Човешки първични клетки

Какво представляват човешките първични клетки?

Първичните клетки са най-чистите представители на съответните тъкани. Те се изолират от тъканта и се обработват така, че да могат да се установят в култивационна среда с идеални условия. Те по-точно имитират състоянието in vivo и показват нормална физиология, тъй като са получени от тъкан, а не са модифицирани. Поради това те могат да служат като полезни модели за изследвания в областта на клетъчната фармакология, токсикологията и физиологията (включително изследвания на метаболизма, стареенето и предаването на сигнали). Имайте предвид, че първичните клетки са по-трудни за култивиране и поддържане от непрекъснатите клетъчни линии, тъй като имат по-кратък живот и спират да се делят (или стареят) след определен брой клетъчни деления. Проучванията на пътищата на клетъчната сигнализация се усложняват от присъщата променливост на първичните клетки, получени от донори и чрез практики за субкултивиране. Преди да започнат проучвания на сигналите, изследователите често провеждат скрининг, за да определят дали клетките реагират на често използвани стимули. За да се избегне загубата на време и средства, първичните клетки могат да бъдат стимулирани да активират основните сигнални пътища преди скрининга.

Защо да използвате човешки първични клетки?

Имортализираните клетъчни линии обикновено се използват като клетъчен тест. Въпреки че учените признават, че биологичните промени, дължащи се на клетъчни линии, могат да бъдат вредни при изучаването на физиологичното им значение. Използването на човешки първични клетки подобрява физиологичната стойност на данните, получени чрез клетъчни култури, и все повече се счита, че те са важни за изучаване на биологичните процеси, развитието на болестите и разработването на лекарства.

Човешките първични клетки се използват широко в in vitro изследвания на междуклетъчната и вътреклетъчната комуникация, биологията на развитието и механизмите, които са в основата на рака, болестта на Паркинсон и диабета, наред с много други предклинични и изследователски биологични области. Изследователите отдавна използват безсмъртни клетъчни линии за изследване на функциите на тъканите; клетъчните линии с очевидни мутации и хромозомни аномалии обаче може да не са добри заместители на нормалните клетки и на развитието на заболяването в ранните му етапи. По-точен модел на определен тип тъканни клетки вече може да се постигне чрез използване на човешки първични клетки, изолирани от тази тъкан и поддържани в първични клетъчни среди и добавки.

Какво представлява първичната клетъчна култура?

Вместо да се използват имортализирани клетъчни линии, първичната клетъчна култура включва отглеждане на клетки директно от многоклетъчен организъм извън тялото. В някои държави, като например Обединеното кралство, съществува правно признание на факта, че първичните клетъчни култури са по-представителни за тъканите in vivo, отколкото клетъчните линии. Въпреки това първичните клетки се нуждаят от подходящ субстрат и хранителни вещества, за да растат, и след определен брой деления развиват фенотип на стареене, който ги кара да спрат окончателно да се делят. Тези два фактора мотивират създаването на клетъчни линии. Както естествено обезсмъртените първични клетки (напр. HeLa клетки), така и изкуствено обезсмъртените първични клетки (напр. HEK клетки) могат да се отглеждат неограничено време в клетъчна култура.

Човешки първични клетки по типове тъкани

Епителните клетки, фибробластите, кератиноцитите, меланоцитите, ендотелните клетки, мускулните клетки, имунните клетки и стволовите клетки, като мезенхимните стволови клетки, са сред най-често използваните човешки първични клетки в научните изследвания. По начало културите са хетерогенни (представляват смесица от клетъчни типове, присъстващи в тъканта) и могат да бъдат поддържани живи in vitro само за определен период от време. Трансформацията е in vitro процес, който позволява манипулирането на човешки първични клетки за неограничен брой субкултури. Трансформацията може да се осъществи по естествен път или да бъде предизвикана от химикали или вируси. След като бъде подложена на генетична трансформация, една първична култура може да се дели неограничено в безсмъртна вторична клетъчна линия, ако ѝ се предоставят достатъчно хранителни вещества и пространство.

Ендотелни клетки

Лечението на рак, заздравяването на рани, изследванията на клетъчната сигнализация, високопроизводителните и високосъдържателните скрининги и токсикологичните скрининги са само някои от областите, които могат да се възползват от използването на първични ендотелни клетки като изследователски инструмент.

Кератиноцити

Кератиноцитите, получени от епидермиса на възрастна човешка кожа или на неонатална препуциумна кожа, играят ключова роля в изследването на кожни заболявания като псориазис и рак.

Епителни клетки

От изследвания на рака до токсикологични проучвания, първичните епителни клетки са се доказали като безценен ресурс за моделиране на естествените защитни сили на организма.

Фибробласти

Индуцирането на плурипотентни стволови клетки (iPS) и изучаването на заздравяването на рани са само някои от многото приложения на първичните фибробласти.

Имунни клетки

Мононуклеарните клетки на периферната кръв, съкратено PBMC, са едноядрени клетки на кръвта с кръгло клетъчно ядро. Те включват главно лимфоцити и моноцити, които поемат важни функции в хода на имунния отговор. Мононуклеарните клетки на периферната кръв често се използват за диагностициране на инфекции или за откриване на евентуална защита от ваксинация. Вникването в клетъчния имунен отговор, медииран от Т-клетките, често е от решаващо значение.

Меланоцити

Меланоцитите, специализираните кожни клетки, които произвеждат пигмента меланин, са полезни като модели за изследвания на теми като заздравяване на рани, токсичност, меланом, кожен отговор на ултравиолетовата (UV) радиация, кожни заболявания и козметика.

Стволови клетки

Стволовите клетки имат потенциала да се диференцират в голямо разнообразие от клетъчни типове. Благодарение на способността си да се диференцират те предоставят нови възможности за моделиране на човешки тъкани и здравословни състояния.

Мезенхимни стволови клетки

Мезенхимните стволови клетки, известни също като MSCs, могат да бъдат получени от различни човешки източници, като костен мозък, мазнини (мастна тъкан), тъкан от пъпна връв (желе на Уортън) и амниотична течност (течността около плода), и могат да бъдат разширени in vitro. Тези стромални стволови клетки за възрастни имат способността да се развиват в голямо разнообразие от клетъчни типове. Някои от тези клетъчни типове включват костни клетки, хрущялни клетки, мускулни клетки, невронни клетки, кожни клетки и клетки на роговицата.

Гладки мускулни клетки

В кухите органи първичните гладкомускулни клетки (SMC) облицоват вътрешността и медиират контрактилността. Освен при рак и други заболявания SMC могат да се използват за моделиране на хипертонична фиброза.

Първични клетки и клетъчни линии

Или чрез спонтанна мутация, както е при трансформираните ракови клетъчни линии, или чрез умишлено изменение, както е при изкуственото производство на ракови гени, непрекъснатите клетъчни линии са придобили потенциала да се възпроизвеждат безкрайно (безсмъртни). По правило непрекъснатите клетъчни линии са по-надеждни и удобни за работа от първичните клетки. Те могат да се разширяват неограничено и осигуряват бърз достъп до важни данни. Използването на непрекъснати клетъчни линии има някои ограничения, включително факта, че те са генетично модифицирани/трансформирани, което може да промени физиологичните характеристики и да не съответства на състоянието in vivo, както и че това може допълнително да се промени с течение на времето при значително пасиране.

Напредък в областта на първичните клетъчни култури

Първичните клетки имат лоша репутация на трудни за работа. Процесът обаче става по-лесен от всякога благодарение на развитието на първичните клетъчни култури, наличието на търговски първични клетки с напълно оптимизирани протоколи и нови техники за анализ, които изискват по-малко входни данни.

Преминаването от двуизмерни към триизмерни клетъчни култури се счита за важен етап в тази област. Специфичната за тъканите архитектура, взаимодействията между клетките и механичните/биохимичните сигнали могат да бъдат отслабени в двуизмерна култура. По този начин биологичната стойност на тези култури е ограничена.

От друга страна, 3D клетъчните култури позволяват на клетките да се разширяват и да взаимодействат с 3D извънклетъчна рамка. Това позволява на клетките да взаимодействат помежду си и с извънклетъчния матрикс, което прави 3D културите по-физиологични. Точността, с която този метод предсказва реакциите in vivo, го прави революционен в области като откриването и разработването на лекарства. Поради тази причина най-съвременните технологии, като органоиди, получени от пациенти, и органи върху чип, осигуряват силно контекстуални модели за скрининг и разработване на лекарства.

Генерирането на първични клетки е тясно място в първичната култура. Обикновено за преодоляването на този проблем е необходим по-голям обем тъкан, което може да се окаже предизвикателство за постигане. Подобрената аналитична чувствителност обаче дава възможност за напредък. Например необходимостта от култивиране на големи количества първични клетки се намалява чрез използване на едноклетъчна технология, която включва секвениране, Western blotting и масова цитометрия.

Обещаващи перспективи за култивирането на първични клетки

Общите трудности, свързани с култивирането на първични клетки, се смекчават от технологичния напредък. На свой ред този метод бързо измества други като златен стандарт в изследванията и практиката на клетъчната и молекулярната биология. Производството на ваксини, заместването на органи, терапиите със стволови клетки, изследванията на рака и много други ще извлекат големи ползи от непрекъснатия напредък в областта на първичните клетъчни култури.

Съвети и трикове за първична клетъчна култура

Нуждите от разширяване на клетките

Двата най-разпространени метода за култивиране на първични клетки са в суспензия или върху повърхност (2D). Някои клетки могат да плуват свободно в кръвообращението, без да се прилепват към повърхност (например тези, получени от периферна кръв). Различни клетъчни линии са разработени така, че да се развиват в суспензионни култури, където могат да достигнат плътност, непостижима при 2D условия на растеж. Първичните клетки, които се нуждаят от закрепване, за да растат in vitro, се наричат адхерентни клетки и включват тези, които се намират в твърдите тъкани. За да се подобрят адхезивните свойства и да се осигурят други сигнали, необходими за растежа и диференциацията, тези клетки обикновено се култивират в плосък пластмасов съд без покритие, но понякога и в микроносител. Последният вариант може да бъде покрит с протеини на извънклетъчния матрикс (като колаген и ламинин). Средата, използвана в клетъчната култура, се състои от основна среда, която е допълнена с подходящи растежни фактори и цитокини. Клетъчният инкубатор е специален вид лабораторен инкубатор, използван за култивиране и поддържане на клетки при определена температура и газова смес (обикновено 37 °C, 5 % CO2 за клетките на бозайниците). В зависимост от вида на култивираната клетка оптималните условия могат да бъдат много различни. В зависимост от видовете клетки, които се отглеждат, оптималната среда за растеж ще има уникална комбинация от фактори, включително, но не само, рН, концентрация на глюкоза, растежни фактори и наличие на други хранителни вещества.

Антибиотиците в растежната среда са от решаващо значение по време на създаването на първична култура, за да се предотврати замърсяване от тъканта на гостоприемника. Някои антибиотични режими включват комбинация от гентамицин, пеницилин, стрептомицин и амфотерицин В. Използването на антибиотици за продължителен период от време обаче не се препоръчва, тъй като някои реактиви (като амфотерицин В) могат да бъдат токсични за клетките в дългосрочен план.

Повечето първични клетки преминават през стареене и спират да се делят след определен брой удвоявания на популацията, поради което е от решаващо значение да се поддържат живи след изолирането им. Дългосрочната жизнеспособност на клетките изисква експертни техники за култивиране на клетки и идеални условия за култивиране (включително подходяща среда, подходяща температура, подходяща газова смес, подходящо рН, подходяща концентрация на растежни фактори, наличие на хранителни вещества и наличие на глюкоза). Тъй като много от растежните фактори, използвани за допълване на средите, се получават от животинска кръв (съставките, получени от кръвта, притежават потенциал за замърсяване), се препоръчва тяхната употреба да се сведе до минимум или да се избягва напълно. Също така е важно да се използва асептична техника.

Субкултури и поддръжка

Когато клетките в изолация се придържат към повърхността на блюдото за култура, това бележи началото на фазата на поддържане. Прикрепването обикновено се случва 24 часа след началото на култивирането. Клетките трябва да се субкултивират, когато са достигнали определен процент на конфлуенция и се репликират активно. Тъй като постконфлуентните клетки могат да претърпят диференциация и да проявят по-бавна пролиферация след пасажа, най-добре е първичните клетъчни култури да се субкултивират, преди да достигнат 100 % конфлуентност.

Субкултивирането в свежа среда поддържа експоненциалния растеж на клетките, зависими от закотвянето. Субкултивирането на монослоеве нарушава междуклетъчните и вътреклетъчните взаимодействия на клетъчната повърхност. Ниски концентрации на протеолитични ензими, като трипсин/EDTA, се използват за извличане на адхерентни първични клетки от монослоеве или тъкани. След като бъдат дисоциирани и разредени в едноклетъчен разтвор, клетките се преброяват и се прехвърлят в свежи контейнери за култивиране, за да се свържат отново и да се размножат.

Криоконсервация и възстановяване

Криоконсервацията запазва живи клетки чрез замразяването им при ниски температури. Криоконсервирането и размразяването на човешки първични клетки предотвратява смъртта и увреждането на клетките по време на съхранението и използването им. Човешките първични клетки се криозащитават с помощта на DMSO или глицерол (при подходяща температура и контролирана скорост на замразяване). Процесът на замразяване трябва да бъде постепенен, при -1 °C всяка минута, за да се предотврати образуването на ледени кристали. Дългосрочното съхранение изисква течен азот (-196 °C) или температури под -130 °C.

За размразяване на криоконсервирани клетки е достатъчно да се потопят замразени клетки във водна баня с температура 37 °C за около 1 до 2 минути. Човешките първични клетки не трябва да се центрофугират след размразяването им от фризера (тъй като са изключително чувствителни към увреждане по време на възстановяването им от криоконсервация). Подходящ е за нанасяне на клетки веднага след размразяването им и насърчава прикрепването в културите през първите 24 часа след нанасянето. 1 След като криоконсервираните първични клетки се прикрепят, отработената среда трябва да се отстрани (тъй като DMSO е вреден за първичните клетки и може да доведе до спад в жизнеспособността след размразяването).