Primární lidské buňky

Co jsou lidské primární buňky?

Primární buňky jsou nejčistší reprezentací příslušných tkání. Jsou izolovány z tkáně a zpracovány tak, aby se mohly usadit v kultivačním prostředí s ideálními podmínkami. Lépe napodobují stav in vivo a vykazují normální fyziologii, protože jsou odvozeny z tkáně, nikoliv modifikovány. Díky tomu mohou sloužit jako užitečné modely pro výzkum buněčné farmakologie, toxikologie a fyziologie (včetně studia metabolismu, stárnutí a přenosu signálů). Mějte na paměti, že primární buňky jsou náročnější na kultivaci a udržování než kontinuální buněčné linie, protože mají kratší životnost a po určitém počtu dělení se přestanou dělit (neboli stárnou). Studie buněčných signálních drah jsou komplikovány přirozenou variabilitou primárních buněk získaných od dárců a prostřednictvím subkulturních postupů. Před zahájením studií signalizace výzkumníci často provádějí screening, aby zjistili, zda buňky reagují na běžně používané podněty. Aby se zabránilo plýtvání časem a penězi, lze primární buňky před screeningem stimulovat k aktivaci hlavních signálních drah.

Proč používat lidské primární buňky?

Jako buněčný test se běžně používají imortalizované buněčné linie. I když vědci uznávají, že biologické změny způsobené buněčnými liniemi mohou být při studiu jejich fyziologického významu škodlivé. Použití lidských primárních buněk zlepšuje fyziologickou hodnotu údajů získaných pomocí buněčných kultur a jsou stále více považovány za důležité pro studium biologických procesů, průběhu onemocnění a vývoje léčiv.

Lidské primární buňky jsou široce využívány při in vitro studiích mezibuněčné a vnitrobuněčné komunikace, vývojové biologie a mechanismů, které jsou základem rakoviny, Parkinsonovy choroby a diabetu, a v mnoha dalších preklinických a investigativních oblastech biologického výzkumu. Výzkumníci již dlouho používají ke studiu funkce tkání imortalizované buněčné linie; buněčné linie se zjevnými mutacemi a chromozomálními abnormalitami však nemusí být dobrou náhradou normálních buněk a vývoje onemocnění v jeho raných stadiích. Přesnějšího modelu určitého typu tkáňových buněk lze nyní dosáhnout použitím lidských primárních buněk izolovaných z dané tkáně a udržovaných v primárních kultivačních médiích a doplňcích.

Co je primární buněčná kultura?

Namísto použití imortalizovaných buněčných linií zahrnuje primární buněčná kultura pěstování buněk přímo z mnohobuněčného organismu mimo tělo. V některých zemích, například ve Velké Británii, existuje právní uznání skutečnosti, že primární buněčné kultury jsou reprezentativnější pro tkáně in vivo než buněčné linie. Nicméně primární buňky potřebují ke svému růstu správný substrát a živiny a po určitém počtu dělení se u nich vyvine senescentní fenotyp, který způsobí, že se přestanou trvale dělit. Tyto dva faktory motivují vytváření buněčných linií. Jak přirozeně imortalizované primární buňky (např. buňky HeLa), tak uměle imortalizované primární buňky (např. buňky HEK) lze v buněčných kulturách kultivovat neomezeně dlouho.

Lidské primární buňky podle typů tkání

Mezi nejčastěji používané lidské primární buňky ve vědeckých studiích patří epitelové buňky, fibroblasty, keratinocyty, melanocyty, endotelové buňky, svalové buňky, imunitní buňky a kmenové buňky, jako jsou mezenchymální kmenové buňky. Na začátku je třeba říci, že tyto kultury jsou heterogenní (představují směs buněčných typů přítomných ve tkáni) a lze je udržet při životě in vitro pouze po určitou dobu. Transformace je proces in vitro, který umožňuje manipulovat s lidskými primárními buňkami pro neomezený počet subkultur. K transformaci může dojít přirozeně, nebo může být vyvolána chemickými látkami či viry. Po podstoupení genetické transformace se primární kultura může dělit neomezeně dlouho na imortalizovanou sekundární buněčnou linii, pokud má dostatek živin a prostoru.

Endoteliální buňky

Léčba rakoviny, hojení ran, výzkum buněčné signalizace, vysokokapacitní a vysokoobsahový screening a toxikologický screening jsou jen některé z oblastí, které mohou těžit z použití primárních endoteliálních buněk jako výzkumného nástroje.

Keratinocyty

Keratinocyty odvozené z epidermis dospělé lidské kůže nebo novorozenecké předkožky hrají klíčovou roli při studiu kožních onemocnění, jako je psoriáza a rakovina.

Epitelové buňky

Primární epiteliální buňky se ukázaly být neocenitelným zdrojem pro modelování přirozené obranyschopnosti organismu, od studií rakoviny až po toxikologická šetření.

Fibroblasty

Indukce pluripotentních kmenových buněk (iPS) a studium hojení ran jsou jen některé z mnoha možností využití primárních fibroblastů.

Imunitní buňky

Mononukleární buňky periferní krve, zkráceně PBMC, jsou jednojaderné buňky krve s kulatým buněčným jádrem. Zahrnují především lymfocyty a monocyty, které v průběhu imunitní odpovědi přebírají důležité funkce. Mononukleární buňky periferní krve se často používají k diagnostice infekcí nebo ke zjištění případné ochrany před očkováním. Vhled do buněčné imunitní odpovědi zprostředkované T-lymfocyty je často klíčový.

Melanocyty

Melanocyty, specializované kožní buňky, které produkují pigment melanin, jsou užitečné jako modely pro výzkum témat, jako je hojení ran, toxicita, melanom, kožní reakce na ultrafialové (UV) záření, kožní choroby a kosmetika.

Kmenové buňky

Kmenové buňky mají potenciál diferencovat se v širokou škálu buněčných typů. Díky své schopnosti diferenciace poskytují nové možnosti pro modelování lidských tkání a zdravotních stavů.

Mezenchymální kmenové buňky

Mezenchymální kmenové buňky, známé také jako MSC, lze získat z různých lidských zdrojů, jako je kostní dřeň, tuk (tuková tkáň), tkáň pupečníku (Whartonovo želé) a plodová voda (tekutina obklopující plod), a lze je expandovat in vitro. Tyto dospělé stromální kmenové buňky mají schopnost vyvinout se v širokou škálu buněčných typů. Některé z těchto buněčných typů zahrnují kostní buňky, buňky chrupavky, svalové buňky, nervové buňky, kožní buňky a buňky rohovky.

Hladké svalové buňky

V dutých orgánech lemují primární hladké svalové buňky (SMC) vnitřní prostor a zprostředkovávají kontraktilitu. Kromě rakoviny a dalších onemocnění lze SMC použít k modelování hypertenzivní fibrózy.

Primární buňky a buněčné linie

Buď spontánní mutací, jako je tomu u transformovaných nádorových buněčných linií, nebo záměrnou změnou, jako je tomu u umělé produkce nádorových genů, získaly kontinuální buněčné linie potenciál nekonečného množení (imortalizace). Kontinuální buněčné linie jsou zpravidla spolehlivější a vhodnější pro práci než primární buňky. Mohou se neomezeně rozšiřovat a poskytují rychlý přístup k základním údajům. Použití kontinuálních buněčných linií má určitá omezení, včetně skutečnosti, že jsou geneticky modifikované/transformované, což může změnit fyziologické vlastnosti a neodpovídat stavu in vivo, a že se to může v průběhu času dále měnit při značném pasážování.

Pokroky v primárních buněčných kulturách

Primární buňky mají notoricky známou pověst, že se s nimi obtížně pracuje. Tento proces se však stává snadnějším než kdykoli předtím díky vývoji v oblasti primárních buněčných kultur, dostupnosti komerčních primárních buněk s plně optimalizovanými protokoly a novým analytickým technikám, které vyžadují méně vstupních dat.

Přechod od dvourozměrných ke trojrozměrným buněčným kulturám je považován za významný milník v této oblasti. Tkáňově specifická architektura, interakce mezi buňkami a mechanická/biochemická signalizace mohou být ve 2D kultuře oslabeny. Biologická hodnota těchto kultur je tedy omezena.

Na druhou stranu 3D buněčná kultura umožňuje buňkám expandovat a interagovat s 3D extracelulárním rámcem. Buňky tak mohou interagovat mezi sebou navzájem a s extracelulární matrix, díky čemuž jsou 3D kultury fyziologicky relevantnější. Díky přesnosti této metody při předpovídání reakcí in vivo se stala revoluční v oblastech, jako je objevování a vývoj léčiv. Z tohoto důvodu poskytují nejmodernější technologie, jako jsou organoidy odvozené od pacientů a orgány na čipu, vysoce kontextuální modely pro screening a vývoj léčiv.

Vytváření primárních buněk je úzkým místem v primárních kulturách. K jeho překonání je obvykle zapotřebí větší objem tkáně, což může být náročné. Zlepšená analytická citlivost však poskytuje cestu vpřed. Potřeba kultivovat velké množství primárních buněk se například snižuje použitím technologie jednotlivých buněk, která zahrnuje sekvenování, western blotting a hmotnostní cytometrii.

Slibné vyhlídky pro kultivaci primárních buněk

Celkové obtíže spojené s kultivací primárních buněk jsou zmírňovány technologickým pokrokem. Tato metoda tak rychle nahrazuje ostatní metody jako zlatý standard ve studiu a praxi buněčné a molekulární biologie. Výroba vakcín, náhrada orgánů, terapie kmenovými buňkami, výzkum rakoviny a mnoho dalšího může z pokračujícího pokroku v oblasti primárních buněčných kultur velmi těžit.

Tipy a triky pro primární buněčné kultury

Potřeby expanze buněk

Dvě nejběžnější metody kultivace primárních buněk jsou v suspenzi nebo na povrchu (2D). Některé buňky jsou schopny volně plout v krevním řečišti, aniž by kdy přilnuly k povrchu (například buňky získané z periferní krve). Různé buněčné linie byly upraveny tak, aby se jim dařilo v suspenzních kulturách, kde mohou dosáhnout hustoty nedosažitelné za podmínek 2D růstu. Primární buňky, které ke svému růstu in vitro potřebují ukotvení, se nazývají adherentní buňky a patří mezi ně buňky, které se nacházejí v pevných tkáních. Pro zlepšení adhezních vlastností a dodání dalších signálů potřebných pro růst a diferenciaci se tyto buňky obvykle kultivují v ploché nepotažené plastové nádobě, ale příležitostně i v mikronosiči. Tato druhá možnost může být potažena proteiny extracelulární matrix (jako je kolagen a laminin). Médium používané při kultivaci buněk se skládá ze základního média, které bylo doplněno vhodnými růstovými faktory a cytokiny. Buněčný inkubátor je speciální typ laboratorního inkubátoru, který se používá ke kultivaci a udržování buněk při určité teplotě a směsi plynů (obvykle 37 °C, 5 % CO2 pro savčí buňky). V závislosti na typu kultivované buňky mohou být optimální podmínky velmi odlišné. V závislosti na typech pěstovaných buněk bude optimální růstové médium obsahovat jedinečnou kombinaci faktorů, mimo jiné pH, koncentraci glukózy, růstové faktory a přítomnost dalších živin.

Antibiotika v růstovém médiu mají při zakládání primární kultury zásadní význam, aby se zabránilo kontaminaci z hostitelské tkáně. Některé antibiotické režimy obsahují kombinaci gentamicinu, penicilinu, streptomycinu a amfotericinu B. Používání antibiotik po delší dobu se však nedoporučuje, protože některá činidla (např. amfotericin B) mohou být pro buňky dlouhodobě toxická.

Většina primárních buněk prochází senescencí a po určitém počtu zdvojení populace se přestane dělit, proto je nezbytné je po izolaci udržet při životě. Dlouhodobá životaschopnost buněk vyžaduje odborné techniky kultivace buněk a ideální kultivační podmínky (včetně správného média, správné teploty, správné směsi plynů, správného pH, správné koncentrace růstových faktorů, přítomnosti živin a glukózy). Vzhledem k tomu, že mnoho růstových faktorů používaných k doplnění médií se získává ze zvířecí krve (složky pocházející z krve mají potenciál kontaminace), doporučuje se jejich použití minimalizovat nebo se jim zcela vyhnout. Je také důležité používat aseptickou techniku.

Subkultury a údržba

Když izolované buňky přilnou k povrchu kultivační misky, znamená to začátek udržovací fáze. K přilnutí obvykle dochází 24 hodin po zahájení kultivace. Buňky by měly být subkultivovány, když dosáhnou určitého procenta konfluence a aktivně se replikují. Vzhledem k tomu, že postkonfluentní buňky mohou po pasážování procházet diferenciací a vykazovat pomalejší proliferaci, je nejlepší subkultivovat primární buněčné kultury před dosažením 100% konfluence.

Subkultivace v čerstvých médiích udržuje exponenciální růst buněk závislých na ukotvení. Subkultivace monovrstev narušuje mezibuněčné a vnitrobuněčné interakce na povrchu buněk. Nízké koncentrace proteolytických enzymů, jako je trypsin/EDTA, se používají k extrakci adherentních primárních buněk z monovrstev nebo tkání. Po disociaci a zředění do roztoku s jednou buňkou se buňky spočítají a přenesou do čerstvých kultivačních nádob, aby se znovu připojily a rozmnožily.

Kryokonzervace a obnovení

Kryokonzervace uchovává živé buňky zmrazením při nízkých teplotách. Kryokonzervace a rozmrazování lidských primárních buněk zabraňuje odumírání a poškození buněk během skladování a používání. Lidské primární buňky se kryoprotekčně uchovávají pomocí DMSO nebo glycerolu (při správné teplotě a kontrolované rychlosti zmrazování). Proces zmrazování musí probíhat postupně, při -1 °C každou minutu, aby se zabránilo tvorbě ledových krystalů. Dlouhodobé skladování vyžaduje tekutý dusík (-196 °C) nebo teploty nižší než -130 °C.

K rozmrazení kryokonzervovaných buněk stačí ponořit je do vodní lázně o teplotě 37 °C na 1 až 2 minuty. Lidské primární buňky by se po rozmrazení z mrazničky neměly odstřeďovat (protože jsou extrémně citlivé na poškození během obnovy po kryokonzervaci). Je vhodný pro rozmnožování buněk ihned po rozmrazení a podporuje uchycení v kulturách během prvních 24 hodin po rozmrazení. 1 Po přichycení kryokonzervovaných primárních buněk je třeba odstranit použité médium (protože DMSO je pro primární buňky škodlivý a může způsobit pokles životaschopnosti po rozmrazení).