Платформи за високопроизводителен скрининг на GPCR на базата на HEK клетки

Рецепторите, свързани с G протеини (GPCR), представляват най-голямото семейство мембранни протеини в човешкия геном и представляват приблизително 34 % от всички лекарствени цели. В Cytion осъзнаваме, че разработването на ефективни терапевтични продукти, насочени към GPCR, изисква надеждни клетъчни скринингови платформи, способни да измерват точно активирането на рецепторите на хиляди до милиони съединения. Клетките HEK293 се превърнаха в предпочитан гостоприемник за експресия на GPCR и функционален скрининг, предлагайки уникална комбинация от ефективна експресия на рецептори, нисък ендогенен рецепторен фон и съвместимост с различни формати за анализ.

Основни изводи

• Клетките HEK293 осигуряват идеален фон за хетероложна експресия на GPCR с минимална намеса от ендогенни рецептори
• Множество формати за анализ - калциев поток, cAMP, набиране на β-арестин - позволяват цялостно изследване на пътищата
• Автоматизираната обработка на течности и четецът на плаки дават възможност за скрининг с производителност над 100 000 съединения на ден
• Стратегиите за разработване на стабилни клетъчни линии балансират изискванията за производителност с последователността на анализите
• Откриването на предубеден агонизъм изисква мултиплексирано отчитане в различни сигнални каскади

Защо клетките HEK293 са отлични при скрининг на GPCR

Клетките HEK293 се превърнаха в де факто стандарт за функционални тестове на GPCR поради няколко присъщи предимства. Първо, тяхната относително ниска ендогенна експресия на GPCR свежда до минимум фоновата сигнализация, която може да обърка изследванията на хетероложни рецептори. За разлика от някои клетъчни линии, получени от рак, които експресират многобройни GPCR на функционално значими нива, клетките HEK293 осигуряват чисто платно за експресия на рецептори.

Второ, клетките HEK293 експресират всички основни подкласове G протеини (Gαs, Gαi, Gαq, Gα12/13) на нива, достатъчни за поддържане на разнообразни рецепторни връзки. Този пълен сигнален репертоар дава възможност за изследване на естествените взаимодействия между рецепторите и протеините, без да се изисква съвместна експресия на специфични G протеинови субединици.

Трето, клетките HEK293 се трансфектират ефикасно, като се използват множество класове реактиви и се постига степен на трансфекция, надвишаваща 90 %. Тази ефективност се изразява във високи нива на експресия на рецепторите - обикновено от 10⁵ до 10⁶ рецептори на клетка - осигурявайки стабилни прозорци за сигнал дори за рецептори със скромна ефективност на свързване.

Нашите клетки HEK293T (300189 ) предлагат особено висока ефективност на трансфекция за преходна експресия на GPCR, което ги прави идеални за първоначално характеризиране на рецептори и разработване на тестове, преди да се пристъпи към създаване на стабилни клетъчни линии.

Избор на формат за анализ за скрининг на GPCR

Изследвания на калциев поток: Gαq-свързаните рецептори активират фосфолипаза С, като предизвикват освобождаване на калций от вътреклетъчните запаси. Калциево-чувствителните флуоресцентни багрила като Fluo-4, Fura-2 или генетично кодирани калциеви индикатори позволяват измерване на тази реакция в реално време. Флуоресцентните четци, базирани на плочи, като FLIPR, могат да измерват едновременно калциевите преходи в цели 384- или 1536-ямкови плочи, като постигат производителност, надвишаваща 100 000 точки данни на ден.

изследвания на cAMP: Gαs-свързаните рецептори стимулират аденилилциклазата, като увеличават вътреклетъчния cAMP, докато Gαi-свързаните рецептори инхибират производството на cAMP. Множество технологии за анализ откриват промените в cAMP, включително конкурентни имуноанализи (HTRF, AlphaScreen), биосензорни подходи (GloSensor) и анализи на репортерни гени (CRE-луцифераза). Всеки от тях предлага различни предимства по отношение на чувствителността, кинетиката и производителността.

набиране на β-арестин: Активирането на GPCR предизвиква набиране на β-арестин към рецептора - процес, който може да се измери чрез анализи за комплементация на протеини. Технологии като PathHunter (допълване на ензимни фрагменти) и NanoBiT (разделяне на луцифераза) осигуряват чувствителни, независими от пътя отчитания, приложими за всички класове рецептори, независимо от предпочитанията за свързване на G протеини.

Изследвания с репортерни гени: Транскрипционните репортерни системи измерват сигналните събития надолу по веригата, като предлагат усилване, което повишава чувствителността. Репортерите с CRE-луцифераза откриват активирането на пътя на цАМФ, NFAT-луциферазата реагира на калциевите сигнали, а SRE-луциферазата следи множество пътища. Макар и по-бавни от директните измервания на втория пратеник, репортерните анализи осигуряват отлично съотношение сигнал-фон.

Стратегии за разработване на стабилни клетъчни линии

Кампаниите за високопроизводителен скрининг обикновено изискват стабилни клетъчни линии, които експресират целевия GPCR на постоянни нива в милиарди ямки за анализ. Разработването на стабилни линии започва с проектиране на вектори, включващи както рецептора, така и селективен маркер, което позволява обогатяване на стабилно трансфектирани клетки.

Нашите клетки HEK293 (300192 ) служат като стандартна родителска линия за генериране на стабилни клетъчни линии. След трансфекция и антибиотична селекция (обикновено 2-4 седмици) оцелелите клетки се подлагат на едноклетъчно клониране чрез ограничаване на разреждането или флуоресцентно активирано клетъчно сортиране (FACS). След това отделните клонове се разширяват и характеризират по отношение на нивото на експресия на рецептора, величината на функционалния отговор и устойчивостта на теста.

Критичните атрибути на качеството за скрининг на клетъчни линии включват стабилност на експресията при продължително пасиране, последователна фармакология в сравнение с референтните стандарти и стабилна работа в миниатюрни формати на плаки. Банките от квалифицирани клетки трябва да бъдат създадени в началото на кампанията за скрининг, за да се осигури постоянна ефективност през цялото време.

За ускоряване на сроковете нашите HEK293 EBNA клетки (300264 ) позволяват стабилна експресия от епизомални вектори, като потенциално намаляват сроковете за разработване, запазвайки последователността на експресията.

Съображения за миниатюризация и автоматизация

Максималното увеличаване на производителността на скрининга изисква миниатюризация до 384-ямкови, 1536-ямкови или дори 3456-ямкови формати. Клетките HEK293 се адаптират добре към напластяване с висока плътност в намалени обеми, въпреки че може да се наложи оптимизиране на клетъчната плътност, условията за напластяване и времето за инкубиране за всеки преход към друг формат.

Клетките HEK293, адаптирани към суспензия, предлагат предимства за автоматизирани работни процеси за скрининг. Нашите адаптирани към суспензия клетки HEK293 (300686 ) могат да бъдат дозирани директно от съдовете за култивиране в плаките за анализ без трипсинизация, което намалява стъпките за обработка и подобрява последователността. Тази съвместимост с автоматизираните машини за обработка на течности дава възможност за провеждане на истински скринингови кампании "walkaway".

Изискванията за стабилност на плаките за анализ варират в зависимост от формата. Изследванията на калциевия поток обикновено изискват измерване в рамките на часове след зареждането с багрило, докато изследванията на cAMP и β-арестин могат да позволят инкубиране за една нощ преди отчитане. Разбирането на тези ограничения дава информация за логистиката на скрининга и планирането на оборудването.

Анализ на данните и идентифициране на попадения

Кампаниите за скрининг на GPCR генерират огромни масиви от данни, изискващи надеждни конвейери за анализ. Статистическите параметри, включително коефициентът Z, съотношението сигнал-фон и коефициентът на вариация, оценяват качеството на анализа за всяка плака поотделно. Плаките, които не отговарят на праговете за качество, трябва да се повтарят, а не да се анализират.

Критериите за идентифициране на попаденията балансират между чувствителността и фалшиво положителните резултати. Праговете на активност от 50 % активиране или инхибиране спрямо референтните съединения осигуряват разумни отправни точки, въпреки че оптималните граници зависят от състава на библиотеката и целите на програмата. Потвърждаването на реакцията на концентрацията на първичните попадения елиминира артефактите и подрежда съединенията за последващи действия.

Съвременното откриване на лекарства за GPCR все повече набляга на пристрастния агонизъм - съединения, които преференциално активират определени сигнални пътища в сравнение с други. Откриването на пристрастни съединения изисква паралелни тестове, измерващи множество пътища (напр. активиране на G-протеин срещу набиране на β-арестин), като се обръща специално внимание на чувствителността и кинетиката на тестовете, за да се избегне техническо отклонение.

Препоръчителни продукти за скрининг на GPCR:

• Клетки HEK293T (300189 ) - Високоефективна преходна експресия
• Клетки HEK293 (300192 ) - генериране на стабилна клетъчна линия
• HEK293, адаптирани към суспензия (300686) - Автоматизирани работни процеси за скрининг
• HEK293 EBNA клетки (300264 ) - Ускорено разработване на стабилни линии
• DMEM с високо съдържание на глюкоза (820300a ) - Стандартна среда за култивиране