وسائط زراعة الخلايا: نظرة عامة

تعد زراعة الخلايا إحدى أهم المنهجيات في مجال علوم الحياة. ويُقصد بمصطلح "زراعة الخلايا" استخراج الخلايا أو الأنسجة أو الأعضاء من حيوان أو نبات، ثم زرعها لاحقًا في بيئة اصطناعية مواتية لبقائها و/أو نموها. وتتمثل المتطلبات البيئية الأساسية لتحقيق النمو الأمثل للخلايا في درجة الحرارة المضبوطة، والركيزة التي تلتصق بها الخلايا، ووسط النمو المناسب، والحاضنة التي تحافظ على درجة الحموضة (pH) والأسمولية المثلى. ويجب توفر هذه الظروف للخلايا حتى تنمو إلى أقصى إمكاناتها.

يُعد اختيار وسط نمو مناسب للزراعة في المختبر المرحلة الأكثر أهمية وحيوية في زراعة الخلايا. ويُعرف وسط النمو، الذي يُسمى أيضًا وسط الاستزراع، بأنه سائل أو هلام مُركَّب لتشجيع نمو الكائنات الحية على المستوى المجهري أو الخلوي أو النباتي. وغالبًا ما يحتوي الوسط المستخدم في استزراع الخلايا على إمداد كافٍ من الطاقة والمواد التي تتحكم في دورة الخلية. تشمل المكونات الرئيسية لوسط الاستزراع الأحماض الأمينية والفيتامينات والأملاح غير العضوية والجلوكوز والمصل. يُضاف المصل إلى الوسط لأنه يعمل كمصدر لعوامل النمو والهرمونات وعوامل الالتصاق. بالإضافة إلى توفير العناصر الغذائية، يساهم الوسط أيضًا في الحفاظ على مستويات الأس الهيدروجيني والأسمولية.

أنواع الوسائط المستخدمة في زراعة الخلايا

يمكن زراعة الخلايا البشرية والحيوانية على حد سواء في وسط اصطناعي أو مركب، أو في وسط طبيعي بالكامل يتم استكماله بعناصر طبيعية. وفيما يلي، سنقدم لكم لمحة عامة عن أنواع الوسائط المختلفة المتاحة حاليًا.

الوسائط الطبيعية

لا توجد في الوسائط الطبيعية سوى السوائل البيولوجية الموجودة في حالتها الطبيعية. وتعد الوسائط الطبيعية مفيدة جدًا وسهلة الاستخدام لزراعة مجموعة واسعة من أنواع الخلايا الحيوانية. ويعد عدم فهم المكونات الدقيقة التي تتكون منها الوسائط الطبيعية العامل الرئيسي الذي يسهم في انخفاض قابلية تكرار النتائج التي يتم الحصول عليها باستخدام الوسائط الطبيعية.

الوسائط الاصطناعية

يتضمن تحضير الوسائط الاصطناعية أو التركيبية إضافة المغذيات (العضوية وغير العضوية على حد سواء)، وبروتينات المصل، والكربوهيدرات، والعوامل المساعدة، والفيتامينات، والأملاح، بالإضافة إلى الأطوار الغازية لـ O2 و CO2 [1].

وقد تم تطوير أنواع مختلفة من الوسائط الاصطناعية من أجل تحقيق وظيفة واحدة أو أكثر من الوظائف التالية: 1) البقاء الفوري (محلول ملحي متوازن ذو درجة حموضة (pH) وضغط تناضحي دقيقين). 2) البقاء لفترة طويلة (محلول ملحي متوازن مُكمل بتركيبات مختلفة من المواد الكيميائية العضوية و/أو المصل). 3) النمو إلى أجل غير مسمى. 4) وظائف متخصصة.

هناك أربعة تصنيفات متميزة للوسائط الاصطناعية:

الوسائط المحتوية على المصل

أكثر أنواع المكملات شيوعًا في الوسائط المستخدمة لزراعة الخلايا الحيوانية هو مصل الأبقار الجنينية. يُضاف إلى وسط الاستزراع كمكمل منخفض التكلفة من أجل تحقيق أفضل ظروف نمو ممكنة. بالإضافة إلى دوره كناقل أو مخلب للمغذيات غير المستقرة أو غير القابلة للذوبان في الماء، والهرمونات وعوامل النمو، ومثبطات البروتياز، ومواد أخرى، فإن المصل يربط الجزيئات الضارة ويحيدها أيضًا.

الوسائط الخالية من المصل

إن وجود المصل في الوسائط ينطوي على عدد من العيوب، وقد يتسبب في أخطاء كبيرة في التفسير في الأبحاث المناعية [2، 3]. وقد تم ابتكار مجموعة متنوعة من الوسائط الخالية من المصل [4، 5]. وعادةً ما يتم تركيب هذه الوسائط خصيصًا لدعم استزراع نوع واحد من الخلايا، مثل «Knockout Serum Replacement» و«Knockout DMEM» من شركة Thermo Fisher Scientific، ووسط «mTESR» من شركة Stem Cell Technologies [6]، المخصص للخلايا الجذعية [7].

بالإضافة إلى ذلك، تتضمن هذه الوسائط كميات محددة من عوامل النمو المنقاة، والبروتينات الدهنية، والبروتينات الأخرى، التي عادةً ما يوفرها المصل [8]. غالبًا ما يُشار إلى هذه الوسائط باسم «وسائط الاستزراع المحددة» نظرًا لأن المكونات التي تتكون منها هذه الوسائط مفهومة جيدًا.

الوسائط المحددة كيميائيًا

تتضمن هذه الوسائط مكونات غير عضوية وعضوية فائقة النقاء لم تتعرض لأي نوع من التلوث. وقد تتضمن أيضًا إضافات من البروتينات النقية، مثل عوامل النمو.

 يؤدي التعديل الجيني للبكتيريا أو الخميرة، إلى جانب إضافة أحماض دهنية معينة وفيتامينات وكوليسترول وأحماض أمينية، إلى إنتاج مكوناتها [9].

الوسائط الخالية من البروتين

الوسائط الخالية من البروتين هي تلك التي لا تحتوي على أي بروتين على الإطلاق، بل تحتوي فقط على عناصر غير بروتينية. وبالمقارنة مع الوسائط المضاف إليها مصل، فإن استخدام الوسائط الخالية من البروتين المضاف يعزز تكاثر الخلايا وتعبير البروتين بشكل أكبر، ويجعل من السهل تنقية أي منتج يتم إنتاجه في عملية لاحقة [10-12]. لا يتم تضمين البروتين في تركيبات مثل MEM و RPMI-1640. ومع ذلك، يمكن إضافة مكمل بروتيني إذا لزم الأمر.

وسائط الاستزراع ومكوناتها الأساسية

يمكن شراء وسط الاستزراع التجاري على شكل مسحوق أو سائل، وغالبًا ما يحتوي على مجموعة متنوعة من العناصر الغذائية مثل الأحماض الأمينية والجلوكوز والأملاح والفيتامينات والمكملات الغذائية الأخرى. 

تختلف احتياجات كل سلالة خلوية من هذه المكونات، وهذه الاختلافات هي السبب وراء وجود عدد كبير من التركيبات المختلفة للوسائط. ويؤدي كل مكون وظيفة معينة، سيتم توضيحها في الفقرات التالية:

أنظمة التخزين المؤقت

للحفاظ على ظروف نمو مثالية، يجب التحكم في درجة الحموضة (pH)، وهو ما يتم غالبًا بواسطة أحد نظامي التخزين المؤقت التاليين:

نظام التخزين المؤقت الطبيعي

تساوي نسبة ثاني أكسيد الكربون (CO₂) إلى حمض الهيدروكربونيك (H₂CO₃) في الغلاف الجوي تلك الموجودة في الوسط، مما يخلق آلية تخميد طبيعية. وللحفاظ على آلية التخميد الطبيعية هذه، يجب حفظ المزارع في بيئة هوائية تحتوي على 5-10% من ثاني أكسيد الكربون، وهو ما يتحقق غالبًا باستخدام حاضنة ثاني أكسيد الكربون. من أفضل مزايا استخدام نظام التخزين المؤقت الطبيعي أنه رخيص وآمن.

HEPES

يتمتع التخزين الكيميائي باستخدام أيون HEPES ثنائي الشحنة بقدرة تخزين أكبر في نطاق الرقم الهيدروجيني 7.2-7.4 ولا يحتاج إلى بيئة غازية منظمة. بالنسبة لأنواع معينة من الخلايا، قد تكون جرعة أكبر من HEPES ضارة. كما أن الوسائط التي تحتوي على HEPES تكون أكثر عرضة بكثير للتأثيرات السمية الضوئية للضوء الفلوري [13].

الفينول الأحمر

غالبًا ما يُدرج مؤشر الأس الهيدروجيني «الفينول الأحمر» في وسائط الاستزراع المتوفرة تجاريًّا، مما يتيح المراقبة المستمرة للأس الهيدروجيني. مع تكاثر الخلايا، تتسبب المستقلبات التي تنتجها هذه الخلايا في حدوث تغير في الأس الهيدروجيني، وبالتالي تغير لون الوسائط. للفينول الأحمر تأثير مزدوج على لون الوسط، حيث يتحول إلى اللون الأصفر عند درجة الحموضة الحمضية وإلى اللون الأرجواني عند درجة الحموضة القلوية. وتؤدي درجة الحموضة 7.4، وهي القيمة المثلى لزراعة الخلايا، إلى ظهور الوسط باللون الأحمر الفلوري.

لكن أحمر الفينول له بعض العيوب: أولًا، يمكن لأحمر الفينول محاكاة أداء عدد من الهرمونات الستيرويدية، وبشكل أساسي هرمون الاستروجين [14]. ولذلك، عند دراسة الخلايا الحساسة للاستروجين مثل أنسجة الثدي، يُوصى باستخدام وسط خالٍ من أحمر الفينول. يتعطل توازن الصوديوم والبوتاسيوم بسبب وجود أحمر الفينول في العديد من التركيبات الخالية من المصل. وقد تؤدي إضافة المصل أو هرمون الغدة النخامية البقري إلى الوسط إلى مواجهة هذا التأثير [15]. ثالثًا، يتعذر الكشف في تجارب قياس التدفق الخلوي بسبب وجود أحمر الفينول.

الأملاح غير العضوية

تساعد الوسائط التي تحتوي على أملاح غير عضوية، مثل أيونات الصوديوم والبوتاسيوم والكالسيوم، في الحفاظ على التوازن التناضحي وتنظيم جهد الغشاء.

الأحماض الأمينية

نظرًا لأن الأحماض الأمينية هي المكونات الأساسية للبروتين، فهي عنصر أساسي في كل وسط نمو خلوي تم ابتكاره على الإطلاق. ونظرًا لأن الخلايا غير قادرة على إنتاج بعض الأحماض الأمينية بنفسها، فمن المهم أن يتضمن وسط الاستزراع الأحماض الأمينية الأساسية. فهي ضرورية لتكاثر الخلايا، ويحدد تركيزها الكثافة الخلوية القصوى التي يمكن بلوغها. وعلى وجه الخصوص، يُعد L-الجلوتامين، وهو حمض أميني أساسي، ذا أهمية بالغة.

يعمل L-الجلوتامين كمصدر ثانوي للطاقة لعملية التمثيل الغذائي، ويساهم بالنيتروجين في إنتاج NAD وNADPH والنوكليوتيدات. ونظرًا لأن L-الجلوتامين هو حمض أميني غير مستقر يتحول بمرور الوقت إلى شكل لا تستطيع الخلايا الاستفادة منه، فإنه يجب إضافته إلى الوسط.

بالإضافة إلى ذلك، يمكن تزويد الوسط بالأحماض الأمينية غير الأساسية لتعويض تلك التي تم استهلاكها خلال عملية النمو. يتم تعزيز نمو الخلايا وزيادة قابليتها للحياة عند إضافة الأحماض الأمينية غير الأساسية إلى وسط النمو.

الكربوهيدرات

تعد الكربوهيدرات في شكل السكريات المصدر الرئيسي للطاقة. وتشتمل العديد من الوسائط أيضًا على المالتوز والفركتوز بالإضافة إلى السكريات الأكثر شيوعًا مثل الجلوكوز والجالاكتوز.

البروتينات والببتيدات

الألبومين، والترانسفيرين، والفيبرونكتين هي البروتينات والببتيدات الأكثر استخدامًا. وهي ذات أهمية خاصة في الوسائط التي لا تحتوي على مصل. الألبومين، والترانسفيرين، والأبروتينين، والفيتوين، والفيبرونكتين هي بعض البروتينات التي قد توجد في المصل، الذي يُعد مصدرًا غنيًّا بالبروتين.

الألبومين هو البروتين الرئيسي الموجود في الدم، وتتمثل وظيفته في ربط ونقل مواد مختلفة، بما في ذلك الماء والأملاح والأحماض الدهنية الحرة والهرمونات والفيتامينات، بين الأعضاء والخلايا المختلفة. إن قدرة الألبومين على الارتباط بالمواد الكيميائية تجعله خيارًا فعالًا لإزالة المركبات الضارة من الوسط الذي تُزرع فيه الخلايا.

الأبروتينين هو عامل وقائي في أنظمة زراعة الخلايا، لأنه مستقر عند درجة الحموضة المحايدة والحمضية، كما أنه مقاوم لدرجات الحرارة العالية والتلف الذي قد تسببه الإنزيمات البروتينية. وهو قادر على تثبيط عدد من بروتيازات السيرين، بما في ذلك التريبسين، من بين إنزيمات أخرى.

الفيتوين هو بروتين سكري يمكن الكشف عنه بكميات أكبر في مصل الأجنة والحيوانات حديثة الولادة مقارنةً بمصل البالغين. بالإضافة إلى ذلك، يعمل كمثبط لبروتياز السيرين. ويُعد بروتين الفيبرونكتين مكونًا أساسيًا في عملية التصاق الخلايا. الترانسفيرين هو بروتين ينقل الحديد وهو مسؤول عن توصيل الحديد إلى أغشية الخلايا.

الأحماض الدهنية والدهون

تلعب دورًا حاسمًا في الوسط الخالي من المصل عند غياب المصل.

الفيتامينات

هناك العديد من الفيتامينات الضرورية لنمو الخلايا وتكاثرها. لا تستطيع الخلايا إنتاج الفيتامينات بكميات كافية، ولذلك فهي ضرورية في زراعة الأنسجة كمكملات غذائية.

في زراعة الخلايا، يُعد المصل المصدر الرئيسي للفيتامينات؛ ومع ذلك، تُعالج الوسائط أيضًا بمختلف الفيتامينات لجعلها مناسبة لنوع معين من الخلايا. وعادةً ما تُستخدم فيتامينات المجموعة ب لتحفيز النمو.

العناصر النزرة

تُعرف العناصر الكيميائية مثل النحاس والزنك والسيلينيوم ومركبات حمض التريكاربوكسيليك الوسيطة باسم العناصر النزرة. غالبًا ما تُضاف العناصر النزرة إلى الوسائط التي لا تحتوي على مصل لتعويض تلك الموجودة عادةً في المصل. هذه العناصر هي مكونات كيميائية مهمة ضرورية لنمو الخلايا بشكل صحي. تعتمد العديد من التفاعلات الكيميائية الحيوية على بعض المغذيات الدقيقة، مثل نشاط الإنزيمات.

مكملات الوسط

تحتاج وسط النمو الكامل المقترح لخطوط خلوية معينة إلى مكونات إضافية غير موجودة في الوسط الأساسي والمصل. تدعم هذه المكملات الغذائية نمو الخلايا ووظائف التمثيل الغذائي المناسبة.

على الرغم من أن الهرمونات وعوامل النمو وجزيئات الإشارة ضرورية للتكاثر السليم لسلالات خلوية معينة، يجب دائمًا اتخاذ الاحتياطات التالية: نظرًا لأن إضافة المكملات قد تغير الأسمولية لوسط النمو الكامل، مما قد يثبط نمو الخلايا، يُنصح دائمًا بالتحقق من الأسمولية بعد إضافة المكملات. بالنسبة لغالبية سلالات الخلايا، يتراوح الأسمولية المثلى بين 260 و320 mOSM/kg.

المضادات الحيوية

غالبًا ما تُستخدم المضادات الحيوية لمنع نمو الملوثات البكتيرية والفطرية [16]، على الرغم من أنها ليست ضرورية لنمو الخلايا. ونظرًا لأن المضادات الحيوية قد تخفي التلوث بالميكوبلازما والبكتيريا المقاومة، فلا يُنصح باستخدامها بشكل روتيني في زراعة الخلايا [17، 18].

بالإضافة إلى ذلك، قد تعطل المضادات الحيوية عملية التمثيل الغذائي للخلايا شديدة الحساسية. وغالبًا ما تُستخدم تركيبات البنسلين-الستربتومايسين التي تنتجها شركتا MilliporeSigma وLife Technologies. وقد استُخدم البلازماسين في زراعة سلالات خلايا الورم الدبقي TS603 وTS516 وBT260 [19]، وقد ثبت فعاليته في إزالة التلوث بالميكوبلازما (20).

المصل

يحتوي المصل على الألبومين وعوامل النمو ومثبطات النمو. ويُعد المصل أحد أهم مكونات وسط استزراع الخلايا لأنه يوفر الأحماض الأمينية والبروتينات والفيتامينات (خاصة الفيتامينات القابلة للذوبان في الدهون مثل A وD وE وK) والكربوهيدرات والدهون والهرمونات وعوامل النمو والمعادن والعناصر النزرة.

غالبًا ما يُستخدم المصل المستخرج من الأجنة والعجول البقرية لتعزيز نمو الخلايا المزروعة. يُعد مصل الأجنة مصدرًا وفيرًا لعوامل النمو، وهو مناسب لاستنساخ الخلايا وتنمية الخلايا الحساسة. ونظرًا لتراجع قدراته على تعزيز النمو، يُستخدم مصل العجول في تجارب تثبيط التلامس. غالبًا ما تحتوي أوساط النمو العادية على نسبة مصل تتراوح بين 2% و10%. تخدم إضافة المصل إلى وسط الاستزراع الأغراض التالية [21]:

• يوفر المصل العناصر الغذائية الأساسية للخلايا (سواء في المحلول أو مرتبطة بالبروتينات).

• يحتوي المصل على العديد من عوامل النمو والهرمونات التي تساهم في تعزيز النمو ونشاط الخلايا المتخصصة.

• يوفر المصل العديد من البروتينات المرتبطة، مثل الألبومين والترانسفيرين، التي تنقل المواد الكيميائية الأخرى إلى داخل الخلية. على سبيل المثال، ينقل الألبومين الدهون والفيتامينات والهرمونات وغيرها إلى الخلايا.

• كما يوفر بروتينات، مثل الفيبرونكتين، التي تزيد من التصاق الخلايا بالركيزة. بالإضافة إلى ذلك، ينتج عناصر انتشار تساعد في توسع الخلايا قبل الانقسام.

• كما يوفر مثبطات البروتياز التي تمنع التحلل البروتيني في الخلايا.

• كما يحتوي على معادن مثل Na+ و K+ و Zn2+ و Fe2+.

• يعزز لزوجة الوسط، مما يحمي الخلايا من الإصابة الميكانيكية أثناء تحريك المزرعة المعلقة.

• كما أنه يعمل كعازل.

المراجع

[1] Morgan J، Morton H، Parker R. تغذية الخلايا الحيوانية في زراعة الأنسجة؛ دراسات أولية على وسط اصطناعي. Proc Soc Exp Biol Med. 1950;73:1-8

[2] Kerbel R، Blakeslee D. الامتصاص السريع لمكون من مصل العجل الجنيني بواسطة الخلايا الثديية في المزرعة. مصدر محتمل للتشوهات في دراسات المصل المضاد للمستضدات الخاصة بالخلايا. Immunology. 1976;31:881-91

[3] سولا ك.، درابر ب.، نوزا ك. إضافة المصل إلى الوسط المستخدم في تحضير معلقات الخلايا كمصدر محتمل للتشوهات في التفاعلات الخلوية التي تمت دراستها عن طريق اختبار العقدة الليمفاوية المأبضية. مجلة علم الوراثة المناعية. 1980؛7:483-9

[4] مارياني إي، مارياني أ، موناكو م، لالي إي، فيتالي م، فاتشيني أ. الوسائط التجارية الخالية من المصل: نمو الهجينوما وإنتاج الأجسام المضادة أحادية النسيلة. مجلة طرق المناعة. 1991؛145:175-83

[5] بارنز د، ساتو ج. طرق نمو الخلايا المزروعة في وسط خالٍ من المصل. مجلة الكيمياء الحيوية التحليلية. 1980؛102:255-70

[6] يو إتش، لو إس، غاسيور ك، سينغ دي، فازكيز سانشيز إس، تابيا أو، وآخرون. بروتينات HSP70 ترافق بروتين TDP-43 الخالي من الحمض النووي الريبي إلى أغلفة كروية سائلة داخل النواة ذات خصائص متباينة. مجلة العلوم. 2021؛371:

[7] Meharena H، Marco A، Dileep V، Lockshin E، Akatsu G، Mullahoo J، وآخرون. الشيخوخة المستحثة بمتلازمة داون تعطل البنية النووية للسلائف العصبية. مجلة «Cell Stem Cell». 2022؛29:116-130.e7

[8] Iscove N، Melchers F. الاستبدال الكامل للمصل بالألبومين، والترانسفيرين، ودهون فول الصويا في مزارع الخلايا الليمفاوية B المتفاعلة مع الليبوبوليسكاريد. J Exp Med. 1978;147:923-33

[9] Stoll T، Muhlethaler K، von Stockar U، Marison I. التحسين المنهجي لوسط خالٍ من البروتينات ومحدد كيميائيًا لنمو الهجينومات وإنتاج الأجسام المضادة أحادية النسيلة. J Biotechnol. 1996;45:111-23

[10] دارفلر ف. وسط خالٍ من البروتينات لنمو الهجينومات وخلايا أخرى من الجهاز المناعي. In Vitro Cell Dev Biol. 1990;26:769-78

[11] بارنز د، ساتو ج. زراعة الخلايا الخالية من المصل: نهج موحد. مجلة الخلية. 1980؛22:649-55

[12] هاميلتون و.، هام ر. النمو النسيلي لخطوط خلايا الهامستر الصيني في أوساط خالية من البروتين. In Vitro. 1977؛13:537-47

[13] زيجلر ج، ليبي زونيغا ج، فيستيكا ب، جيري إ. تحليل الآثار السامة للخلايا لوسط الاستزراع المحتوي على HEPES المعرض للضوء. In Vitro Cell Dev Biol. 1985;21:282-7

[14] بيرثوا ي، كاتزينيلينبوجن ج، كاتزينيلينبوجن ب. يعتبر الفينول الأحمر في أوساط زراعة الأنسجة منشطًا استروجينيًا ضعيفًا: الآثار المترتبة على دراسة الخلايا المستجيبة للاستروجين في المزرعة. Proc Natl Acad Sci U S A. 1986;83:2496-500

[15] Karmiol S. تطوير وسائط خالية من المصل. في: Master JRW، محرر. زراعة الخلايا الحيوانية، الطبعة الثالثة. أكسفورد: مطبعة جامعة أكسفورد؛ 2000.

[16] بيرلمان د. استخدام المضادات الحيوية في وسائط زراعة الخلايا. Methods Enzymol. 1979;58:110-6

[17] McGarrity G. انتشار ومكافحة العدوى بالميكوبلازما في مزارع الخلايا. In Vitro. 1976;12:643-8

[18] ماسترز ج، ستايسي ج. تغيير الوسط وإعادة زراعة سلالات الخلايا. بروتوكولات نيتشر. 2007؛ 2:2276-84

[19] Chakraborty A، Laukka T، Myllykoski M، Ringel A، Booker M، Tolstorukov M، وآخرون. إن إنزيم إزالة الميثيل من الهستون KDM6A يستشعر الأكسجين مباشرةً للتحكم في الكروماتين ومصير الخلية. Science. 2019;363:1217-1222

[20] Molla Kazemiha V، Azari S، Amanzadeh A، Bonakdar S، Shojaei Moghadam M، Habibi Anbouhi M، وآخرون. فعالية Plasmocin™ على سلالات خلوية مختلفة من الثدييات المصابة بالموليكوتات مقارنةً بالمضادات الحيوية الشائعة الاستخدام في زراعة الخلايا: تجربة محلية. Cytotechnology. 2011;63:609-20

[21] كراغ هانسن يو. الجوانب الجزيئية لارتباط الليجاند بالألبومين المصل. Pharmacol Rev. 1981;33:17-53