Cellekultur af pattedyr: Grundlæggende principper og teknikker
Pattedyrscellekultur er en hjørnestensteknik i biologisk forskning, som gør det muligt for forskere at studere celler i et kontrolleret miljø uden for levende organismer. Denne proces involverer isolering af celler fra væv, vedligeholdelse af dem under omhyggeligt kontrollerede forhold og formering af dem til forskellige eksperimentelle formål. Pattedyrscellekultur er afgørende for at forstå cellulære processer, sygdomsmekanismer og udvikle nye behandlingsformer, herunder dem, der bruger udødelige cellelinjer
Vigtige pointer:
- Celler kan isoleres fra væv ved hjælp af enzymatisk fordøjelse eller eksplorative dyrkningsmetoder
- Primære celler har begrænset levetid, mens udødelige cellelinjer kan formere sig på ubestemt tid
- Dyrkningsbetingelserne, herunder vækstmediets sammensætning, er afgørende for cellernes overlevelse og spredning
- Celler kan dyrkes i suspension eller som adhærente kulturer, afhængigt af deres type og forskningsbehov
- Almindelige dyrkningsmedier omfatter MEM, DMEM og RPMI 1640, der hver især er skræddersyet til specifikke celletyper
- Typiske vækstbetingelser er 37 °C, 5 % CO2 og 95 % relativ luftfugtighed
- Serumalternativer som humant blodpladelysat (hPL) bruges i stigende grad for at undgå potentielle kontamineringsproblemer
Teknikker til isolering af celler
Processen med at etablere en cellekultur begynder med at isolere celler fra væv. Der er flere metoder til at opnå dette, som hver især egner sig til forskellige vævstyper og forskningsmål. For blodprøver er celleisolering relativt ligetil, idet hvide blodlegemer er det primære fokus for dyrkning på grund af deres vækstkapacitet. Fast væv kræver mere komplekse isoleringsteknikker. En almindelig metode involverer enzymatisk fordøjelse, hvor enzymer som kollagenase, trypsin eller pronase bruges til at nedbryde den ekstracellulære matrix og frigøre individuelle celler i suspension. Alternativt kan forskere anvende explant-kulturmetoden, hvor små stykker væv placeres direkte i vækstmedier, så cellerne kan vandre ud og sprede sig. Valget mellem disse metoder afhænger ofte af den specifikke vævstype, den ønskede cellepopulation og den påtænkte eksperimentelle anvendelse. Det er vigtigt at bemærke, at celler, der er isoleret direkte fra en organisme, kaldes primære celler og, med visse undtagelser som f.eks. tumorceller, typisk har en begrænset levetid i kultur, før de går til grunde
Vigtige produkter til cellekultur af pattedyr
| Produktets navn | Produktnummer | Kategori | Anvendelse |
|---|---|---|---|
| DMEM, m: 4,5 g/L glukose, m: 4 mM L-glutamin, m: 1,5 g/L NaHCO3, m: 1,0 mM natriumpyruvat | 820300a | Kulturmedier | Universalmedie til forskellige celletyper fra pattedyr |
| DMEM:Ham's F12 (1:1), w: 3,1 g/L Glukose, w: 1,6 mM L-Glutamin, w: 15 mM HEPES, w: 1,0 mM Natriumpyruvat, w: 1,2 g/L NaHCO3 | 820400a | Kulturmedier | Velegnet til en lang række pattedyrsceller, især epitelceller |
| RPMI 1640, w: 2,1 mM stabil glutamin, w: 2,0 g/L NaHCO3 | 820700a | Kulturmedier | Bruges ofte til lymfoide celler og hybridcellelinjer |
| Accutase | 830100 | Dissociation af celler | Skånsom celledissociationsopløsning til adhærente celler |
| Frysemedium CM-1 | 800150 | Kryopræservering | Til nedfrysning og langtidsopbevaring af pattedyrsceller |
| Frysemedium CM-ACF, serumfri | 800650 | Kryopræservering | Animalsk komponentfrit medium til nedfrysning af celler |
| PBS | 860015 | Bufferopløsning | Til vask af celler og opretholdelse af pH-balance |
| Vækstmedium til endotelceller | 820731 | Specialiseret medie | Optimeret til dyrkning af endotelceller |
| Testme for mycoplasma | 900159 | Kvalitetskontrol | Nødvendigt for at påvise mycoplasma-kontaminering i kulturer |
| Autentificering af cellelinje - human | 900154 | Kvalitetskontrol | Verificerer identiteten af humane cellelinjer |
Denne tabel repræsenterer et udvalg af vigtige produkter til pattedyrscellekultur. For vores komplette udvalg af cellekulturprodukter, herunder specialiserede medier og reagenser, kan du besøge vores kategoriside for medier og reagenser.
- et skånsomt alternativ til Trypsin
Accutase er en celledissociationsopløsning, der er ved at revolutionere cellekulturindustrien. Det er en blanding af proteolytiske og kollagenolytiske enzymer, der efterligner virkningen af trypsin og kollagenase. I modsætning til trypsin indeholder Accutase ingen pattedyrs
- eller bakteriekomponenter og er meget mere skånsom mod cellerne, hvilket gør den til en ideel løsning til rutinemæssig løsrivelse af celler fra standard vævskultur-plasticware og plasticware med adhæsionsbelægning. I dette blogindlæg ser vi nærmere på fordelene og anvendelserne af Accutase, og hvordan det ændrer spillet inden for celledyrkning.
Fordele ved Accutase
Accutase har flere fordele i forhold til traditionelle trypsinopløsninger. For det første kan den bruges, når der er behov for skånsom og effektiv løsrivelse af en hvilken som helst klæbende cellelinje, hvilket gør den til en direkte erstatning for trypsin. For det andet fungerer Accutase ekstremt godt på embryonale og neuronale stamceller, og det har vist sig, at den opretholder disse cellers levedygtighed efter passage. For det tredje bevarer Accutase de fleste epitoper til efterfølgende flowcytometrianalyse, hvilket gør den ideel til analyse af celleoverflademarkører.
Derudover behøver Accutase ikke at blive neutraliseret, når adhærente celler passeres. Tilsætning af mere medie, når cellerne er delt, fortynder Accutase, så den ikke længere er i stand til at løsne cellerne. Dette eliminerer behovet for et inaktiveringstrin og sparer tid for cellekulturteknikerne. Endelig behøver Accutase ikke at blive alikvoteret, og en flaske er stabil i køleskabet i 2 måneder.
Anvendelser af Accutase
Accutase er en direkte erstatning for trypsinopløsning og kan bruges til passage af cellelinjer. Derudover fungerer Accutase godt, når man løsner celler til analyse af mange celleoverflademarkører ved hjælp af flowcytometri og til cellesortering. Andre downstream-anvendelser af Accutase-behandling omfatter analyse af celleoverflademarkører, virusvækstassay, celleproliferation, tumorcellemigrationsassays, rutinemæssig cellepassage, produktionsopskalering (bioreaktor) og flowcytometri.
Sammensætning af Accutase
Accutase indeholder ingen pattedyrs
- eller bakteriekomponenter og er en naturlig enzymblanding med proteolytisk og kollagenolytisk enzymaktivitet. Det er formuleret i en meget lavere koncentration end trypsin og kollagenase, hvilket gør det mindre giftigt og mere skånsomt, men lige så effektivt.
Effektiviteten af Accutase
Accutase har vist sig at være effektiv til at løsne primære celler og stamceller og opretholde en høj cellelevedygtighed sammenlignet med enzymer af animalsk oprindelse som trypsin. 100 % af cellerne gendannes efter 10 minutter, og det er ikke skadeligt at lade cellerne ligge i Accutase i op til 45 minutter takket være Accutases selvfordøjelse.
For at opsummere
Konklusionen er, at Accutase er en kraftfuld løsning, der ændrer spillet inden for cellekultur. Med sin skånsomme natur, effektivitet og alsidighed er Accutase det ideelle alternativ til trypsin. Hvis du er på udkig efter en pålidelig og effektiv løsning til cellefjernelse, er Accutase løsningen for dig.
Fosfatbufferet saltvand (PBS) er en meget anvendt bufferopløsning inden for biologisk og kemisk forskning. Den spiller en afgørende rolle i opretholdelsen af pH-balancen og osmolariteten under forskellige eksperimentelle procedurer, herunder vævsbehandling og cellekultur. Vores PBS-opløsning er omhyggeligt formuleret med ingredienser af høj renhed for at sikre stabilitet og pålidelighed i hvert eksperiment. Osmolariteten og ionkoncentrationerne i vores PBS efterligner nøje dem i menneskekroppen, hvilket gør den isotonisk og ugiftig for de fleste celler.
Sammensætning af vores PBS-opløsning
Vores PBS-opløsning er en pH-justeret blanding af ultrarene fosfatbuffere og saltopløsninger. Ved en 1X arbejdskoncentration indeholder den:
8000 mg/L natriumklorid (NaCl)
200 mg/L kaliumklorid (KCl)
1150 mg/L Natriumfosfat dibasisk vandfri (Na2HPO4)
200 mg/L Vandfri monobasisk kaliumfosfat (KH2PO4)
Denne sammensætning sikrer en optimal pH
- og ionbalance, der er velegnet til en lang række biologiske anvendelser.
Anvendelser af vores PBS-opløsning
Vores PBS-opløsning er ideel til forskellige anvendelser inden for biologisk forskning. Dens isotoniske og ikke-toksiske egenskaber gør den velegnet til fortynding af stoffer og skylning af cellebeholdere. PBS-opløsninger, der indeholder EDTA, er effektive til at løsne fastgjorte og sammenklumpede celler. Der bør dog ikke tilsættes divalente metaller som f.eks. zink til PBS, da det kan forårsage udfældning. I sådanne tilfælde anbefales Good's buffere. Derudover er vores PBS-opløsning et acceptabelt alternativ til viralt transportmedium til transport og opbevaring af RNA-vira, herunder SARS-CoV-2.
Kvalitetskontrol
Sterilt filtreret
Opbevaring og holdbarhed
Opbevares ved +2°C til +25°C, beskyttet mod lys.
Når den er åbnet, skal den opbevares ved 2 °C til 25 °C og bruges inden for 24 måneder.
Betingelser for forsendelse
Omgivelsestemperatur
Vedligeholdelse
Opbevares på køl ved +2 °C til +8 °C i mørke. Undgå frysning og hyppig opvarmning til +37 °C, da det forringer produktkvaliteten.
Opvarm ikke mediet til mere end 37 °C, og brug ikke ukontrollerede varmekilder som f.eks. mikrobølgeovne.
Hvis kun en del af mediet skal bruges, skal du fjerne den nødvendige mængde og varme den op til stuetemperatur før brug.
Sammensætning
Kategori
Komponenter
Koncentration (mg/L)
Salte
Kaliumklorid
200
Vandfrit monobasisk kaliumfosfat
200
Natriumklorid
8000
Natriumfosfat dibasisk vandfri
1150
Analysemetode
CLS tilbyder både korttids
- og langtidstest til påvisning af mycoplasma. I førstnævnte testes prøverne umiddelbart efter ankomst, mens der i sidstnævnte påbegyndes celledyrkning, og cellerne testes efter 14 dages antibiotikafri dyrkning. Mycoplasma-testning udføres ved hjælp af et to-punkts detektionssystem med både PlasmoTest™
- Mycoplasma Detection Kit (Invivogen) og Certus QC
- mycoADVANCED detektionskit (Certus).
Prøver
Til den hurtige test skal der leveres mindst 50 µl cellesuspension indeholdende 50.000 celler. Cellesuspensionen kan sendes ved omgivelsestemperatur.
Til premium-testen skal du levere mindst 1 million celler i et egnet frysemedium for at sikre en robust og sund kultur til dyrkning og efterfølgende testning af cellerne. Forsend venligst prøverne på tøris.
Udfyld venligst Mycoplasma Testme Sample Form og vedlæg den din prøveforsendelse.
Kolorimetrisk reporter-assay
Denne test er et cellebaseret kolorimetrisk assay. I nærvær af mycoplasma inducerer en reportercellelinje en signalkaskade, der udløser en farveændring i mediet fra rød til blå. Assayet udføres i 96-brønds multibrøndplader. Signalerne registreres i et mikropladespektrofotometer ved 620-655 nm. Alle mycoplasma
- og acholeplasma-arter, men også andre kontaminanter i cellekulturer som f.eks. bakterier, påvises.
Isotermisk amplifikation
Isotermisk amplifikation er en hurtig og pålidelig test baseret på isotermisk amplifikation af mycoplasmaspecifikt DNA kombineret med realtidsdetektion ved hjælp af et DNA-interkalerende farvestof. Testen er i stand til at påvise seks af de mest almindelige arter, der tegner sig for >95 % af kontamineringen: M.orale, M.hyorhinis, M.arginini, M.fermentans, M.hominis og A.laidlawii. På grund af sekvenshomologi vil andre mycoplasma-arter også blive påvist (M.pneumoniae, M.gallisepticum og M.synoviae). For at identificere, om prøven er mycoplasma-positiv eller -negativ, undersøges smeltetemperaturen (Tm).
Konklusion: Pattedyrscellekulturens centrale rolle i moderne forskning
Pattedyrscellekultur har revolutioneret den biologiske og medicinske forskning og givet forskere effektive værktøjer til at studere komplekse cellulære processer, sygdomsmekanismer og potentielle terapeutiske indgreb. Fra isolering af primære celler til udvikling af udødelige cellelinjer er denne teknik blevet en uundværlig del af den moderne videnskabelige værktøjskasse
Rejsen med pattedyrscellekultur begynder med omhyggelige isoleringsteknikker, fortsætter gennem den omhyggelige vedligeholdelse af celler i specialiserede medier og kulminerer i en bred vifte af anvendelser på tværs af forskellige studieretninger. Uanset om det drejer sig om kræftforskning, opdagelse af lægemidler eller grundlæggende cellebiologi, har evnen til at dyrke og manipulere pattedyrsceller in vitro åbnet op for hidtil usete muligheder for videnskabelig udforskning
Nøglen til succes med pattedyrscellekultur er de omhyggeligt kontrollerede forhold, som cellerne holdes under. Fra sammensætningen af vækstmedier til de præcise miljøparametre i inkubatorer er alle aspekter optimeret til at efterligne cellernes naturlige forhold så tæt som muligt. Denne opmærksomhed på detaljer sikrer pålideligheden og reproducerbarheden af eksperimenter, en hjørnesten i god videnskabelig praksis
Udviklingen af udødelige cellelinjer, som f.eks. de meget anvendte HeLa-celler, har yderligere udvidet mulighederne for celledyrkning. Disse cellelinjer giver ensartede, let tilgængelige cellulære modeller, som har fremskyndet forskning på tværs af mange discipliner
Når vi ser på fremtiden, fortsætter pattedyrscellekultur med at udvikle sig. Fremskridt inden for 3D-kulturteknikker, organoidudvikling og brug af kemisk definerede medier flytter grænserne for, hvad der er muligt i cellekultur. Denne udvikling lover at bringe in vitro-modeller endnu tættere på kompleksiteten i in vivo-systemer, hvilket potentielt kan revolutionere opdagelsen af lægemidler, personlig medicin og vores forståelse af den menneskelige biologi
Konklusionen er, at pattedyrscellekultur fortsat er en dynamisk og vigtig teknik inden for biovidenskabelig forskning. Dens fortsatte forbedring og anvendelse vil utvivlsomt spille en afgørende rolle i besvarelsen af nogle af de mest presserende spørgsmål inden for biologi og medicin og drive de videnskabelige fremskridt fremad i de kommende år