Primární lidské buňky

Co jsou lidské primární buňky?

Primární buňky představují nejčistší formu příslušných tkání. Jsou izolovány z tkáně a zpracovány tak, aby se mohly usadit v kultivačním prostředí s ideálními podmínkami. Více napodobují stav in vivo a vykazují normální fyziologii, protože pocházejí z tkáně a nejsou geneticky modifikovány. Z tohoto důvodu mohou sloužit jako užitečné modely pro výzkum v oblasti buněčné farmakologie, toxikologie a fyziologie (včetně studií metabolismu, stárnutí a signální transdukce). Je třeba mít na paměti, že kultivace a udržování primárních buněk je náročnější než u kontinuálních buněčných linií, protože mají kratší životnost a po určitém počtu buněčných dělení přestanou se dělit (neboli stárnou). Studium signálních drah buněk je komplikováno přirozenou variabilitou primárních buněk získaných od dárců a v důsledku postupů subkultivace. Před zahájením studií signálních drah výzkumníci často provádějí screening, aby zjistili, zda buňky reagují na běžně používané podněty. Aby se předešlo plýtvání časem a penězi, lze primární buňky před screeningem stimulovat k aktivaci hlavních signálních drah.

Proč používat lidské primární buňky?

Jako buněčné modely se běžně používají imortalizované buněčné linie. Vědci však uznávají, že biologické změny způsobené buněčnými liniemi mohou být při studiu jejich fyziologického významu škodlivé. Použití lidských primárních buněk zvyšuje fyziologickou hodnotu dat získaných z buněčných kultur a tyto buňky jsou stále více považovány za důležité pro studium biologických procesů, průběhu onemocnění a vývoje léčiv.

Lidské primární buňky se široce používají ve studiích in vitro zaměřených na mezibuněčnou a intracelulární komunikaci, vývojovou biologii a mechanismy, které jsou základem rakoviny, Parkinsonovy choroby a cukrovky, a to kromě mnoha dalších předklinických a výzkumných oblastí biologického výzkumu. Výzkumníci již dlouho používají imortalizované buněčné linie ke studiu funkce tkání; buněčné linie s evidentními mutacemi a chromozomálními abnormalitami však nemusí být vhodnými náhradami normálních buněk a vývoje onemocnění v jeho raných stádiích. Přesnější model konkrétního typu tkáňové buňky lze nyní dosáhnout použitím lidských primárních buněk izolovaných z dané tkáně a udržovaných v kultivačních médiích a doplňcích pro primární buňky.

Co je to primární buněčná kultura?

Na rozdíl od použití imortalizovaných buněčných linií spočívá primární buněčná kultura v pěstování buněk přímo z mnohobuněčného organismu mimo tělo. V některých zemích, jako je Velká Británie, je právně uznáno, že primární buněčné kultury lépe reprezentují tkáně in vivo než buněčné linie. Primární buňky však k růstu potřebují správný substrát a živiny a po určitém počtu dělení vykazují senescentní fenotyp, který způsobuje, že se přestanou trvale dělit. Tyto dva faktory motivují k vytváření buněčných linií. Jak přirozeně imortalizované primární buňky (např. buňky HeLa), tak uměle imortalizované primární buňky (např. buňky HEK) lze v buněčné kultuře pěstovat neomezeně dlouho.

Lidské primární buňky podle typů tkání

Mezi nejčastěji používané lidské primární buňky ve vědeckém výzkumu patří epiteliální buňky, fibroblasty, keratinocyty, melanocyty, endoteliální buňky, svalové buňky, imunitní buňky a kmenové buňky, jako jsou mezenchymální kmenové buňky. Zpočátku jsou tyto kultury heterogenní (představují směs buněčných typů přítomných v tkáni) a in vitro je lze udržet naživu pouze po určitou dobu. Transformace je in vitro proces, který umožňuje manipulaci s lidskými primárními buňkami za účelem neomezeného počtu subkultur. Transformace může probíhat přirozeně, nebo ji lze vyvolat chemickými látkami či viry. Po genetické transformaci se primární kultura může při dostatečném přísunu živin a prostoru neomezeně dělit a vytvořit tak imortalizovanou sekundární buněčnou linii.

Endoteliální buňky

Léčba rakoviny, hojení ran, výzkum buněčné signalizace, screening s vysokou propustností a vysokým obsahem a toxikologický screening jsou jen některé z oblastí, které mohou těžit z využití primárních endoteliálních buněk jako výzkumného nástroje.

Keratinocyty

Keratinocyty, získané z epidermis buď z kůže dospělého člověka, nebo z předkožky novorozence, hrají klíčovou roli ve studiu kožních onemocnění, jako je psoriáza a rakovina.

Epitelové buňky

Od studií rakoviny až po toxikologická vyšetření se primární epiteliální buňky osvědčily jako neocenitelné zdroje pro modelování přirozených obranných mechanismů organismu.

Fibroblasty

Indukce pluripotentních kmenových buněk (iPS) a studium hojení ran jsou jen některými z mnoha využití primárních fibroblastů.

Imunitní buňky

Mononukleární buňky periferní krve, zkráceně PBMC, jsou mononukleární buňky krve s kulatým jádrem. Zahrnují především lymfocyty a monocyty, které plní důležité funkce v průběhu imunitní reakce. Mononukleární buňky periferní krve se často používají k diagnostice infekcí nebo k detekci možné ochrany po očkování. Znalost buněčné imunitní reakce zprostředkované T-buňkami je často klíčová.

Melanocyty

Melanocyty, specializované kožní buňky produkující pigment melanin, slouží jako užitečné modely pro výzkum v oblastech, jako je hojení ran, toxicita, melanom, kožní reakce na ultrafialové (UV) záření, kožní onemocnění a kosmetika.

Kmenové buňky

Kmenové buňky mají potenciál diferencovat se do široké škály buněčných typů. Díky své schopnosti diferenciace nabízejí nové možnosti pro modelování lidské tkáně a zdravotních stavů.

Mesenchymální kmenové buňky

Mesenchymální kmenové buňky, známé také jako MSC, lze získat z různých lidských zdrojů, jako je kostní dřeň, tuk (tuková tkáň), tkáň pupečníku (Whartonova želé) a plodová voda (tekutina obklopující plod), a lze je kultivovat in vitro. Tyto dospělé stromální kmenové buňky mají schopnost vyvinout se do široké škály buněčných typů. Mezi tyto buněčné typy patří například kostní buňky, buňky chrupavky, svalové buňky, nervové buňky, kožní buňky a buňky rohovky.

Buňky hladkého svalstva

U dutých orgánů vystýlají primární buňky hladkého svalstva (SMC) vnitřní povrch a zprostředkovávají kontraktilitu. Kromě rakoviny a dalších onemocnění lze SMC využít k modelování fibrózy při hypertenzi.

Primární buňky a buněčné linie

Ať už spontánní mutací, jako u transformovaných nádorových buněčných linií, nebo záměrnou úpravou, jako při umělé produkci nádorových genů, získaly kontinuální buněčné linie schopnost nekonečné reprodukce (imortalizace). Kontinuální buněčné linie jsou zpravidla spolehlivější a jejich práce s nimi je pohodlnější než u primárních buněk. Mohou se neomezeně množit a poskytují rychlý přístup k zásadním údajům. Použití kontinuálních buněčných linií má určitá omezení, včetně skutečnosti, že jsou geneticky modifikované/transformované, což může změnit fyziologické vlastnosti a neodpovídat podmínkám in vivo, a že se to může v průběhu času s významným počtem pasáží dále měnit.

Pokroky v kultivaci primárních buněk

Primární buňky mají pověst, že je s nimi obtížné pracovat. Tento proces se však stává snadnějším než kdykoli předtím díky vývoji v oblasti kultivace primárních buněk, dostupnosti komerčních primárních buněk s plně optimalizovanými protokoly a novým analytickým technikám, které vyžadují méně úsilí.

Přechod od dvourozměrné k trojrozměrné buněčné kultuře je v této oblasti považován za významný milník. Tkáňově specifická architektura, interakce mezi buňkami a mechanická či biochemická signalizace mohou být v 2D kultuře oslabeny. Biologická hodnota těchto kultur má tedy své limity.

Na druhou stranu trojrozměrná buněčná kultura umožňuje buňkám se množit a interagovat s trojrozměrnou extracelulární strukturou. To umožňuje buňkám vzájemně interagovat i s extracelulární matricí, díky čemuž jsou trojrozměrné kultury fyziologicky relevantnější. Díky přesnosti této metody při předpovídání reakcí in vivo se stala revoluční v oblastech, jako je objevování a vývoj léčiv. Z tohoto důvodu poskytují nejmodernější technologie, jako jsou organoidy odvozené od pacientů a „orgány na čipu“, vysoce kontextové modely pro screening a vývoj léčiv.

Problémem při primární kultivaci je získávání primárních buněk. K překonání tohoto problému je obvykle zapotřebí většího objemu tkáně, což může být obtížné zajistit. Cestu vpřed však nabízí zlepšená analytická citlivost. Například potřeba kultivovat velké množství primárních buněk se snižuje díky použití technologie na úrovni jednotlivých buněk, která zahrnuje sekvenování, western blotting a hmotnostní cytometrii.

Slibné vyhlídky pro kultivaci primárních buněk

Celkové obtíže spojené s primární buněčnou kulturou se díky technologickému pokroku daří zmírňovat. Tato metoda tak rychle nahrazuje ostatní metody a stává se zlatým standardem ve studiu a praxi buněčné a molekulární biologie. Výroba vakcín, náhrada orgánů, terapie kmenovými buňkami, výzkum rakoviny a mnoho dalších oborů mohou z neustálého pokroku v oblasti primární buněčné kultury výrazně těžit.

Tipy a triky pro kultivaci primárních buněk

Požadavky na expanzi buněk

Dvě nejběžnější metody kultivace primárních buněk jsou v suspenzi nebo na povrchu (2D). Některé buňky jsou schopny volně plavat v krevním řečišti, aniž by se kdy přilnuly k povrchu (například buňky odvozené z periferní krve). Byly vyvinuty různé buněčné linie, které se daří v suspenzních kulturách, kde mohou dosáhnout hustot nedosažitelných za 2D růstových podmínek. Primární buňky, které k růstu in vitro potřebují ukotvení, se nazývají adhezivní buňky a patří mezi ně i buňky nacházející se v pevných tkáních. Pro zlepšení adhezivních vlastností a zajištění dalších signálů potřebných pro růst a diferenciaci se tyto buňky obvykle kultivují v ploché nepotažené plastové nádobě, výjimečně však i na mikronosiči. Ten může být potažen proteiny extracelulární matrice (jako je kolagen a laminin). Média používaná v buněčné kultuře se skládají ze základního média, které bylo obohaceno o příslušné růstové faktory a cytokiny. Buněčný inkubátor je speciální typ laboratorního inkubátoru používaného k kultivaci a udržování buněk při specifické teplotě a směsi plynů (obvykle 37 °C, 5 % CO₂ pro savčí buňky). V závislosti na typu kultivovaných buněk se mohou optimální podmínky značně lišit. V závislosti na typech pěstovaných buněk bude optimální růstové médium obsahovat jedinečnou kombinaci faktorů, včetně, ale nejen, pH, koncentrace glukózy, růstových faktorů a přítomnosti dalších živin.

Antibiotika v růstovém médiu jsou při založení primární kultury zásadní, aby se zabránilo kontaminaci z hostitelské tkáně. Některé antibiotické režimy zahrnují kombinaci gentamicinu, penicilinu, streptomycinu a amfotericinu B. Dlouhodobé používání antibiotik se však nedoporučuje, protože některá činidla (například amfotericin B) mohou být pro buňky z dlouhodobého hlediska toxická.

Většina primárních buněk prochází senescencí a po určitém počtu zdvojnásobení populace se přestává dělit, proto je zásadní udržet je naživu i po izolaci. Dlouhodobá životaschopnost buněk vyžaduje odborné techniky kultivace buněk a ideální kultivační podmínky (včetně správného média, správné teploty, správné plynové směsi, správného pH, správné koncentrace růstových faktorů, přítomnosti živin a přítomnosti glukózy). Vzhledem k tomu, že mnoho růstových faktorů používaných k obohacení médií se získává z živočišné krve (složky pocházející z krve představují riziko kontaminace), doporučuje se jejich použití omezit na minimum nebo se jim zcela vyhnout. Důležité je také dodržování aseptických postupů.

Subkultivace a udržovací fáze

Jakmile se izolované buňky přichytí k povrchu kultivační misky, začíná fáze udržování kultury. K přichycení obvykle dochází 24 hodin po zahájení kultivace. Buňky by měly být subkultivovány, jakmile dosáhnou určitého procenta konfluence a aktivně se množí. Vzhledem k tomu, že buňky po dosažení konfluence mohou procházet diferenciací a po pasáži vykazovat pomalejší proliferaci, je nejlepší subkultivovat primární buněčné kultury dříve, než dosáhnou 100% konfluence.

Subkultivace v čerstvém médiu udržuje exponenciální růst buněk závislých na ukotvení. Subkultivace monovrstev narušuje mezibuněčné a intracelulární interakce na buněčném povrchu. K extrakci adhezivních primárních buněk z monovrstev nebo tkání se používají nízké koncentrace proteolytických enzymů, jako je trypsin/EDTA. Po disociaci a zředění do roztoku obsahujícího jednotlivé buňky se buňky spočítají a přenesou do čerstvých kultivačních nádob, kde se znovu přichytí a rozmnoží.

Kryokonzervace a regenerace

Kryokonzervace zachovává živé buňky jejich zmrazením při nízkých teplotách. Kryokonzervace a rozmrazování lidských primárních buněk zabraňuje buněčné smrti a poškození během skladování a použití. Lidské primární buňky jsou kryoprotektovány pomocí DMSO nebo glycerolu (při správné teplotě a s řízenou rychlostí zmrazování). Proces zmrazování musí být postupný, s poklesem teploty o 1 °C za minutu, aby se zabránilo tvorbě ledových krystalů. Dlouhodobé skladování vyžaduje tekutý dusík (-196 °C) nebo teploty pod -130 °C.

K rozmrazení kryokonzervovaných buněk stačí ponořit zmrazené buňky do vodní lázně o teplotě 37 °C na přibližně 1 až 2 minuty. Lidské primární buňky by se po rozmrazení z mrazáku neměly odstřeďovat (protože jsou při zotavování z kryokonzervace extrémně citlivé na poškození). Je vhodné pro nasazení buněk na kultivační podložku ihned po rozmrazení a podporuje jejich přilnutí v kultuře během prvních 24 hodin po nasazení. 1 Jakmile se kryokonzervované primární buňky přichytí, je nutné odstranit použité médium (protože DMSO je pro primární buňky škodlivé a může způsobit pokles životaschopnosti po rozmrazení).