse under opbevaring og anvendelse. Humane primærceller kryobeskyttes ved hjælp af DMSO eller glycerol (ved den korrekte temperatur og med en kontrolleret nedfrysningshastighed). Fryseprocessen skal foregå gradvist, med et fald på -1 °C pr. minut, for at forhindre dannelse af iskrystaller. Langtidsopbevaring kræver flydende nitrogen (-196 °C) eller temperaturer under -130 °C.

Det er tilstrækkeligt at nedsænke de frosne celler i et vandbad ved 37 °C i ca. 1 til 2 minutter for at optø kryokonserverede celler. Humane primærceller bør ikke centrifugeres efter optøning fra fryseren (da de er ekstremt følsomme over for beskadigelse under genopretningen efter kryokonservering). Det er velegnet til udpladning af celler umiddelbart efter optøning, og det fremmer vedhæftningen i kulturerne i løbet af de første 24 timer efter udpladningen. 1 Når de kryopræserverede primærceller har vedhæftet sig, skal det brugte medie fjernes (da DMSO er skadeligt for primærceller og kan medføre et fald i levedygtigheden efter optøning).