Публикувано: 2023 г. | Последно актуализирано: май 2026 г.

Техники за дисоциация на клетъчни култури

Дисоциацията на клетъчни култури е критична стъпка в поддържането на клетъчни култури. Тя включва отделяне на клетките от повърхността, върху която растат, за да се позволи субкултивиране или събиране. В тази секция са описани два основни метода: използване на буфери за дисоциация без ензими и използване на ензимни реагенти.

Използване на буфери за дисоциация на клетки без ензими

Този метод е щадящ и запазва целостта на клетките без използване на ензими:

1. Подготовка
   • Уверете се, че всички реагенти са затоплени до 37 °C преди употреба, за да се избегне шок за клетките.
2. Отстраняване на средата за растеж:
   • Изхвърлете старата среда за растеж от съда за култура.
3. Изплакване
   • Изплакнете монослоевете от клетки с 5 ml PBS без калций и магнезий за всяка колба T75 или 100 mm чашка.
   • Леко разклатете съда в продължение на 30 до 60 секунди при стайна температура.
   • Изсмучете и изхвърлете разтвора за изплакване.
   • Повторете тази стъпка на изплакване още веднъж.
4. Дисоциация
   • Добавете приблизително 5 мл безензимен буфер за дисоциация на клетки в съда.
   • Разклатете леко при стайна температура в продължение на 1 до 2 минути и проверете за дисоциация под микроскоп.
   • Ако е необходимо, почукайте колбата или чашката с ръка, за да отлепите клетките.
   • Ако клетките са прилепнали, оставете ги да престоят при стайна температура за още 2 до 5 минути и, ако е необходимо, почукайте отново, като използвате повече разделителен буфер.
   • След като клетките се отделят, добавете най-малко 5 мл пълна среда за растеж, за да неутрализирате буфера за дисоциация и да ресуспендирате клетките.
5. Проверка на жизнеспособността
   • Наблюдавайте жизнеспособността на клетките по време на субкултивирането, като се уверите, че тя остава над 90%.

Използване на други реагенти за дисоциация

Този метод позволява използването на различни реагенти за дисоциация:

1. Отстраняване на използваната среда
   • Изхвърлете старата среда от съда за култивиране.
2. Измиване на клетките
   • Измийте клетките с балансиран солев разтвор, свободен от калций и магнезий, или използвайте EDTA.
   • Добавете измиващия разтвор внимателно от страната, противоположната на клетките, и разклатете съда в продължение на 1 до 2 минути, преди да изхвърлите измиващия разтвор.
3. Дисоциация
   • Нанесете 2 до 3 мл от избрания разтвор за дисоциация на всеки 25 cm² от повърхността за растеж, като се уверите, че покривате целия клетъчен слой.
   • Инкубирайте съда при 37 °C и разклащайте леко. Дисоциацията обикновено настъпва в рамките на 5 до 15 минути, в зависимост от клетъчната линия.
   • При упорити клетки, лекото потупване на съда може да ускори процеса.
   • Наблюдавайте клетките внимателно, за да предотвратите прекомерно излагане и потенциално увреждане.
4. Събиране на клетки
   • След като клетките се отделят напълно, оставете ги да се съберат на дъното на съда, като го поставите в изправено положение.
   • Добавете пълна среда, след което разпръснете и съберете клетките чрез пипетиране върху клетъчния слой.
   • Пребройте и продължете с субкултивирането.

И при двата метода е важно да се определят оптималните условия за всяка клетъчна линия чрез емпирично наблюдение. Процесът трябва да запази жизнеспособността на клетките, която трябва редовно да се проверява, за да надвишава 90% по време на субкултивирането. Тези процедури предоставят основа, която изследователите могат да адаптират в зависимост от специфичните изисквания и характеристики на своите клетъчни линии.

Преглед на техниките за субкултивиране на адхезивни клетки

Ефективното субкултивиране на адхезивни клетки изисква тяхното отделяне от културалния съд. Използват се различни методи, всеки от които е подходящ за различни видове клетки и условия. При избора на метод за дисоциация е от решаващо значение да се вземат предвид специфичните нужди на клетъчната линия и целите на експеримента. Редовното наблюдение на жизнеспособността на клетките, с цел тя да бъде над 90% в момента на субкултивирането, е от съществено значение за поддържането на здравето и продуктивността на културата. Ето обзор на тези процедури: