وسائط زراعة الخلايا: نظرة عامة

في مجال علوم الحياة، تُعد زراعة الخلايا إحدى أهم المنهجيات في هذا المجال. إن إزالة الخلايا أو الأنسجة أو الأعضاء من حيوان أو نبات ثم زرع تلك الخلايا أو الأنسجة أو الأعضاء في بيئة اصطناعية مواتية لبقائها و/أو نموها هو المقصود بعبارة "زراعة الخلايا" وتتمثل الاحتياجات البيئية الأساسية لنمو الخلايا على النحو الأمثل في درجة حرارة مضبوطة وركيزة لتعلق الخلايا ووسط نمو مناسب وحاضنة تحافظ على درجة الحموضة والأسمولية المثلى. يجب أن تتوفر هذه الظروف للخلايا لكي تنمو بكامل طاقتها.

إن اختيار وسط النمو المناسب للزراعة في المختبر هو المرحلة الأكثر أهمية وحيوية في زراعة الخلايا. ووسط النمو، المعروف أيضًا باسم وسط الاستزراع، هو سائل أو مادة هلامية مصممة لتشجيع نمو الكائنات الحية على نطاق مجهري أو خلوي أو شبيه بالنبات. غالبًا ما يحتوي الوسط المستخدم في زراعة الخلايا على إمدادات كافية من الطاقة والمواد التي تتحكم في دورة الخلية. تشمل المكونات الرئيسية لوسط الاستزراع الأحماض الأمينية والفيتامينات والأملاح غير العضوية والجلوكوز والمصل. يُضاف المصل إلى الوسط لأنه يعمل كمصدر لعوامل النمو والهرمونات وعوامل التعلق. بالإضافة إلى توفير العناصر الغذائية، يساهم الوسط أيضًا في الحفاظ على مستويات الأس الهيدروجيني والأسمولية.

أنواع الوسط المستخدم في زراعة الخلايا

يمكن زراعة الخلايا البشرية والحيوانية على حد سواء في وسط صناعي أو اصطناعي أو وسط طبيعي بالكامل مُضاف إليه عناصر طبيعية. فيما يلي، سنقدم لك فيما يلي نظرة عامة على أنواع الوسائط المختلفة المتاحة حاليًا.

الوسائط الطبيعية

يمكن العثور فقط على السوائل البيولوجية الموجودة في حالتها الطبيعية في الوسائط الطبيعية. الوسائط الطبيعية مفيدة جدًا وسهلة لزراعة مجموعة واسعة من أنواع الخلايا الحيوانية. إن عدم فهم المكونات الدقيقة التي تتكون منها الوسائط الطبيعية هو العامل الأساسي الذي يساهم في انخفاض قابلية تكرار النتائج التي يتم الحصول عليها باستخدام الوسائط الطبيعية.

الوسائط الاصطناعية

يتضمن إعداد الوسائط الاصطناعية أو الاصطناعية إضافة المغذيات (العضوية وغير العضوية) وبروتينات المصل والكربوهيدرات والعوامل المساعدة والفيتامينات والأملاح، بالإضافة إلى مرحلتي غاز الأكسجين وثاني أكسيد الكربون [1].

تم تطوير أنواع مختلفة من الوسائط الاصطناعية من أجل تحقيق واحدة أو أكثر من الوظائف التالية: 1) البقاء الفوري (محلول ملح متوازن مع درجة حموضة دقيقة وضغط تناضحي). 2) البقاء على قيد الحياة لفترات طويلة (محلول ملح متوازن مضاف إليه تركيبات مختلفة من المواد الكيميائية العضوية و/أو المصل). 3) التطور غير المحدود. 4) وظائف متخصصة.

هناك أربعة تصنيفات متميزة للوسائط الاصطناعية:

وسائط تحتوي على المصل

النوع الأكثر شيوعًا من المكملات الغذائية الموجودة في الوسط المستخدم لزراعة الخلايا الحيوانية هو مصل البقر الجنيني. يتم إضافته إلى وسط المستنبت كمكمل منخفض التكلفة من أجل تحقيق أفضل ظروف نمو ممكنة. وبالإضافة إلى عمله كناقل أو مخلّب للمواد المغذية غير المستقرة أو غير القابلة للذوبان في الماء والهرمونات وعوامل النمو ومثبطات البروتياز وغيرها من المواد، فإن المصل يربط الجزيئات الضارة ويعادلها.

الوسط الخالي من المصل

ينطوي وجود المصل في الوسائط على عدد من العيوب وقد يتسبب في حدوث أخطاء كبيرة في التفسير في الأبحاث المناعية [2، 3]. تم إنشاء مجموعة متنوعة من الوسائط المختلفة الخالية من المصل [4، 5]. تُصاغ هذه الوسائط بشكل عام خصيصًا لدعم مزرعة نوع واحد من الخلايا، مثل وسط استبدال مصل الضربة القاضية ووسط DMEM من شركة Thermo Fisher Scientific، ووسط mTESR من شركة Stem Cell Technologies [6] للخلايا الجذعية [7].

بالإضافة إلى ذلك، تشتمل هذه الوسائط على كميات محددة من عوامل النمو المنقاة والبروتينات الدهنية والبروتينات الأخرى، والتي عادةً ما يتم توفيرها عادةً بواسطة المصل [8]. وغالبًا ما يشار إلى هذه الوسائط باسم "الوسائط الثقافية المحددة" نظرًا لأن المكونات التي تتكون منها هذه الوسائط مفهومة جيدًا.

الوسائط المحددة كيميائيًا

تتضمن هذه الوسائط مكونات عضوية وغير عضوية فائقة النقاء لم تتلوث بأي نوع من أنواع التلوث. وقد تتضمن أيضًا إضافات بروتينية نقية، مثل عوامل النمو.

ويؤدي التعديل الوراثي للبكتيريا أو الخميرة، إلى جانب إضافة أحماض دهنية وفيتامينات وكوليسترول وأحماض أمينية معينة، إلى إنتاج الأجزاء المكونة لها [9].

الوسائط الخالية من البروتين

الوسائط الخالية من البروتين هي تلك التي لا تشتمل على أي بروتين على الإطلاق، وبدلًا من ذلك تشتمل فقط على عناصر غير بروتينية. عند مقارنتها بالوسائط التي تحتوي على مصل مضاف، فإن استخدام الوسائط الخالية من البروتين المضاف يعزز تكاثر الخلايا والتعبير البروتيني ويسهل تنقية أي منتج يتم إنتاجه في عملية المصب [10-12]. لا يتم تضمين البروتين في تركيبات مثل MEM وRPMI-1640. ومع ذلك، يمكن إعطاء مكمل بروتيني إذا كان ذلك ضروريًا.

وسائط المزرعة ومكوناتها الأساسية

يمكن شراء وسط المستنبت التجاري كمسحوق أو سائل وغالبًا ما يتضمن مجموعة متنوعة من العناصر الغذائية مثل الأحماض الأمينية والجلوكوز والأملاح والفيتامينات والمكملات الغذائية الأخرى.

وتختلف احتياجات كل خط خلوي من هذه المكونات باختلاف احتياجات كل خط خلوي، وهذه الاختلافات هي المسؤولة عن العدد الكبير من التركيبات المختلفة للوسائط. كل مكون مسؤول عن وظيفة معينة، والتي سيتم توضيحها في الفقرات التالية:

أنظمة التخزين المؤقت

للحفاظ على ظروف النمو المثلى، يجب التحكم في الأس الهيدروجيني، وهو ما يتم غالبًا عن طريق أحد نظامي التخزين المؤقت:

نظام التخزين المؤقت الطبيعي

تكون نسبة CO2/H2CO3 في الغلاف الجوي مساوية لنسبة CO2/H2CO3 في الوسط، مما يخلق آلية تخزين مؤقت طبيعية. وللحفاظ على آلية التخزين المؤقت الطبيعي، يجب أن يتم الاحتفاظ بالمزارع في بيئة هوائية تحتوي على 5-10% من ثاني أكسيد الكربون، وهو ما يتحقق غالبًا باستخدام حاضنة ثاني أكسيد الكربون. أحد أفضل الأشياء في استخدام المخزن الطبيعي هو مدى رخص ثمنه وأمانه.

هيبيس

يتمتع التخزين الكيميائي باستخدام المخزن الكيميائي باستخدام الزويتريون HEPES بقدرة تخزين مؤقت أكبر في نطاق الأس الهيدروجيني من 7.2-7.4 ولا يحتاج إلى بيئة غازية منظمة. بالنسبة لأنواع معينة من الخلايا، قد تكون جرعة أكبر من HEPES ضارة. كما أن الوسائط التي تحتوي على HEPES أكثر عرضة للتأثيرات السمية الضوئية للضوء الفلوري [13].

الفينول الأحمر

غالبًا ما يتم تضمين مؤشر الأس الهيدروجيني الفينول الأحمر في وسط الاستزراع المتاح تجاريًا، مما يسمح بالمراقبة المستمرة للأس الهيدروجيني. ومن خلال توسيع الخلايا، تتسبب المستقلبات التي تنتجها هذه الخلايا في حدوث تحول في الأس الهيدروجيني وبالتالي تغير لون الوسط. وللفينول الأحمر الفينول تأثير مزدوج على لون الوسط، حيث يحوله إلى اللون الأصفر عند الأس الهيدروجيني الحمضي والأرجواني عند الأس الهيدروجيني القلوي. ويؤدي الأس الهيدروجيني 7.4، وهو القيمة المثلى لزراعة الخلايا، إلى ظهور الوسط باللون الأحمر الفلوري.

لكن الفينول الأحمر له بعض العيوب: أولًا، الفينول الأحمر قادر على محاكاة أداء عدد من هرمونات الستيرويد، وعلى رأسها الإستروجين [14]. لذلك، عند دراسة الخلايا الحساسة للإستروجين مثل أنسجة الثدي، يوصى باستخدام وسط خالٍ من الفينول الأحمر. يتعطل توازن الصوديوم والبوتاسيوم بسبب وجود الفينول الأحمر في العديد من التركيبات الخالية من المصل. قد تؤدي إضافة المصل أو هرمون الغدة النخامية البقري إلى الوسائط إلى مواجهة هذا التأثير [15]. ثالثًا، يعوق الكشف في تجارب قياس التدفق الخلوي وجود الفينول الأحمر.

الأملاح غير العضوية

تساعد الوسائط التي تحتوي على أملاح غير عضوية، مثل أيونات الصوديوم والبوتاسيوم والكالسيوم، في الحفاظ على التوازن التناضحي وتنظيم إمكانات الغشاء.

الأحماض الأمينية

بما أن الأحماض الأمينية هي المكونات الأساسية للبروتين، فهي مكون أساسي في كل وسط لنمو الخلايا تم تصوره على الإطلاق. ونظرًا لعدم قدرة الخلايا على إنتاج بعض الأحماض الأمينية من تلقاء نفسها، فمن المهم أن يتضمن وسط الاستزراع الأحماض الأمينية الأساسية. فهي ضرورية لتكاثر الخلايا، ويحدد التركيز الذي تتواجد فيه هذه الأحماض الأمينية الحد الأقصى لكثافة الخلايا التي يمكن تحقيقها. وعلى وجه الخصوص، يُعد حمض إل-جلوتامين وهو حمض أميني أساسي ضروري بشكل خاص.

يعمل إل-جلوتامين كمصدر ثانوي للطاقة في عملية الأيض ويساهم في إنتاج النيتروجين في إنتاج NAD و NADPH والنيوكليوتيدات. ونظرًا لحقيقة أن إل-جلوتامين هو حمض أميني غير مستقر، حيث يتحول مع مرور الوقت إلى شكل لا تستطيع الخلايا الاستفادة منه، يجب إعطاؤه للوسط.

بالإضافة إلى ذلك، يمكن تزويد الوسط بالأحماض الأمينية غير الأساسية من أجل إعادة تزويد الخلايا بالأحماض الأمينية التي تم استهلاكها خلال عملية النمو. يتم تعزيز نمو الخلايا وزيادة قابليتها للحياة عندما يتم تزويد وسط النمو بالأحماض الأمينية غير الأساسية.

الكربوهيدرات

الكربوهيدرات في شكل سكريات هي المصدر الرئيسي للطاقة. وتتضمن العديد من الوسائط أيضًا المالتوز والفركتوز بالإضافة إلى السكريات الأكثر شيوعًا مثل الجلوكوز والجالاكتوز.

البروتينات والببتيدات

يُعد الألبومين والترانسفيرين والفيبرونكتين أكثر البروتينات والببتيدات شيوعًا استخدامًا. وهي مهمة بشكل خاص في الوسائط التي لا تحتوي على المصل. يُعد الألبومين والترانسفيرين والأبروتينين والفيتوين والفيبرونكتين بعض البروتينات التي قد توجد في المصل، وهو مصدر غني بالبروتين.

والألبومين هو البروتين الأساسي الموجود في الدم، وتتمثل وظيفته في ربط ونقل المواد المختلفة، بما في ذلك الماء والأملاح والأحماض الدهنية الحرة والهرمونات والفيتامينات، بين الأعضاء والخلايا المختلفة. إن قدرة الألبومين على الالتصاق بالمواد الكيميائية تجعله مرشحاً فعالاً لإزالة المركبات الضارة من الوسط الذي تُزرع فيه الخلايا.

يُعتبر البروتينين عامل وقائي في أنظمة زراعة الخلايا، حيث أنه مستقر في الأس الهيدروجيني المحايد والحمضي، كما أنه مقاوم لدرجات الحرارة المرتفعة والتدمير الذي قد تسببه الإنزيمات المحللة للبروتين. وهو قادر على تثبيط عدد من البروتياز السيريني، بما في ذلك التربسين، من بين إنزيمات أخرى.

Fetuin هو بروتين سكري يمكن اكتشافه بكميات أكبر في مصل الأجنة والحيوانات حديثة الولادة مقارنة بمصل البالغين. بالإضافة إلى ذلك، يعمل كمثبط للبروتياز السيريني. يُعد بروتين الفبرونكتين مكونًا أساسيًا في عملية التصاق الخلايا. الترانسفيرين هو بروتين ينقل الحديد وهو مسؤول عن توصيل الحديد إلى أغشية الخلايا.

الأحماض الدهنية والدهون

تلعب دوراً حاسماً في الوسط الخالي من المصل عند غياب المصل.

الفيتامينات

العديد من الفيتامينات ضرورية لنمو الخلايا وتكاثرها. لا يمكن للخلايا إنتاج الفيتامينات بكميات كافية، وبالتالي فهي ضرورية في زراعة الأنسجة كمكملات غذائية.

في زراعة الخلايا، يكون المصل هو المصدر الأساسي للفيتامينات؛ ومع ذلك، تتم معالجة الوسائط أيضًا بفيتامينات مختلفة لجعلها مناسبة لنوع معين من الخلايا. وعادةً ما تستخدم فيتامينات المجموعة ب لتحفيز النمو.

العناصر النزرة

تُعرف العناصر الكيميائية مثل النحاس والزنك والسيلينيوم والعناصر الكيميائية الوسيطة لحمض ثلاثي الكربوكسيل بالعناصر النزرة. وغالباً ما تُضاف العناصر النزرة إلى الوسائط التي لا تتضمن المصل من أجل استبدال تلك العناصر الموجودة عادةً في المصل. هذه العناصر هي مكونات كيميائية مهمة مطلوبة لنمو الخلايا بشكل صحي. تعتمد العديد من التفاعلات الكيميائية الحيوية على بعض المغذيات الدقيقة، مثل نشاط الإنزيمات.

المكملات الغذائية المتوسطة

يحتاج وسيط النمو الكامل المقترح لبعض خطوط الخلايا إلى مكونات إضافية غير موجودة في الوسائط الأساسية والمصل. تدعم هذه المكملات الغذائية نمو الخلايا ووظيفة الأيض المناسبة.

على الرغم من أن الهرمونات وعوامل النمو وجزيئات الإشارات ضرورية للتكاثر المناسب لخطوط خلايا معينة، إلا أنه يجب دائمًا اتخاذ الاحتياطات التالية نظرًا لأن إضافة المكملات الغذائية قد تغير من الأسمولية في وسط النمو الكامل، مما قد يثبط نمو الخلايا، فمن المستحسن دائمًا التحقق من الأسمولية بعد إضافة المكملات الغذائية. بالنسبة لغالبية سلالات الخلايا، تتراوح الأسمولية المثلى بين 260 و320 مللي متر مكعب/كجم.

المضادات الحيوية

غالبًا ما تُستخدم المضادات الحيوية لتثبيط تطور الملوثات البكتيرية والفطرية [16]، على الرغم من أنها ليست ضرورية لنمو الخلايا. ونظرًا لأن المضادات الحيوية قد تخفي التلوث بالميكوبلازما والبكتيريا المقاومة، فلا يُقترح استخدامها الروتيني في زراعة الخلايا [17، 18].

بالإضافة إلى ذلك، قد تعطل المضادات الحيوية عملية التمثيل الغذائي للخلايا شديدة الحساسية. وغالبًا ما تُستخدم تركيبات البنسلين والستربتومايسين التي تصنعها شركتا ميليبورسيجما ولايف تكنولوجيز. وقد استُخدم البلازموسين في زراعة خطوط خلايا الورم الدبقي TS603 و TS516 و BT260 [19]، وقد ثبتت فعاليته في إزالة التلوث بالميكوبلازما (20).

المصل

توجد جميع الألبومات، وعوامل النمو، ومثبطات النمو في المصل. ويُعد المصل أحد أهم مكونات وسط مزرعة الخلايا لأنه يوفر الأحماض الأمينية والبروتينات والفيتامينات (خاصة الفيتامينات القابلة للذوبان في الدهون مثل A وD وE وK) والكربوهيدرات والدهون والهرمونات وعوامل النمو والمعادن والعناصر النزرة.

غالبًا ما يستخدم المصل من مصادر الجنين والعجل البقري لتعزيز نمو الخلايا المستزرعة. يُعد مصل الجنين مصدرًا وفيرًا لعوامل النمو ومناسبًا لاستنساخ الخلايا وتطوير الخلايا الحساسة. نظرًا لقدراته المتناقصة في تعزيز النمو، يُستخدم مصل العجل في تجارب تثبيط التلامس. وغالبًا ما تشتمل أوساط النمو العادية على مصل بنسبة 2% إلى 10%. تخدم إضافة المصل إلى وسط الاستزراع الأغراض التالية [21]:

• يوفر المصل العناصر الغذائية الأساسية للخلايا (سواءً في المحلول أو ملتصقاً بالبروتينات).

• يتم تضمين العديد من عوامل النمو والهرمونات المشاركة في تعزيز النمو ونشاط الخلايا المتخصصة في المصل.

• ويوفر العديد من البروتينات الرابطة مثل الألبومين والترانسفيرين التي تنقل مواد كيميائية أخرى إلى الخلية. على سبيل المثال، ينقل الألبومين الدهون والفيتامينات والهرمونات وغيرها إلى الخلايا.

• كما يوفر بروتينات، مثل الفيبرونكتين، التي تزيد من التصاق الخلايا بالركيزة. بالإضافة إلى ذلك، ينتج عناصر الانتشار التي تساعد في توسع الخلايا قبل الانقسام.

• ويوفر مثبطات البروتياز التي تمنع تحلل البروتين في الخلايا.

• كما أنه يحتوي على معادن مثل Na+، وK+، وZn2+، وFe2+.

• وهو يعزز لزوجة الوسائط، وبالتالي يحمي الخلايا من الإصابة الميكانيكية أثناء تقليب مزرعة المعلق.

• وهو أيضًا مادة عازلة.

المراجع

[1] Morgan J, Morton H, Parker R. تغذية الخلايا الحيوانية في مزرعة الأنسجة؛ دراسات أولية على وسط اصطناعي. Proc Soc Exp Biol Med. 1950;73:1-8

[2] Kerbel R, Blakeslee D. الامتزاز السريع لمكون مصل العجل الجنيني بواسطة خلايا الثدييات في المزرعة. مصدر محتمل للقطع الأثرية في دراسات المضادات للمستضدات الخاصة بالخلايا. علم المناعة. 1976;31:881-91

[3] Sula K, Draber P, Nouza K. إضافة المصل إلى الوسط المستخدم لتحضير معلقات الخلايا كمصدر محتمل للمواد المصنوعة بوساطة الخلايا التي تمت دراستها عن طريق اختبار العقدة الليمفاوية المأبضية. J Immunogenet. 1980;7:483-9

[4] Mariani E, Mariani A, Monaco M, Lalli E, Vitale M, Facchini A. الوسائط التجارية الخالية من المصل: نمو الورم الهجين وإنتاج الأجسام المضادة أحادية النسيلة. J Immunol Methods. 1991;145:175-83

[5] بارنز د، ساتو ج. طرق نمو الخلايا المستزرعة في وسط خالٍ من المصل. Anal Biochem. 1980;102:255-70

[6] Yu H, Lu S, Gasior K, Singh D, Vazquez Sanchez S, Tapia O,et al. HSP70 مرافق TDP-43 الخالي من الحمض النووي الريبي في قذائف كروية سائلة متباينة الخواص داخل النواة. Science. 2021;371:

[7] Meharena H, Marco A, Dileep V, Lockshin E, Akatsu G, Mullahoo J,et al. الشيخوخة الناجمة عن متلازمة داون-سيندروم تعطل البنية النووية للأسلاف العصبية. Cell Stem Cell. 2022;29:116-130.e7

[8] Iscove N, Melchers F. الاستبدال الكامل للمصل بالألبومين والترانسفيرين ودهون فول الصويا في مزارع الخلايا الليمفاوية ب المتفاعلة مع عديد السكاريد الدهني. J Exp Med. 1978;147:923-33

[9] Stoll T, Muhlethaler K, von Stockar U, Marison I. التحسين المنهجي لوسط خالٍ من البروتين المحدد كيميائيًا لنمو الورم الهجين وإنتاج الأجسام المضادة وحيدة النسيلة. J Biotechnol. 1996;45:111-23

[10] Darfler F. وسيط خالٍ من البروتين لنمو الورم المهجن وخلايا أخرى من الجهاز المناعي. In Vitro Cell Dev Biol. 1990;26:769-78

[11] بارنز د، ساتو ج. زراعة الخلايا الخالية من المصل: نهج موحد. Cell. 1980;22:649-55

[12] Hamilton W, Ham R. Ham R. النمو النسلي لخطوط خلايا الهامستر الصيني في وسائط خالية من البروتين. في المختبر. 1977;13:537-47

[13] Zigler J, Lepe Zuniga J, Vistica B, Gery I. تحليل التأثيرات السامة للخلايا لوسط الاستزراع المحتوي على HEPES المعرض للضوء. In Vitro Cell Dev Biol. 1985;21:282-7

[14] Berthois Y, Katzenellenbogen J, Katzenellenbogen B. الفينول الأحمر في وسط زراعة الأنسجة هو استروجين ضعيف: الآثار المترتبة على دراسة الخلايا المستجيبة للإستروجين في المستنبت. Proc Natl Acad Sci U S A. 1986;83:2496-500

[15] كارميول س. تطوير وسائط خالية من المصل. In: Master JRW, editor. زراعة الخلايا الحيوانية، الطبعة الثالثة. Oxford: Oxford University Press; 2000.

[16] Perlman D. استخدام المضادات الحيوية في وسائط زراعة الخلايا. Methods Enzymol. 1979;58:110-6

[17] ماكغاريتي ج. انتشار عدوى الميكوبلازم في مزارع الخلايا والسيطرة عليها. في المختبر. 1976;12:643-8

[18] Masters J, Stacey G. تغيير الوسط وتمرير خطوط الخلايا. Nat Protoc. 2007;2:2276-84

[19] Chakraborty A, Laukka T, Myllykoski M, Ringel A, Booker M, Tolstorukov M,et al. Histone demethylase KDM6A يستشعر الأكسجين مباشرة للتحكم في الكروماتين ومصير الخلية. Science. 2019;363:1217-1222

[20] Molla Kazemiha V، Azari S، Amanzadeh A، Bonakdar S، Shojaei Moghadam M، Habibi Anbouhi M،وآخرون. كفاءة البلازموسين™ على مختلف خطوط خلايا الثدييات المصابة بالموليات مقارنةً بالمضادات الحيوية شائعة الاستخدام في زراعة الخلايا: تجربة محلية. التكنولوجيا الخلوية. 2011;63:609-20

[21] كراغ هانسن يو. الجوانب الجزيئية لربط الليغاند بألبومين المصل. Pharmacol Rev. 1981;33:17-53