Média pro buněčné kultury: Přehled

V oblasti věd o živé přírodě je jednou z nejdůležitějších metodik pěstování buněk. Pod pojmem "buněčná kultura" se rozumí odebrání buněk, tkání nebo orgánů ze zvířete nebo rostliny a následná implantace těchto buněk, tkání nebo orgánů do umělého prostředí, které je příznivé pro jejich přežití a/nebo růst Základními potřebami prostředí pro optimální vývoj buněk jsou řízená teplota, substrát pro uchycení buněk, vhodné růstové médium a inkubátor, který udržuje optimální pH a osmolalitu. Buňky musí mít tyto podmínky zajištěny, aby mohly plně rozvinout svůj potenciál.

Výběr vhodného růstového média pro kultivaci in vitro je fází kultivace buněk, která je nejkritičtější a zároveň nejdůležitější. Růstové médium, známé také jako kultivační médium, je kapalina nebo gel, jehož složení podporuje vývoj organismů v mikroskopickém, buněčném nebo rostlinném měřítku. Médium používané ke kultivaci buněk často obsahuje dostatečný přísun energie a látek, které řídí buněčný cyklus. Mezi hlavní složky kultivačního média patří aminokyseliny, vitaminy, anorganické soli, glukóza a sérum. Sérum se do média přidává, protože funguje jako zdroj růstových faktorů, hormonů a faktorů vazby. Kromě poskytování živin přispívá médium také k udržování hladiny pH a osmolality.

Typy médií používaných v buněčných kulturách

Lidské i živočišné buňky lze pěstovat buď v umělém nebo syntetickém médiu, nebo ve zcela přírodním médiu, které je doplněno přírodními prvky. V následujícím textu vám poskytneme přehled různých typů v současnosti dostupných médií.

Přírodní média

V přírodních médiích se mohou nacházet pouze biologické tekutiny, které existují ve svém přirozeném stavu. Přírodní média jsou velmi užitečná a snadná pro kultivaci široké škály typů živočišných buněk. Nedostatečná znalost přesných složek, které tvoří přírodní média, je hlavním faktorem, který přispívá k nízké opakovatelnosti výsledků získaných pomocí přírodních médií.

Umělá média

Příprava umělých nebo syntetických médií zahrnuje přídavek živin (organických i anorganických), sérových bílkovin, sacharidů, kofaktorů, vitaminů a solí, jakož i plynných fází O2 a CO2 [1].

Byly vyvinuty různé typy umělých médií, aby plnily jednu nebo více z následujících funkcí: 1) Okamžité přežití (vyvážený roztok soli s přesným pH a osmotickým tlakem). 2) Prodloužené přežití (vyvážený roztok soli doplněný o různé formulace organických chemických látek a/nebo sérum). 3) Časově neomezený vývoj. 4) Specializované funkce.

Existují čtyři odlišné klasifikace umělých médií:

Média obsahující sérum

Nejčastějším druhem doplňku, který se vyskytuje v médiích používaných pro pěstování živočišných buněk, je fetální hovězí sérum. Přidává se do kultivačního média jako levný doplněk, aby se dosáhlo co nejlepších podmínek růstu. Kromě toho, že sérum funguje jako transportér nebo chelátor pro živiny, které jsou nestabilní nebo nerozpustné ve vodě, hormony a růstové faktory, inhibitory proteáz a další látky, váže a neutralizuje také škodlivé molekuly.

Médium bez séra

Přítomnost séra v médiu má řadu nevýhod a může způsobit velké chyby v interpretaci při imunologickém výzkumu [2, 3]. Byla vytvořena řada různých bezsérových médií [4, 5]. Tato média jsou většinou speciálně vytvořena pro podporu kultivace jednoho typu buněk, například Knockout Serum Replacement a Knockout DMEM od společnosti Thermo Fisher Scientific a mTESR médium od Stem Cell Technologies [6] pro kmenové buňky [7].

Tato média navíc obsahují definovaná množství purifikovaných růstových faktorů, lipoproteinů a dalších proteinů, které jinak obvykle dodává sérum [8]. Tato média se často označují jako "definovaná kultivační média", protože složky, které tato média tvoří, jsou dobře známy.

Chemicky definovaná média

Tato média obsahují ultračisté anorganické a organické složky, které nebyly kontaminovány žádným druhem znečištění. Mohou také obsahovat přídavky čistých bílkovin, jako jsou růstové faktory.

genetická modifikace bakterií nebo kvasinek spolu s přídavkem určitých mastných kyselin, vitaminů, cholesterolu a aminokyselin vede k výrobě jejich složek [9].

Bezbílkovinná média

Bezbílkovinná média jsou taková, která neobsahují vůbec žádné bílkoviny a místo toho obsahují pouze nebílkovinné prvky. Ve srovnání s médii s přidaným sérem podporuje použití médií bez přidaných bílkovin větší proliferaci buněk a expresi bílkovin a usnadňuje čištění jakéhokoli produktu vzniklého v následném procesu [10-12]. Ve složeních, jako jsou MEM a RPMI-1640, nejsou bílkoviny obsaženy. V případě potřeby je však možné bílkovinný doplněk podávat.

Kultivační média a jejich základní složky

Komerční kultivační médium lze zakoupit jako prášek nebo tekutinu a často obsahuje různé živiny, jako jsou aminokyseliny, glukóza, soli, vitaminy a další doplňky stravy.

Potřeby těchto složek jsou pro každou buněčnou linii jiné a tyto rozdíly jsou příčinou velkého množství různých složení médií. Každá složka je zodpovědná za určitou funkci, která bude nastíněna v následujících odstavcích:

Pufrovací systémy

Pro udržení optimálních podmínek pěstování je třeba kontrolovat pH, což se často provádí jedním ze dvou pufrovacích systémů:

Přírodní pufrovací systém

Poměr CO2/H2CO3 v atmosféře je stejný jako v médiu, což vytváří přirozený pufrovací mechanismus. Aby se zachoval jejich přirozený pufrovací mechanismus, musí být kultury udržovány ve vzdušném prostředí s 5-10 % CO2, čehož se často dosahuje použitím inkubátoru s CO2. Jednou z nejlepších věcí na používání přirozeného pufru je to, jak je levný a bezpečný.

HEPES

Chemické pufrování pomocí zwitterionu HEPES má větší pufrovací schopnost v rozmezí pH 7,2-7,4 a nepotřebuje regulované plynné prostředí. Pro určité typy buněk může být větší dávka HEPES škodlivá. Média obsahující HEPES jsou rovněž mnohem náchylnější k fototoxickým účinkům fluorescenčního světla [13].

Fenolová červeň

Indikátor pH fenolová červeň je často součástí komerčně dostupného kultivačního média, což umožňuje průběžné sledování pH. Rozšířením buněk způsobují metabolity produkované těmito buňkami změnu pH, a tím i změnu barvy média. Fenolová červeň má dvojí účinek na barvu média, při kyselém pH se zbarvuje do žluta a při zásaditém pH do fialova. pH 7,4, což je optimální hodnota pro buněčné kultury, způsobuje, že se médium jeví jako fluorescenční červená.

Fenolová červeň má však několik nevýhod: Za prvé, fenolová červeň dokáže simulovat působení řady steroidních hormonů, především estrogenu [14]. Proto se při studiu buněk citlivých na estrogeny, jako je prsní tkáň, doporučuje médium bez fenolové červeně. Rovnováha sodíku a draslíku je narušena přítomností fenolové červeně v několika přípravcích bez séra. Přidání séra nebo hovězího hypofyzárního hormonu do média může tento účinek potlačit [15]. Za třetí, přítomnost fenolové červeně brání detekci při průtokových cytometrických experimentech.

Anorganické soli

Média obsahující anorganické soli, jako jsou sodné, draselné a vápenaté ionty, pomáhají udržovat osmotickou rovnováhu a regulovat membránový potenciál.

Aminokyseliny

Protože aminokyseliny jsou základními složkami bílkovin, jsou nezbytnou součástí všech buněčných růstových médií, která kdy byla vynalezena. Protože buňky nejsou schopny samy produkovat určité aminokyseliny, je důležité, aby kultivační médium obsahovalo esenciální aminokyseliny. Jsou nezbytné pro množení buněk a jejich koncentrace určuje maximální hustotu buněk, které lze dosáhnout. Zejména L-glutamin, esenciální aminokyselina, je obzvláště důležitý.

L-glutamin funguje jako sekundární zdroj energie pro metabolismus a přispívá dusíkem k produkci NAD, NADPH a nukleotidů. Vzhledem k tomu, že L-glutamin je nestabilní aminokyselina, která se časem mění na formu, kterou buňky nejsou schopny využít, musí být podáván do média.

Kromě toho mohou být do média dodávány neesenciální aminokyseliny, aby se doplnily ty, které byly v průběhu růstu spotřebovány. Růst buněk se podpoří a jejich životaschopnost se zvýší, když se do růstového média přidají neesenciální aminokyseliny.

Sacharidy

Sacharidy ve formě cukrů jsou hlavním zdrojem energie. Mnohá média obsahují kromě běžnějších cukrů glukózy a galaktózy také maltózu a fruktózu.

Bílkoviny a peptidy

Nejčastěji používanými proteiny a peptidy jsou albumin, transferin a fibronektin. Jsou významné zejména v médiích, která neobsahují sérum. Albumin, transferin, aprotinin, fetuin a fibronektin jsou některé z proteinů, které se mohou nacházet v séru, které je bohatou zásobou bílkovin.

Albumin je základní bílkovinou, která se nachází v krvi, a jeho funkcí je vázat a přenášet různé látky, včetně vody, solí, volných mastných kyselin, hormonů a vitaminů, mezi různými orgány a buňkami. Schopnost albuminu vázat chemické látky z něj činí účinného kandidáta na odstranění škodlivých sloučenin z média, v němž jsou kultivovány buňky.

Aprotinin je ochranným prostředkem v systémech buněčných kultur, protože je stabilní při neutrálním i kyselém pH a také odolný vůči vysokým teplotám a destrukci, kterou mohou způsobit proteolytické enzymy. Je schopen inhibovat řadu serinových proteáz, mimo jiné včetně trypsinu.

Fetuin je glykoprotein, který může být detekován ve větším množství v séru plodu a novorozenců ve srovnání se sérem dospělých zvířat. Kromě toho působí jako inhibitor serinových proteáz. Protein fibronektin je základní složkou v procesu buněčné adheze. Transferin je bílkovina, která přenáší železo a je zodpovědná za dodávání železa do membrán buněk.

Mastné kyseliny a lipidy

Hrají klíčovou roli v bezsérovém médiu, když sérum chybí.

Vitamíny

Řada vitaminů je nezbytná pro vývoj a proliferaci buněk. Vitaminy si buňky nemohou v dostatečném množství vyrobit, a proto jsou v tkáňových kulturách nezbytné jako doplňky stravy.

V buněčných kulturách je primárním zdrojem vitaminů sérum; média se však také upravují různými vitaminy, aby byla vhodná pro určitý typ buněk. Nejčastěji se pro stimulaci růstu používají vitaminy skupiny B.

Stopové prvky

Chemické prvky, jako je měď, zinek, selen a meziprodukty trikarboxylových kyselin, se označují jako stopové prvky. Stopové prvky se často přidávají do médií, která neobsahují sérum, aby nahradily ty, které jsou obvykle přítomny v séru. Tyto prvky jsou důležitými chemickými složkami, které jsou nezbytné pro zdravý vývoj buněk. Mnoho biochemických reakcí závisí na určitých mikroživinách, například aktivita enzymů.

Doplňky média

Plnohodnotné růstové médium navržené pro určité buněčné linie potřebuje další složky, které v základním médiu a séru chybí. Tyto doplňky stravy podporují růst buněk a odpovídající metabolické funkce.

Ačkoli jsou hormony, růstové faktory a signální molekuly nezbytné pro odpovídající proliferaci konkrétních buněčných linií, je třeba vždy dodržovat následující opatření: Vzhledem k tomu, že přidání doplňků může změnit osmolalitu kompletního růstového média, což může inhibovat vývoj buněk, doporučuje se po přidání doplňků vždy ověřit osmolalitu. Pro většinu buněčných linií se optimální osmolalita pohybuje mezi 260 a 320 mOSM/kg.

Antibiotika

Antibiotika se často používají k potlačení rozvoje bakteriálních a plísňových škodlivin [16], ačkoli pro růst buněk nejsou nezbytná. Protože antibiotika mohou skrývat kontaminaci mykoplasmaty a rezistentními bakteriemi, jejich rutinní používání se pro buněčné kultury nedoporučuje [17, 18].

Kromě toho mohou antibiotika narušit metabolismus hypersenzitivních buněk. Často se používají kombinace penicilinu a treptomycinu vyráběné společnostmi MilliporeSigma a Life Technologies. Plasmocin byl využit při kultivaci gliomových buněčných linií TS603, TS516 a BT260 [19] a ukázalo se, že je účinný při odstraňování kontaminace mykoplazmaty [20].

Sérum

V séru jsou přítomny albuminy, růstové faktory a inhibitory růstu. Sérum je jednou z nejvýznamnějších složek média pro buněčné kultury, protože poskytuje aminokyseliny, bílkoviny, vitaminy (zejména vitaminy rozpustné v tucích, jako jsou A, D, E a K), sacharidy, lipidy, hormony, růstové faktory, minerály a stopové prvky.

K podpoře vývoje kultivovaných buněk se často používá sérum z fetálních a telecích hovězích zdrojů. Fetální sérum je bohatou zásobou růstových faktorů a je vhodné pro klonování buněk a vývoj citlivých buněk. Telecí sérum se vzhledem ke svým sníženým schopnostem podporovat růst používá při pokusech s kontaktní inhibicí. Normální růstová média často obsahují 2 % až 10 % séra. Přídavek séra do kultivačního média slouží k následujícím účelům [21]:

• Sérum dodává buňkám základní živiny (v roztoku i navázané na proteiny).

• Sérum obsahuje několik růstových faktorů a hormonů, které se podílejí na podpoře růstu a specializované činnosti buněk.

• Nabízí mnoho vazebných proteinů, jako je albumin a transferin, které transportují další chemické látky do buňky. Například albumin dopravuje do buněk tuky, vitaminy, hormony atd.

• Poskytuje také bílkoviny, jako je fibronektin, které zvyšují přilnavost buněk k podkladu. Kromě toho produkuje roztírací elementy, které napomáhají expanzi buněk před dělením.

• Dodává inhibitory proteáz, které zabraňují proteolýze v buňkách.

• Obsahuje také minerální látky, jako jsou Na+, K+, Zn2+ a Fe2+.

• Zvyšuje viskozitu média, takže chrání buňky před mechanickým poškozením při míchání suspenzní kultury.

• Je to také pufr.

Odkazy

[1] Morgan J, Morton H, Parker R. Nutrition of animal cells in tissue culture; initial studies on a synthetic medium (Výživa živočišných buněk v tkáňových kulturách; první studie syntetického média). Proc Soc Exp Biol Med. 1950;73:1-8

[2] Kerbel R, Blakeslee D. Rapid adsorption of a foetal calf serum component by mammalian cells in culture (Rychlá adsorpce složky fetálního telecího séra savčími buňkami v kultuře). Potenciální zdroj artefaktů ve studiích antisér proti buněčně specifickým antigenům. Immunology. 1976;31:881-91

[3] Sula K, Draber P, Nouza K. Přídavek séra do média používaného pro přípravu buněčných suspenzí jako možný zdroj artefaktů při studiu buněčných reakcí pomocí testu na podkolenní lymfatické uzlině. J Immunogenet. 1980;7:483-9

[4] Mariani E, Mariani A, Monaco M, Lalli E, Vitale M, Facchini A. Komerční média bez séra: růst hybridomů a produkce monoklonálních protilátek. J Immunol Methods. 1991;145:175-83

[5] Barnes D, Sato G. Methods for growth of cultured cells in serum-free medium (Metody růstu kultivovaných buněk v bezsérovém médiu). Anal Biochem. 1980;102:255-70

[6] Yu H, Lu S, Gasior K, Singh D, Vazquez Sanchez S, Tapia O,et al. HSP70 chaperones RNA-free TDP-43 into anisotropic intranuclear liquid spherical shells. Science. 2021;371:

[7] Meharena H, Marco A, Dileep V, Lockshin E, Akatsu G, Mullahoo J,et al. Down-syndromem indukovaná senescence narušuje jadernou architekturu neurálních progenitorů. Cell Stem Cell. 2022;29:116-130.e7

[8] Iscove N, Melchers F. Úplná náhrada séra albuminem, transferinem a sójovým lipidem v kulturách lipopolysacharid-reaktivních B lymfocytů. J Exp Med. 1978;147:923-33

[9] Stoll T, Muhlethaler K, von Stockar U, Marison I. Systematic improvement of a chemically-defined protein-free medium for hybridoma growth and monoclonal antibody production. J Biotechnol. 1996;45:111-23

[10] Darfler F. A protein-free medium for the growth of hybridomas and other cells of the immune system (Bezproteinové médium pro růst hybridomů a dalších buněk imunitního systému). In Vitro Cell Dev Biol. 1990;26:769-78

[11] Barnes D, Sato G. Bezsérové buněčné kultury: sjednocující přístup. Cell. 1980;22:649-55

[12] Hamilton W, Ham R. Clonal growth of chinese hamster cell lines in protein-free media (Klonální růst buněčných linií čínského křečka v bezproteinových médiích). In Vitro. 1977;13:537-47

[13] Zigler J, Lepe Zuniga J, Vistica B, Gery I. Analysis of the cytotoxic effects of light-exposed HEPES-containing culture medium. In Vitro Cell Dev Biol. 1985;21:282-7

[14] Berthois Y, Katzenellenbogen J, Katzenellenbogen B. Phenol red in tissue culture media is a weak estrogen: implications concerning the study of estrogen-responsive cells in culture. Proc Natl Acad Sci U S A. 1986;83:2496-500

[15] Karmiol S. Vývoj bezsérových médií. In: Master JRW, editor. Animal Cell culture, 3. vyd. Oxford:Oxford University Press; 2000.

16] Perlman D. Use of antibiotics in cell culture media [Použití antibiotik v médiích pro buněčné kultury]. Methods Enzymol. 1979;58:110-6

17] McGarrity G. Spread and control of mycoplasmal infection of cell cultures [Šíření a kontrola mykoplazmové infekce buněčných kultur]. In Vitro. 1976;12:643-8

18] Masters J, Stacey G. Changing medium and passaging cell lines [Změna média a pasážování buněčných linií]. Nat Proto se snažíme. 2007;2:2276-84

[19] Chakraborty A, Laukka T, Myllykoski M, Ringel A, Booker M, Tolstorukov M,et al. Histone demethylase KDM6A directly senses oxygen to control chromatin and cell fate. Science. 2019;363:1217-1222

[20] Molla Kazemiha V, Azari S, Amanzadeh A, Bonakdar S, Shojaei Moghadam M, Habibi Anbouhi M,et al. Efficiency of Plasmocin™ on various mammalian cell lines infected by mollicutes in comparison with commonly used antibiotics in cell culture: a local experience. Cytotechnologie. 2011;63:609-20

[21] Kragh Hansen U. Molekulární aspekty vazby ligandů na sérový albumin. Pharmacol Rev. 1981;33:17-53