Първични човешки клетки

Какво представляват първичните човешки клетки?

Първичните клетки са най-чистото представяне на съответните им тъкани. Те се изолират от тъканта и се обработват, така че да могат да се установят в култура при идеални условия. Те по-точно имитират състоянието in vivo и проявяват нормална физиология, тъй като са получени от тъкан, а не са модифицирани. Поради това те могат да служат като полезни модели за изследвания в областта на клетъчната фармакология, токсикологията и физиологията (включително проучвания на метаболизма, стареенето и сигналната трансдукция). Имайте предвид, че първичните клетки са по-трудни за култивиране и поддържане в сравнение с непрекъснатата клетъчна линия, тъй като имат по-кратък жизнен цикъл и спират да се делят (или стареят) след определен брой клетъчни деления. Изследванията на клетъчните сигнални пътища се усложняват от присъщата вариабилност на първичните клетки, получени от донори и чрез практики на субкултивиране. Преди да започнат изследвания на сигнализацията, изследователите често провеждат скрининг, за да определят дали клетките реагират на често използвани стимули. За да се избегне загуба на време и пари, първичните клетки могат да бъдат стимулирани да активират основните сигнални пътища, преди да бъдат подложени на скрининг.

Защо да се използват човешки първични клетки?

Имуortalizirane клетъчни линии се използват често като клетъчен тест. Въпреки че учените са признали, че биологичните промени, дължащи се на клетъчните линии, могат да бъдат вредни при изучаването на тяхното физиологично значение. Използването на човешки първични клетки подобрява физиологичната стойност на данните, получени чрез клетъчни култури, и те все повече се считат за важни за изучаването на биологични процеси, развитието на заболявания и разработването на лекарства.

Човешките първични клетки се използват широко в in vitro изследвания на междуклетъчната и вътреклетъчната комуникация, биологията на развитието и механизмите, лежащи в основата на рака, болестта на Паркинсон и диабета, както и в много други области на предклиничните и изследователските биологични изследвания. Изследователите отдавна използват безсмъртни клетъчни линии за изучаване на функциите на тъканите; обаче клетъчните линии с очевидни мутации и хромозомни аномалии може да не са добри заместители на нормалните клетки и на развитието на заболяването в ранните му стадии. Сега може да се постигне по-точен модел на конкретен тип тъканни клетки чрез използване на човешки първични клетки, изолирани от съответната тъкан и поддържани в среди и добавки за култивиране на първични клетки.

Какво представлява първичната клетъчна култура?

Вместо да се използват безсмъртни клетъчни линии, първичната клетъчна култура включва отглеждане на клетки директно от многоклетъчен организъм извън тялото. В някои страни, като например Обединеното кралство, съществува правно признание на факта, че първичните клетъчни култури са по-представителни за in vivo тъканите, отколкото клетъчните линии. Въпреки това първичните клетки се нуждаят от подходящ субстрат и хранителни вещества, за да растат, и след определен брой деления те развиват фенотип на стареене, който ги кара да спрат окончателно да се делят. Тези два фактора са мотив за създаването на клетъчни линии. Както естествено безсмъртните първични клетки (например HeLa-клетките), така и изкуствено безсмъртните първични клетки (например HEK-клетките) могат да се култивират безкрайно дълго в клетъчна култура.

Човешки първични клетки по типове тъкани

Епителни клетки, фибробласти, кератиноцити, меланоцити, ендотелни клетки, мускулни клетки, имунни клетки и стволови клетки като мезенхимните стволови клетки са сред най-често използваните човешки първични клетки в научните изследвания. Като начало културите са хетерогенни (представляват смесица от клетъчни типове, присъстващи в тъканта) и могат да се поддържат живи in vitro само за определен период от време. Трансформацията е in vitro процес, който позволява човешките първични клетки да бъдат манипулирани за неограничен брой субкултури. Трансформацията може да се случи естествено или да бъде предизвикана от химикали или вируси. След преминаване през генетична трансформация първичната култура може да се дели безкрайно, превръщайки се в безсмъртна вторична клетъчна линия, ако ѝ се осигурят достатъчно хранителни вещества и пространство.

Ендотелиални клетки

Лечението на рак, заздравяването на рани, изследванията в областта на клетъчната сигнализация, скринингът с висока производителност и високо съдържание, както и токсикологичният скрининг са само някои от областите, които могат да се възползват от използването на първични ендотелиални клетки като изследователски инструмент.

Кератиноцити

Кератиноцитите, получени от епидермиса на кожата на възрастни хора или от препуциума на новородени, играят ключова роля в изследването на кожни заболявания като псориазис и рак.

Епителни клетки

От изследвания на рака до токсикологични проучвания, първичните епителни клетки са се доказали като безценен ресурс за моделиране на естествените защитни механизми на организма.

Фибробласти

Индуцирането на плюрипотентни стволови клетки (iPS) и изследването на заздравяването на рани са само някои от многото приложения на първичните фибробласти.

Имунни клетки

Мононуклеарните клетки от периферната кръв, накратко PBMC, са мононуклеарни клетки на кръвта с кръгло ядро. Те включват предимно лимфоцити и моноцити, които изпълняват важни функции в хода на имунния отговор. Мононуклеарните клетки от периферната кръв често се използват за диагностициране на инфекции или за установяване на евентуална ваксинална защита. Познаването на клетъчния имунен отговор, медииран от Т-клетките, често е от решаващо значение.

Меланоцити

Меланоцитите – специализираните кожни клетки, които произвеждат пигмента меланин – са полезни като модели за изследвания в области като заздравяване на рани, токсичност, меланом, реакцията на кожата към ултравиолетова (UV) радиация, кожни заболявания и козметика.

Стволови клетки

Стволовите клетки имат потенциал да се диференцират в голямо разнообразие от клетъчни типове. Благодарение на способността си за диференциация, те предоставят нови възможности за моделиране на човешка тъкан и здравословни състояния.

Мезенхимни стволови клетки

Мезенхимните стволови клетки, известни още като MSC, могат да бъдат получени от различни човешки източници като костен мозък, мастна тъкан, тъкан от пъпната връв (желето на Уортън) и амниотична течност (течността, обграждаща плода) и могат да бъдат размножавани in vitro. Тези възрастни стромални стволови клетки имат способността да се развиват в голямо разнообразие от клетъчни типове. Някои от тези клетъчни типове включват костни клетки, хрущялни клетки, мускулни клетки, нервни клетки, кожни клетки и клетки на роговицата.

Клетки на гладката мускулатура

Във вътрешността на кухите органи първичните гладкомускулни клетки (SMC) облицоват вътрешността и осигуряват контрактилитета. Освен при рак и други заболявания, SMC могат да се използват за моделиране на фиброза при хипертония.

Първични клетки и клетъчни линии

Чрез спонтанна мутация, както при трансформираните ракови клетъчни линии, или чрез целенасочена промяна, както при изкуственото създаване на ракови гени, непрекъснатите клетъчни линии са придобили способността да се размножават безкрайно (имуortalizirani). По правило непрекъснатите клетъчни линии са по-надеждни и удобни за работа в сравнение с първичните клетки. Те могат да се размножават безкрайно и осигуряват бърз достъп до важни данни. Използването на непрекъснати клетъчни линии има определени ограничения, включително факта, че те са генетично модифицирани/трансформирани, което може да промени физиологичните им характеристики и да не съответства на условията in vivo, както и че това може да се промени допълнително с течение на времето при значителен брой пасажи.

Напредък в култивирането на първични клетки

Първичните клетки са известни с това, че е трудно да се работи с тях. Процесът обаче става по-лесен от всякога благодарение на развитието в култивирането на първични клетки, наличието на търговски първични клетки с напълно оптимизирани протоколи и новите техники за анализ, които изискват по-малко усилия.

Преходът от двуизмерна към триизмерна клетъчна култура се счита за важен етап в тази област. Тъканно-специфичната архитектура, взаимодействията между клетките и механичните/биохимичните сигнали могат да бъдат отслабени в двуизмерна култура. По този начин биологичната стойност на тези култури е ограничена.

От друга страна, триизмерната клетъчна култура позволява на клетките да се размножават и да взаимодействат с триизмерна извънклетъчна структура. Това дава възможност на клетките да взаимодействат помежду си и с извънклетъчната матрица, което прави триизмерните култури по-физиологично релевантни. Точността на този метод при прогнозиране на реакциите in vivo го превърна в революционен в области като откриването и разработването на лекарства. Поради това най-съвременните технологии, като органоиди, получени от пациенти, и „органи на чип“, предоставят модели с висока степен на контекстуалност за скрининг и разработване на лекарства.

Получаването на първични клетки е пречка в първичната култура. Обикновено за преодоляването му е необходим по-голям обем тъкан, което може да се окаже трудно за постигане. Подобрената аналитична чувствителност обаче предлага път напред. Например, необходимостта от култивиране на големи количества първични клетки се намалява чрез използването на едноклетъчна технология, която включва секвениране, уестърн блотинг и масова цитометрия.

Обещаващи перспективи за култивирането на първични клетки

Общите трудности при култивирането на първични клетки се преодоляват благодарение на технологичните постижения. От своя страна този метод бързо измества другите като златен стандарт в изследванията и практиката в областта на клетъчната и молекулярната биология. Производството на ваксини, трансплантацията на органи, терапиите със стволови клетки, изследванията в областта на рака и много други области ще извлекат огромна полза от непрекъснатите напредъци в култивирането на първични клетки.

Съвети и трикове за култивирането на първични клетки

Нуждите от размножаване на клетките

Двата най-разпространени метода за култивиране на първични клетки са в суспензия или върху повърхност (2D). Някои клетки могат да плават свободно в кръвообращението, без изобщо да се прилепват към повърхност (например тези, получени от периферна кръв). Различни клетъчни линии са генетично модифицирани, за да процъфтяват в суспензионни култури, където могат да достигнат плътности, недостижими при 2D условия на растеж. Първичните клетки, които се нуждаят от закрепване, за да растат in vitro, се наричат адхезивни клетки и включват тези, които се срещат в твърдите тъкани. За да се подобрят адхезивните свойства и да се осигурят други сигнали, необходими за растежа и диференциацията, тези клетки обикновено се култивират в плосък, непокрит пластмасов съд, но понякога и върху микроносител. Последният вариант може да бъде покрит с протеини от екстрацелуларната матрица (като колаген и ламинин). Средата, използвана в клетъчната култура, се състои от основна среда, към която са добавени подходящи растежни фактори и цитокини. Клетъчният инкубатор е специален вид лабораторен инкубатор, използван за култивиране и поддържане на клетки при определена температура и газова смес (обикновено 37 °C, 5% CO₂ за клетки от бозайници). В зависимост от вида на култивираните клетки оптималните условия могат да бъдат много различни. В зависимост от видовете клетки, които се отглеждат, оптималната среда за растеж ще има уникална комбинация от фактори, включително, но не само, рН, концентрация на глюкоза, растежни фактори и наличието на други хранителни вещества.

Антибиотиците в средата за растеж са от решаващо значение по време на създаването на първичната култура, за да се предотврати замърсяване от тъканта на гостоприемника. Някои антибиотични режими включват комбинация от гентамицин, пеницилин, стрептомицин и амфотерицин В. Използването на антибиотици за продължителен период от време обаче не се препоръчва, тъй като някои реагенти (като амфотерицин В) могат да бъдат токсични за клетките в дългосрочен план.

Повечето първични клетки преминават през стареене и спират да се делят след определен брой удвоявания на популацията, което прави жизненоважно поддържането им живи след изолирането. Дългосрочната жизнеспособност на клетките изисква експертни техники за култивиране на клетки и идеални условия за култивиране (включително подходяща среда, подходяща температура, подходяща газова смес, подходящо рН, подходяща концентрация на растежни фактори, наличие на хранителни вещества и наличие на глюкоза). Тъй като много от растежните фактори, използвани за обогатяване на средите, се получават от животинска кръв (съставките, извлечени от кръв, крият риск от замърсяване), се препоръчва тяхната употреба да бъде сведена до минимум или изцяло избягвана. Също така е важно да се използва асептична техника.

Поднасяне и поддържане

Когато изолираните клетки се прикрепят към повърхността на културалната чашка, това бележи началото на фазата на поддържане. Прикрепването обикновено настъпва 24 часа след започването на култивирането. Клетките трябва да се субкултивират, когато достигнат определен процент на конфлуентност и се размножават активно. Тъй като клетките след достигане на конфлуентност могат да претърпят диференциация и да проявят по-бавна пролиферация след пасаж, най-добре е първичните клетъчни култури да се субкултивират, преди да достигнат 100% конфлуентност.

Повторното култивиране в свежа среда поддържа експоненциалния растеж на клетките, зависими от прикрепване. Повторното култивиране на монослоеве нарушава междуклетъчните и вътреклетъчните взаимодействия на клетъчната повърхност. Използват се ниски концентрации на протеолитични ензими, като трипсин/EDTA, за извличане на адхезивни първични клетки от монослоеве или тъкани. След като бъдат дисоциирани и разредени в разтвор от единични клетки, клетките се преброяват и се прехвърлят в свежи културални съдове, за да се прикрепят отново и да се размножат.

Криоконсервация и възстановяване

Криоконсервацията съхранява живите клетки чрез замразяването им при ниски температури. Криоконсервацията и размразяването на човешки първични клетки предотвратяват клетъчната смърт и увреждането по време на съхранение и употреба. Човешките първични клетки се криозащитават с DMSO или глицерол (при подходяща температура и с контролирана скорост на замразяване). Процесът на замразяване трябва да бъде постепенен, с температура, която спада с -1 °C на минута, за да се предотврати образуването на ледени кристали. Дългосрочното съхранение изисква течен азот (-196 °C) или температури под -130 °C.

За размразяването на криоконсервираните клетки е достатъчно замразените клетки да се потопят във водна баня с температура 37 °C за около 1 до 2 минути. Първичните човешки клетки не трябва да се центрофугират след изваждането им от фризера (тъй като са изключително чувствителни към увреждане по време на възстановяването след криоконсервация). Подходящо е за засяване на клетките веднага след размразяването и спомага за прикрепването им в културите през първите 24 часа след засяването. 1 След като криоконсервираните първични клетки се прикрепят, отработената среда трябва да бъде отстранена (тъй като DMSO е вредно за първичните клетки и може да доведе до спад в жизнеспособността след размразяването).