Клетките SK-MEL в прогнозата за отговор на имунотерапията

Революцията в имунотерапията промени лечението на меланома, като инхибиторите на контролните точки постигнаха трайни отговори при значителна част от пациентите. В Cytion осъзнаваме, че прогнозирането на това кои пациенти ще отговорят на имунотерапията остава критично предизвикателство, което изисква надеждни предклинични модели, които пресъздават взаимодействията между тумора и имунната система. Клетъчните линии на меланома SK-MEL осигуряват основни платформи за изучаване на молекулярните детерминанти на отговора към имунотерапията и идентифициране на биомаркери, които могат да насочат избора на пациенти за тези трансформиращи лечения.

Основни изводи

• Линиите SK-MEL показват променлива експресия на PD-L1, която оказва влияние върху отговора на контролните инхибитори
• Мутационното натоварване на тумора и представянето на неоантигени корелират с имуногенността
• Системите за съвместно култивиране с имунни клетки позволяват функционална оценка на противотуморния имунитет
• Интегритетът на сигналния път на интерферон-гама предсказва чувствителността към имунотерапия
• Механизмите на резистентност, включително дефекти в представянето на антигени, могат да бъдат моделирани in vitro

Панел на клетъчни линии за меланом SK-MEL

Серията SK-MEL включва множество меланомни клетъчни линии, получени от различни пациенти и метастатични участъци, което осигурява разнообразен панел за изучаване на хетерогенността на отговора към имунотерапията. Тези линии се различават по своите водещи мутации, експресия на имунни маркери и чувствителност към таргетни и имунобазирани терапии.

Нашите клетки SK-MEL-28 (300337 ) съдържат мутацията BRAF V600E, която се среща в приблизително 50 % от меланомите. Тази линия експресира умерени нива на PD-L1 и е широко използвана за изследване на взаимодействието между BRAF-таргетирана терапия и имунотерапия.

Клетките SK-MEL-5 (300157 ) също са носители на BRAF V600E, но проявяват различни имунологични свойства, което дава възможност за сравнителни изследвания на това как генетичният фон влияе върху имунното разпознаване. Клетките SK-MEL-1 (300424 ) и SK-MEL-2 (300423) представляват меланоми с див тип BRAF и различен статус на NRAS.

За по-широкообхватни изследвания на меланома нашите клетки A375 (300110 ) предоставят допълнителен модел на BRAF-мутант с добре характеризирани имунологични свойства.

Експресия на PD-L1 и отговор на блокадата на контролните точки

Експресията на лиганда на програмираната смърт 1 (PD-L1) върху туморните клетки служи като ключов биомаркер за отговора на инхибитора на контролната точка, въпреки че прогностичната му стойност е несъвършена. Линиите SK-MEL проявяват променлива конститутивна експресия на PD-L1, която може да бъде допълнително индуцирана от интерферон-гама, имитирайки механизма на адаптивна имунна резистентност, наблюдаван при туморите на пациентите.

Количественото определяне на повърхностния PD-L1 чрез флоуцитометрия позволява да се характеризират нивата на експресия в различните линии SK-MEL. Конститутивната експресия варира от ниска до умерена, като третирането с IFN-γ (10-50 ng/mL за 24-48 часа) драстично повишава PD-L1 в чувствителните линии.

Индуцируемостта на PD-L1 от IFN-γ показва ненарушена интерферонова сигнализация, която корелира с чувствителността към инхибитори на контролните точки. Линиите с дефектна JAK-STAT сигнализация показват нарушена индукция на PD-L1 и често проявяват резистентност към имунотерапия, моделирайки клинично значим механизъм на резистентност.

Системи за ко-култивиране на туморни и имунни клетки

Функционалната оценка на противотуморния имунитет изисква системи за ко-култивиране, които позволяват взаимодействие между SK-MEL клетките и имунните ефектори. Моноядрените клетки от периферна кръв (PBMCs) или пречистените популации от Т-клетки могат да бъдат култивирани съвместно с меланомни клетки, за да се оцени имунно-медиираното убиване.

Тестовете за цитотоксичност определят количествено убийството на Т-клетките на целите на SK-MEL чрез различни показания, включително освобождаване на хром, освобождаване на лактатдехидрогеназа (LDH) или мониторинг на импеданса в реално време. Антителата срещу контролните точки, добавени към тези ко-култури, могат да засилят цитотоксичността на Т-клетките, осигурявайки функционално потвърждение на блокадата на оста PD-1/PD-L1.

Тестовете за освобождаване на цитокини измерват секрецията на IFN-γ, TNF-α, гранзим В и перфорин от Т-клетките при съвместно култивиране с клетки SK-MEL. Засиленото производство на цитокини показва продуктивно активиране на Т-клетките, което може да предскаже отговора на имунотерапията in vivo.

Триизмерните сфероидни ко-култури моделират по-добре туморната микросреда, като включват пространствени ограничения, които влияят върху инфилтрацията и убиването на Т-клетките. SK-MEL сфероидите, ко-култивирани с Т-клетки, позволяват визуализиране на проникването на имунни клетки и убиването на прицелни клетки в тумороподобни структури.

Представяне на антигени и разпознаване на неоантигени

Ефективният противотуморен имунитет изисква разпознаване на туморните клетки чрез представяне на туморните антигени на Т-клетките чрез главния комплекс за хистосъвместимост (MHC). Линиите SK-MEL се различават по експресията на HLA клас I, което оказва пряко влияние върху имунното разпознаване и отговора на контролните точки на инхибиторите.

Анализът на типизирането и експресията на HLA характеризира капацитета за представяне на антигени на всяка линия SK-MEL. Загубата на HLA клас I чрез генетични промени (β2-микроглобулинови мутации, делеции на HLA гени) или епигенетично заглушаване представлява общ механизъм на резистентност към имунотерапия, който може да бъде моделиран с помощта на специфични SK-MEL линии.

Алгоритмите за предсказване на неоантигени анализират мутационния пейзаж на SK-MEL линиите, за да идентифицират потенциални специфични за тумора антигени. Линиите с по-голямо мутационно натоварване обикновено съдържат повече неоантигени, което корелира с повишена имуногенност и отговор на контролно-пропускателен инхибитор.

Моделиране на механизмите на резистентност

Разбирането на резистентността към имунотерапия е от съществено значение за разработването на стратегии за преодоляване на неуспеха на лечението. Клетките SK-MEL могат да се използват за моделиране на първични и придобити механизми на резистентност.

Мутациите на JAK1/2 нарушават сигнализацията на IFN-γ, която е от съществено значение за индукцията на PD-L1 и Т-клетъчно медиираното убиване. Линиите SK-MEL с разработени JAK мутации моделират този механизъм на резистентност и позволяват скрининг за стратегии за възстановяване на чувствителността.

загубата на β2-микроглобулин елиминира експресията на HLA клас I на повърхността, което прави туморните клетки невидими за цитотоксичните Т-клетки. Този механизъм се среща в приблизително 30 % от резистентните към имунотерапия меланоми и може да бъде моделиран чрез CRISPR нокаут в SK-MEL линии.

Препоръчани продукти за изследване на имунотерапията на меланома:

• Клетки SK-MEL-28 (300337) - BRAF V600E меланом
• Клетки SK-MEL-5 (300157) - меланом с мутация на BRAF
• Клетки SK-MEL-1 (300424) - меланом с див тип BRAF
• Клетки SK-MEL-2 (300423) - алтернативен модел на меланом
• Клетки A375 (300110 ) - Широко използвана меланомна линия