Техники за дисоциация на клетъчни култури

Дисоциацията на клетъчни култури е критична стъпка в поддържането на клетъчни култури. Тя включва отделяне на клетките от тяхната растежна повърхност, за да се даде възможност за субкултивиране или събиране на реколтата. В този раздел са описани два основни метода: използване на буфери за дисоциация без ензими и използване на ензимни реагенти.

1.използване на буфери за клетъчна дисоциация без ензими

Този метод е щадящ и запазва клетъчната цялост без използване на ензими:

1. Приготвяне
   • Уверете се, че всички реагенти са затоплени до 37 °C преди употреба, за да се избегне шок за клетките.
2. Отстраняване на растежната среда
   • Изхвърлете старата среда за растеж от съда за култивиране.
3. Изплакване
   • Изплакнете клетъчните монослоеве с 5 ml PBS без калций и магнезий на колба T75 или 100 mm блюдо.
   • Внимателно разклатете съда за 30 до 60 секунди при стайна температура.
   • Аспирирайте и изхвърлете разтвора за изплакване.
   • Повторете тази стъпка на изплакване още веднъж.
4. Дисоциация
   • Добавете приблизително 5 ml буфер за клетъчна дисоциация без ензими в съда.
   • Внимателно разклатете при стайна температура за 1 до 2 минути и проверете за дисоциация под микроскоп.
   • Ако е необходимо, почукайте колбата или съда с ръка, за да раздвижите клетките.
   • Ако клетките са слепнали, оставете ги да престоят на стайна температура още 2 до 5 минути и при необходимост почукайте отново, като използвате повече буфер за дисоциация.
   • След като клетките са отделени, добавете поне 5 ml пълна хранителна среда, за да неутрализирате буфера за дисоциация и ресуспендирате клетките.
5. Проверка на жизнеспособността
   • Следете жизнеспособността на клетките по време на субкултивирането, като се уверите, че тя остава над 90 %.

2.използване на други реактиви за дисоциация

Този метод позволява използването на различни реактиви за дисоциация:

1. Отстраняване на използваната среда
   • Изхвърлете старата среда от съда за култивиране.
2. Промиване на клетките
   • Измийте клетките с балансиран солен разтвор, който не съдържа калций и магнезий, или използвайте EDTA.
   • Добавете внимателно промивния разтвор към страната срещу клетките и разклатете съда за 1-2 минути, преди да изхвърлите промивния разтвор.
3. Дисоциация
   • Прилагат се 2 до 3 ml от избрания разтвор за дисоциация на 25 cm² растежна повърхност, като се осигурява покриване на клетъчния лист.
   • Инкубирайте съда при 37°С и го разклатете внимателно. Дисоциацията обикновено настъпва в рамките на 5 до 15 минути, в зависимост от клетъчната линия.
   • При упорити клетки почукването на съда може да ускори процеса.
   • Наблюдавайте внимателно клетките, за да предотвратите прекомерното им излагане и евентуално увреждане.
4. Събиране на клетките
   • След като клетките са напълно отделени, оставете ги да се съберат на дъното на съда, като го изправите.
   • Добавете пълната среда, след което разпръснете и съберете клетките, като ги разнесете с пипета над клетъчния слой.
   • Пребройте ги и продължете със субкултивирането.

И при двата метода е важно да се определят оптималните условия за всяка клетъчна линия чрез емпирично наблюдение. Процесът трябва да запази жизнеспособността на клетките, която трябва да се проверява рутинно, за да надхвърли 90% по време на субкултивирането. Тези процедури осигуряват основа, която изследователите могат да адаптират въз основа на специфичните изисквания и характеристики на техните клетъчни линии.

3.преглед на техниките за субкултивиране на адхерентни клетки

Ефективното субкултивиране на адхерентни клетки изисква отделянето им от съда за култивиране. Използват се различни методи, всеки от които е подходящ за различни видове клетки и условия. При избора на метод за отделяне е изключително важно да се вземат предвид специфичните нужди на клетъчната линия и целите на експеримента. Редовното наблюдение на жизнеспособността на клетките, като целта е тя да надвишава 90 % по време на субкултивирането, е от съществено значение за непрекъснатото здраве и продуктивност на културата. Тук е представен преглед на тези процедури: