Метаболитно инженерство на HEK293 за засилено гликозилиране на протеини

Гликозилирането е една от най-критичните посттранслационни модификации, които влияят върху ефикасността, стабилността и имуногенността на терапевтичните протеини. В Cytion разбираме, че производството на рекомбинантни протеини с оптимални гликанови профили изисква задълбочено разбиране на клетъчния метаболизъм и механизма на гликозилиране. Клетките HEK293 предлагат уникално изгодна платформа за производство на гликопротеини, тъй като техният човешки произход осигурява подобни на нативните модели на гликозилиране, които точно отразяват ендогенните човешки протеини - решаващо предимство пред нечовешките експресионни системи.

Основни изводи

• Клетките HEK293 произвеждат съвместими с човешкия организъм гликанови структури, които превъзхождат клетките CHO за определени терапевтични продукти
• Добавянето на нуклеотидни захарни прекурсори директно повишава заемането на местата за гликозилиране
• Условията на култивиране, включително температурата, рН и разтвореният кислород, оказват силно влияние върху гликановите профили
• Подходите на генното инженерство позволяват персонализиране на гликановите структури за специфични терапевтични приложения
• Стратегиите за аналитично характеризиране са от съществено значение за оценката на качеството на гликопротеините

Предимството на клетките HEK293 по отношение на гликозилирането

Клетките от човешки ембрионален бъбрек 293 притежават различни възможности за гликозилиране, които ги отличават от други системи за експресия при бозайниците. За разлика от клетките от яйчници на китайски хамстер (CHO), които произвеждат изключително α2,3-свързани сиалови киселини, клетките HEK293 експресират както α2,3-, така и α2,6-сиалилтрансферази, като генерират гликанови структури, които в по-голяма степен наподобяват естествените човешки гликопротеини.

Това разграничение има значителни терапевтични последици. Много човешки серумни гликопротеини, включително имуноглобулини и фактори на кръвосъсирването, съдържат значителен дял от α2,6-свързана сиалова киселина. Следователно терапевтичните протеини, произведени в клетки HEK293, могат да имат по-добри фармакокинетични профили и намалена имуногенност в сравнение с техните аналози, получени от CHO.

Нашите клетки HEK293 (300192 ) осигуряват отлична отправна точка за производство на гликопротеини, като предлагат стабилни характеристики на растеж, като същевременно поддържат естествен механизъм за гликозилиране. За приложения, изискващи повишена ефективност на трансфекцията, нашите клетки HEK293T (300189 ) позволяват бързи изследвания на експресията.

Метаболизъм на нуклеотидните захари и инженерство на прекурсорите

Ефективността на гликозилирането зависи основно от наличието на донори на нуклеотидни захари в ендоплазмения ретикулум и апарата на Голджи. Тези активирани захарни молекули - включващи UDP-глюкоза, UDP-галактоза, UDP-N-ацетилглюкозамин, GDP-маноза, GDP-фукоза и CMP-сиалова киселина - служат като субстрати за гликозилтрансферазите, които изграждат гликановите вериги.

Подходите на метаболитното инженерство могат да увеличат пуловете от нуклеотидни захари чрез няколко механизма. Директното добавяне на хранителни среди с монозахариди като галактоза, маноза или N-ацетилманозамин (ManNAc) осигурява субстрати за спасителния път, които клетките могат да преобразуват в съответните нуклеотидни захари. Доказано е, че добавянето на ManNAc в концентрация 10-40 mM значително увеличава нивата на сиалиране в различни клетъчни линии.

Генетичните подходи предлагат по-трайни решения. Свръхекспресията на ключови ензими в биосинтетичните пътища на нуклеотидните захари - включително CMP-сиалова киселина синтетаза, UDP-глюкоза пирофосфорилаза или GDP-маноза пирофосфорилаза - може трайно да повиши пуловете от прекурсори, без да изисква добавяне на среда.

Оптимизиране на условията на културата за качеството на гликаните

Параметрите на околната среда оказват дълбоко въздействие върху резултатите от гликозилирането, като често съперничат на генетичните модификации по отношение на въздействието им върху профилите на гликаните. Понижаването на температурата от 37°C на 32-34°C по време на производствената фаза последователно показва, че подобрява сиалирането, вероятно чрез комбинация от удължено време за престой на протеините в Голджи и намалена сиалидазна активност.

PH на културата влияе както върху активността на гликозилтрансферазата, така и върху стабилността на гликаните. Поддържането на рН между 6,8 и 7,2 обикновено подпомага оптималното гликозилиране, въпреки че специфичният оптимум може да варира в зависимост от целевия протеин и желания гликанов профил. Стойности на рН под 6,5 могат да насърчат разцепването на сиаловата киселина, намалявайки терминалното сиалилиране.

Нивата на разтворения кислород влияят на клетъчния метаболизъм и съответно на гликозилирането. Докато хипоксичните условия (под 20 % наситеност на въздуха) могат да влошат клетъчния растеж и продуктивност, умерените нива на кислород (30-50 % наситеност на въздуха) обикновено подпомагат стабилното гликозилиране. Хипероксичните условия могат да генерират реактивни кислородни видове, които увреждат гликопротеините или пречат на механизмите за гликозилиране.

Нашата среда DMEM:Ham's F12 (1:1) (820400a ) осигурява отлична базова формула за производство на гликопротеини, предлагайки балансиран състав на хранителните вещества, който поддържа както клетъчния растеж, така и посттранслационната обработка.

Генетично инженерство за персонализирано гликозилиране

Съвременните инструменти за генно инженерство позволяват прецизно модифициране на възможностите на HEK293 за гликозилиране, за да се произвеждат протеини с персонализирани гликанови структури. Технологията CRISPR/Cas9 направи революция в тази област, позволявайки ефективно изключване на специфични гликозилтрансферази или въвеждане на нови ензимни дейности.

Афукозилираните антитела представляват важно приложение на гликоинженерството. Нокаутирането на гена FUT8, кодиращ α1,6-фукозилтрансферазата, елиминира основното фукозилиране от N-гликаните. Афукозилираните антитела демонстрират драстично повишена антитяло-зависима клетъчна цитотоксичност (ADCC), което е желано свойство за онкологичните терапии.

Обратно, свръхекспресията на гликозилтрансферази може да засили специфичните модификации. Въвеждането на β1,4-N-ацетилглюкозаминтрансфераза III (GnT-III) води до образуване на антитела с бисектиращ N-ацетилглюкозамин - друга модификация, свързана с подобрена ефекторна функция. Свръхекспресията на галактозилтрансферази и сиалилтрансферази увеличава крайното затваряне на гликана, което потенциално подобрява серумния полуживот.

За приложения, свързани със суспензионни култури, които поддържат широкомащабно производство на гликопротеини, нашите HEK293 клетки, адаптирани към суспензия (300686 ), могат да бъдат допълнително разработени, за да включват желаните модификации на гликозилиране.

Аналитични стратегии за оценка на гликозилирането

Цялостното охарактеризиране на гликаните изисква множество допълващи се аналитични подходи. Анализът на освободени гликани с помощта на течна хроматография с хидрофилно взаимодействие (HILIC) с флуоресцентна детекция осигурява подробно профилиране на гликаните с отлична чувствителност. Масспектрометрията добавя структурно потвърждение и позволява идентифицирането на неочаквани модификации.

Анализът на специфичното за мястото гликозилиране е насочен към хетерогенността, присъща на гликопротеините. Гликопептидното картографиране с помощта на LC-MS/MS разкрива както заетостта на отделните места за гликозилиране, така и гликановите структури, присъстващи на всяко място. Тази информация се оказва от решаващо значение за разбирането на връзките между структурата и функцията и за осигуряването на последователност между партидите.

Бързите методи за скрининг подпомагат разработването на процеси и контрола на качеството. Тестове, базирани на лектини, капилярна електрофореза и гликан-специфични антитела позволяват високопроизводителна оценка на ключови гликанови атрибути, без да се изисква продължителна подготовка на пробите.

Препоръчителни продукти за производство на гликопротеини:

• Клетки HEK293 (300192) - Модели на гликозилиране на естествен човешки гликозил
• Клетки HEK293T (300189 ) - Висока ефективност на трансфекцията за бързи изследвания
• HEK293, адаптирани към суспензия (300686) - мащабируема производствена платформа
• DMEM:Ham's F12 (1:1) (820400a ) - Оптимизиран за производство на гликопротеини