Култивиране на циркулиращи туморни клетки (CTC): Предизвикателства и нови решения

Циркулиращите туморни клетки представляват рядка популация от ракови клетки, които са се отделили от първичните тумори или метастатичните места и са навлезли в кръвния поток, служейки едновременно като медиатори на метастазите и потенциални източници на информация за тумора в реално време. В Cytion осъзнаваме, че успешното култивиране на ЦТК може да доведе до революция в персонализираната медицина на рака, като позволи функционално тестване на лекарства, геномно характеризиране и механични изследвания с помощта на собствените туморни клетки на пациента, получени чрез минимално инвазивно вземане на кръв. Култивирането на КТК обаче е свързано с изключителни технически предизвикателства: тези клетки са изключително редки (често по-малко от 10 клетки на милилитър кръв сред милиарди нормални кръвни клетки), силно хетерогенни, крехки и склонни към загуба по време на изолирането и култивирането. Въпреки тези пречки, последните технологични постижения правят култивирането на CTC все по-възможно, откривайки нови възможности за прецизна онкология.

Биология и клинична значимост на CTCs

КТК се изхвърлят в кръвообращението както от първични тумори, така и от метастатични лезии, като наличието им корелира с прогресията на заболяването и прогнозата при много видове рак. Тези клетки се сблъскват с враждебна среда - стрес от срязване в течащата кръв, имунен надзор, липса на матрично прикрепване - и повечето от тях умират бързо. Редките CTC, които оцеляват, притежават свойства, позволяващи метастатичен потенциал: устойчивост на аноикис (клетъчна смърт, предизвикана от отделяне), способност да оцеляват в суспензия и способност да екстравазират и колонизират отдалечени органи. Култивирането на ЦТК би осигурило безпрецедентен достъп до тези метастатични прекурсори, позволявайки функционално характеризиране, което не може да бъде разкрито само чрез геномен анализ. Въпреки това, тяхната оскъдност и крехкост правят култивирането на CTC една от най-техническите процедури в клетъчната биология.

Технологии за изолиране: Първата критична стъпка

Преди да бъдат култивирани CTC, те трябва да бъдат отделени от огромното количество нормални кръвни клетки. Методите за физическо разделяне използват разликите в размера (CTC обикновено са по-големи от кръвните клетки), като използват филтриране или микрофлуидни устройства. Имуноафинитетните подходи улавят CTC, експресиращи епителни маркери като EpCAM, като използват покрити с антитела повърхности или магнитни топчета. Тези методи обаче са ограничени: не всички ЦТК са големи или експресират EpCAM, особено тези, които претърпяват епително-мезенхимен преход (ЕМТ). Негативното изчерпване премахва кръвните клетки, като оставя незасегнати CTCs, въпреки че чистотата остава предизвикателство. Идеалният метод за изолиране на културата трябва да бъде щадящ, за да се запази жизнеспособността, като същевременно се постигне достатъчно обогатяване и чистота, за да се предотврати прекомерното разрастване на кръвните клетки.

Проблемът с ануиката

За да оцелеят, адхезивните клетки обикновено се нуждаят от прикрепване към извънклетъчния матрикс; когато се отделят, те се подлагат на аноикис - форма на програмирана клетъчна смърт. КТК в циркулацията трябва да преодолеят аноикис, за да оцелеят, но дори тези издръжливи клетки претърпяват значителен стрес по време на изолирането и прехода към култивиране. Стратегиите за борба с аноикиса включват незабавно нанасяне върху покрити с матрица повърхности, култивиране в триизмерни матрици, които осигуряват структурна подкрепа, добавяне на фактори за оцеляване като инсулиноподобни растежни фактори или EGF или съвместно култивиране с поддържащи захранващи клетки, които осигуряват сигнали за оцеляване. Критичните първи 24-48 часа след изолирането определят дали ЦТК ще се адаптират към условията на култивиране или ще се подложат на смърт, предизвикана от отделянето им.

Иницииране на пролиферация от редки клетки

Дори когато ЦТК оцелеят след изолиране, започването на пролиферация от много малък брой клетки представлява уникално предизвикателство. Стандартните клетъчни култури често разчитат на паракринни сигнали между клетките, но когато са налице само няколко CTC, тези сигнали са недостатъчни. Кондиционираната среда от установени ракови клетъчни линии или нормални клетки и клетъчни линии може да осигури необходимите фактори. Захранващите слоеве от задържани в растежа клетки осигуряват паракринни сигнали, без да се конкурират за ресурси. Мрежите от микроклетки ограничават отделните CTC в малки обеми, където отделяните фактори достигат ефективни концентрации. Специализираните медийни формули, оптимизирани за култивиране с ниска плътност, включват повишени концентрации на растежни фактори и допълнителни добавки, поддържащи стресираните клетки. Целта е да се създаде микросреда, която преодолява ограниченията на екстремно ниската плътност.

Подходи за триизмерни култури

триизмерните системи за култивиране са особено обещаващи за експанзия на CTC. Вграждането на ЦТК в матригел, колаген или синтетични хидрогелове осигурява матрични точки на прикрепване, които предотвратяват ануикис, като същевременно позволяват триизмерна организация. Органоидните методи за култивиране, които са се доказали като успешни за нормални тъкани и първични тумори, също могат да подпомогнат растежа на ЦТК, като отделните ЦТК образуват малки тумороподобни структури. Тези триизмерни култури могат да запазят по-добре фенотиповете на ЦТК от традиционните монослоеве, като поддържат клетъчна архитектура и сигнални контексти, по-близки до туморите in vivo. Някои системи комбинират 3D културата с микрофлуидна перфузия, за да осигурят доставка на хранителни вещества и отстраняване на отпадъците, създавайки миниатюрна туморна микросреда, която поддържа дългосрочно култивиране на ЦТК.

Системи за захранващи клетки

Съвместното култивиране със захранващи клетки представлява друга стратегия за експанзия на ЦТК. Облъчени или третирани с митомицин фибробласти, ендотелни клетки или дори свързани с рака фибробласти осигуряват растежни фактори, матрични протеини и метаболитна подкрепа, без да пролиферират сами. Системите за захранване обаче внасят сложност: разграничаването на CTC от системите за захранване изисква внимателно проследяване, евентуално чрез флуоресцентно маркиране или различна морфология. В крайна сметка КТК трябва да бъдат отделени от хранещите се чрез селективна среда, диференцирана трипсинизация или имуномагнитно сортиране. Въпреки тези предизвикателства, системите за захранване са позволили да се постигне успеваемост на култивирането на ЦТК, която би била трудна за постигане в условия без захранване, особено по време на критичната ранна фаза на експанзия.

Решаване на проблема с хетерогенността чрез клонова култура

Популациите от КТК са известни с хетерогенността си, като съдържат клетки с различен метастатичен потенциал, чувствителност към лекарства и пролиферативен капацитет. Култивирането на смесени популации от КТК в насипно състояние може да позволи бързо растящите клонове да доминират, като се губи разнообразието, което прави КТК клинично информативни. Изолирането на единични клетки, последвано от клонова експанзия, запазва тази хетерогенност, като позволява характеризиране на отделни субпопулации на ЦТК. Микроманипулацията, флуоресцентно-активираното сортиране на клетки (FACS) или микрофлуидното дозиране на единични клетки могат да изолират отделни ЦТК в отделни ямки. Макар че е технически труден и изисква търпение, тъй като отделните клетки бавно създават клонове, този подход разкрива истинското разнообразие в популацията на ЦТК на пациента и идентифицира субпопулации с различни функционални свойства.

Оптимизиране на средата за растеж на CTC

Не съществува универсална среда за култивиране на ЦТК, тъй като ЦТК от различни видове рак и пациенти имат различни изисквания. Много групи започват със среди, оптимизирани за установени ракови клетъчни линии от подобен произход (например RPMI за CTCs от рак на гърдата, DMEM за CTCs от рак на белия дроб), след което добавят допълнителни растежни фактори, включително EGF, FGF, инсулин и други. В някои протоколи се добавят компоненти на среда за стволови клетки, като например добавки B27 или N2, като се предполага, че CTC с подобни на стволовите свойства може да се нуждаят от подобна подкрепа. Концентрацията на серума е друга променлива величина: в някои протоколи се използва високо съдържание на серум (15-20 %) за максимална подкрепа на растежа, докато в други се използват определени формулировки без серум за по-добър контрол. Може да се наложи емпирично оптимизиране за всяка проба на пациент, въпреки че това е предизвикателство предвид ограничения изходен материал.

Мониторинг и характеризиране по време на експанзията

При разширяването на културите на ЦТК непрекъснатият мониторинг гарантира, че култивираните клетки запазват характеристиките на ЦТК и не са се разраснали със замърсители. Имунологичното маркиране за епителни маркери (цитокератини, EpCAM), ракови маркери, свързани с типа тумор (ER/PR за гърдата, PSA за простатата), и липсата на левкоцитни маркери (CD45) потвърждава идентичността. Генетичното характеризиране чрез профилиране на къси тандемни повтори (STR), кариотипиране или целево секвениране потвърждава, че култивираните клетки съответстват на туморния генотип на пациента. Функционалните тестове, оценяващи туморогенните свойства, лекарствените реакции или капацитета за инвазия, показват, че култивираните CTC поддържат биологично значими фенотипове. Това непрекъснато характеризиране е от съществено значение, като се имат предвид високите залози при вземането на клинични решения въз основа на култури от ЦТК.

Степен на успех и прогнозни фактори

Процентът на успеваемост на култивирането на ЦТК остава нисък, обикновено 1-10 % от опитите, въпреки че той варира в широки граници в зависимост от вида рак, стадия на заболяването и методологията. Метастатичните пациенти с голям брой ЦТК показват по-добри показатели за успех от тези с малко ЦТК. Някои видове рак изглеждат по-подходящи за култивиране - ЦТК от рак на гърдата, простатата и дребноклетъчния рак на белия дроб се култивират по-често от други. Техническите фактори също имат значение: по-щадящи методи за изолиране, бърза обработка, оптимизирани условия за култивиране и опитни оператори - всички те подобряват резултатите. Със съзряването на областта и стандартизирането на методите успеваемостта следва да се подобри, но култивирането на ЦТК вероятно ще остане предизвикателство, като се има предвид присъщото на тези клетки състояние на стрес.

Модели на експланти, получени от ЦТК

Алтернатива на традиционното in vitro култивиране са моделите с експланти, получени от ЦТК (CDX), при които ЦТК се инжектират в имунокомпрометирани мишки за експанзия in vivo. Животинската микросреда осигурява растежни фактори, матрица и триизмерна архитектура, които могат да подпомогнат по-добре оцеляването на ЦТК, отколкото изкуствените условия на култивиране. След като се установят като тумори в мишки, те могат да бъдат събрани и повторно култивирани in vitro или серийно пасирани в животни. Макар че този подход заобикаля някои предизвикателства, свързани с култивирането, той въвежда други: разходи, време, изисквания за съоръжения за животни и потенциален натиск за селекция от мишата среда, който може да промени свойствата на ЦТК. Независимо от това моделите на ЦТК се оказаха ценни, когато директното култивиране се окаже неуспешно, предоставяйки разширяем материал за приложения надолу по веригата.

Приложения в прецизната онкология

Крайната цел на култивирането на ЦТК е да се даде възможност за приложения в прецизната медицина. Функционалното тестване на лекарства върху култивираните ЦТК на пациент може да насочи избора на лечение, като се идентифицират ефективни терапии и се избягват безполезни токсични лечения. Тъй като ЦТК представят туморната биология в реално време, те могат да отразяват по-добре текущата чувствителност към лекарства, отколкото архивираните първични туморни проби отпреди години. Механистичните изследвания на култивирани CTCs могат да разкрият механизми на резистентност, метастатични свойства и нови терапевтични цели. Биобанкирането на култури, получени от ЦТК, създава хранилища на съвпадащи с пациентите модели на рак за научни изследвания. Осъществяването на тези приложения обаче изисква преодоляване на настоящите технически ограничения и потвърждаване, че култивираните ЦТК точно представят заболяването на пациента.

Микрофлуидни платформи за култивиране на ЦТК

Микрофлуидните устройства предлагат уникални предимства за култивиране на ЦТК, като осигуряват прецизен контрол върху микросредата в мащаби, съответстващи на единични клетки или малки клъстери. Тези платформи могат да създават хранителни градиенти, да доставят точни концентрации на фактори, да поддържат ламинарен поток за непрекъснат обмен на хранителни вещества и да включват биосензори за наблюдение в реално време. Някои устройства интегрират улавянето и култивирането в една система, като свеждат до минимум загубата на клетки при прехвърляне. Устройствата, съвместими с изображения, позволяват непрекъснато наблюдение на поведението, пролиферацията и морфологията на CTC. Въпреки че микрофлуидните подходи са многообещаващи, те изискват специализирано оборудване и опит, което ограничава широкото им разпространение. С усъвършенстването на тези технологии и увеличаването на тяхната достъпност те могат да се превърнат в стандартни инструменти за култивиране на ЦТК.

Контрол на качеството и предотвратяване на замърсяването

Като се има предвид изключителната рядкост на ЦТК, замърсяването с кръвни клетки или други видове клетки може лесно да доведе до претоварване на културите. Строгата стерилна техника е от съществено значение, както и ранното откриване на замърсяването. Редовното микроскопско изследване идентифицира морфологично различими замърсители. Поточната цитометрия или имунооцветяването за линейни маркери (CD45 за левкоцити, CD31 за ендотелни клетки) откриват неепителни клетки. Ако замърсяването се открие рано, селективната среда или имуномагнитното изчерпване могат да спасят културата. Превенцията е по-добра от лечението: имуноотделянето на кръвни клетки преди култивиране, селективните формулировки на средите и клоновото пречистване чрез изолиране на единични клетки намаляват риска от замърсяване. Тези строги мерки за качество увеличават сложността, но са необходими предвид ценния характер на пробите от CTC.

Ролята на стандартизираните клетъчни линии

Докато култивирането на CTC се фокусира върху пробите на пациентите, стандартизираните клетки и клетъчните линии от Cytion играят важна поддържаща роля. Установените ракови линии служат като положителни контроли за технологиите за изолиране, като позволяват валидиране и оптимизиране преди прилагането на методите върху ценни пациентски проби. Те осигуряват кондиционирана среда за поддържане на CTC културата. Смесени с кръвни проби, те създават изкуствени проби с ЦТК за разработване на методи и обучение. Някои изследователи използват установените линии като сурогатни модели за тестване на условия за култивиране или медийни формулировки, които могат да бъдат от полза за действителните ЦТК. Въпреки че не заместват CTC, получени от пациенти, тези стандартизирани инструменти ускоряват разработването на методи и осигуряват контрол на качеството в целия работен процес.

Нововъзникващи технологии и бъдещи насоки

Няколко нови подхода могат да подобрят успеха на култивирането на ЦТК. Системите "орган на чип", включващи множество клетъчни типове, моделират по-пълно туморната микросреда. Биореакторите, осигуряващи контролирана перфузия, подпомагат дългосрочното култивиране на малък брой клетки. Усъвършенствани биоматериали с регулируеми механични и биохимични свойства оптимизират физическата среда на културата. Анализът с машинно обучение на ранните параметри на културата може да предскаже успешното разширяване, което позволява ресурсите да се съсредоточат върху обещаващи проби. Едноклетъчното мултикомпонентно охарактеризиране преди култивирането може да позволи подбора на CTC, за които има най-голяма вероятност да нараснат. Инженерингът, базиран на CRISPR, може да подобри преживяемостта на ЦТК, без да се компрометира клиничната значимост. Тъй като тези технологии се сближават, култивирането на ЦТК би трябвало да стане по-рутинно, като най-накрая се изпълни обещанието за прецизна ракова медицина.