الخلايا البشرية الأولية

ما هي الخلايا الأولية البشرية؟

الخلايا الأولية هي أنقى تمثيل للأنسجة التي تنتمي إليها. يتم عزلها من النسيج ومعالجتها بحيث يمكن زراعتها في بيئة استزراع تتمتع بظروف مثالية. وهي تحاكي حالة الجسم الحي بشكل أوثق وتظهر وظائف فسيولوجية طبيعية لأنها مستمدة من الأنسجة وليست معدلة. ولهذا السبب، يمكن أن تكون نماذج مفيدة للبحوث في مجالات علم الأدوية الخلوي وعلم السموم وعلم وظائف الأعضاء (بما في ذلك دراسات التمثيل الغذائي والشيخوخة ونقل الإشارات). يجب أن نضع في اعتبارنا أن زراعة الخلايا الأولية وصيانتها تمثل تحديًا أكبر مقارنةً بالخطوط الخلوية المستمرة، وذلك لأن عمرها أقصر وستتوقف عن الانقسام (أو تدخل في مرحلة الشيخوخة) بعد عدد معين من الانقسامات الخلوية. تزداد تعقيدات دراسات مسارات الإشارات الخلوية بسبب التباين المتأصل في الخلايا الأولية التي يتم الحصول عليها من المتبرعين ومن خلال ممارسات إعادة الاستزراع. قبل البدء في دراسات الإشارات، غالبًا ما يجري الباحثون فحصًا لتحديد ما إذا كانت الخلايا تستجيب للمحفزات الشائعة الاستخدام أم لا. لتجنب إهدار الوقت والمال، يمكن تحفيز الخلايا الأولية لتنشيط مسارات الإشارات الرئيسية قبل فحصها.

لماذا تُستخدم الخلايا الأولية البشرية؟

تُستخدم سلالات الخلايا المُخلدة بشكل شائع كاختبار خلوي. على الرغم من أن العلماء قد أقروا بأن التغيرات البيولوجية الناتجة عن سلالات الخلايا قد تكون ضارة عند دراسة أهميتها الفسيولوجية. ويُحسّن استخدام الخلايا الأولية البشرية من القيمة الفسيولوجية للبيانات التي يتم الحصول عليها من خلال مزارع الخلايا، وتُعتبر هذه الخلايا بشكل متزايد ذات أهمية لدراسة العمليات البيولوجية، وتطور الأمراض، وتطوير الأدوية.

تُستخدم الخلايا الأولية البشرية على نطاق واسع في الدراسات المختبرية للتواصل بين الخلايا وداخل الخلايا، وعلم الأحياء التطوري، والآليات الكامنة وراء السرطان ومرض باركنسون والسكري، من بين العديد من مجالات البحث البيولوجي ما قبل السريري والاستقصائي الأخرى. لطالما استخدم الباحثون سلالات الخلايا المُخلَّدة لدراسة وظائف الأنسجة؛ ومع ذلك، قد لا تكون السلالات الخلوية التي تحتوي على طفرات واضحة وتشوهات كروموسومية بديلاً جيداً للخلايا الطبيعية ولتطور المرض في مراحله المبكرة. يمكن الآن الحصول على نموذج أكثر دقة لنوع معين من خلايا الأنسجة باستخدام الخلايا الأولية البشرية المعزولة من تلك الأنسجة والمحفوظة في وسائط ومكملات استزراع الخلايا الأولية.

ما هي زراعة الخلايا الأولية؟

بدلاً من استخدام سلالات الخلايا المُخلدة، تنطوي زراعة الخلايا الأولية على تنمية الخلايا مباشرةً من كائن متعدد الخلايا خارج الجسم. ويوجد اعتراف قانوني في بعض البلدان، مثل المملكة المتحدة، بحقيقة أن زراعة الخلايا الأولية تمثل الأنسجة الحية بشكل أفضل مقارنةً بسلالات الخلايا. ومع ذلك، تحتاج الخلايا الأولية إلى الركيزة والمغذيات المناسبة للنمو، وبعد عدد معين من الانقسامات، تظهر عليها سمات الشيخوخة التي تجعلها تتوقف عن الانقسام بشكل دائم. وهذان العاملان هما الدافع وراء إنشاء سلالات الخلايا. يمكن زراعة كل من الخلايا الأولية المُخلَّدة طبيعياً (مثل خلايا HeLa) والخلايا الأولية المُخلَّدة صناعياً (مثل خلايا HEK) إلى ما لا نهاية في مزارع الخلايا.

الخلايا الأولية البشرية حسب أنواع الأنسجة

تعد الخلايا الظهارية، والخلايا الليفية، والخلايا الكيراتينية، والخلايا الصباغية، والخلايا البطانية، والخلايا العضلية، والخلايا المناعية، والخلايا الجذعية مثل الخلايا الجذعية الوسيطة من بين الخلايا الأولية البشرية الأكثر استخدامًا في الدراسات العلمية. بادئ ذي بدء، تكون المزارع غير متجانسة (تمثل مزيجًا من أنواع الخلايا الموجودة في النسيج)، ولا يمكن الحفاظ عليها حية في المختبر إلا لفترة زمنية محددة. التحويل هو عملية تتم في المختبر تسمح بمعالجة الخلايا الأولية البشرية لإنتاج مزارع فرعية غير محدودة. يمكن أن يحدث التحويل بشكل طبيعي، أو يمكن تحفيزه بواسطة مواد كيميائية أو فيروسات. بعد الخضوع للتحويل الجيني، يمكن للزراعة الأولية أن تنقسم إلى ما لا نهاية لتشكل سلالة خلوية ثانوية خالدة إذا تم تزويدها بما يكفي من المغذيات والمساحة.

الخلايا البطانية

يعد علاج السرطان، والتئام الجروح، وأبحاث إشارات الخلايا، والفحص عالي الإنتاجية وعالي المحتوى، والفحص السمي، مجرد أمثلة قليلة على المجالات التي يمكن أن تستفيد من استخدام الخلايا البطانية الأولية كأداة بحثية.

الخلايا الكيراتينية

تلعب الخلايا الكيراتينية، المستمدة من البشرة البشرية للبالغين أو من القلفة عند الأطفال حديثي الولادة، دورًا حاسمًا في دراسة الأمراض الجلدية مثل الصدفية والسرطان.

الخلايا الظهارية

من دراسات السرطان إلى الأبحاث السمية، أثبتت الخلايا الظهارية الأولية أنها موارد لا تقدر بثمن لنمذجة الدفاعات الطبيعية للجسم.

الخلايا الليفية

يعد تحفيز الخلايا الجذعية متعددة القدرات (iPS) ودراسة التئام الجروح مجرد مثالين من بين العديد من الاستخدامات للخلايا الليفية الأولية.

الخلايا المناعية

الخلايا أحادية النواة في الدم المحيطي، والمعروفة اختصارًا بـ PBMC، هي خلايا أحادية النواة في الدم ذات نواة خلوية مستديرة. وتشمل بشكل أساسي الخلايا الليمفاوية والخلايا الأحادية، التي تضطلع بوظائف مهمة في سياق الاستجابة المناعية. غالبًا ما تُستخدم الخلايا أحادية النواة في الدم المحيطي لتشخيص العدوى أو للكشف عن الحماية المحتملة من اللقاح. وغالبًا ما يكون فهم الاستجابة المناعية الخلوية التي تتوسطها الخلايا التائية أمرًا بالغ الأهمية.

الخلايا الصباغية

تُعد الخلايا الصباغية، وهي خلايا الجلد المتخصصة التي تنتج الصبغة الميلانين، نماذج مفيدة للبحث في موضوعات مثل التئام الجروح، والسمية، وسرطان الجلد، واستجابة الجلد للأشعة فوق البنفسجية (UV)، وأمراض الجلد، ومستحضرات التجميل.

الخلايا الجذعية

تتمتع الخلايا الجذعية بالقدرة على التمايز إلى مجموعة واسعة من أنواع الخلايا. وبفضل قدرتها على التمايز، فإنها توفر فرصًا جديدة لنمذجة الأنسجة البشرية والحالات الصحية.

الخلايا الجذعية الوسيطة

يمكن الحصول على الخلايا الجذعية الوسيطة، المعروفة أيضًا باسم MSCs، من مصادر بشرية مختلفة مثل نخاع العظم، والدهون (الأنسجة الدهنية)، وأنسجة الحبل السري (هلام وارتون)، والسائل الأمنيوسي (السائل المحيط بالجنين)، ويمكن تكاثرها في المختبر. تتمتع هذه الخلايا الجذعية اللحمية البالغة بالقدرة على التطور إلى مجموعة واسعة من أنواع الخلايا. وتشمل بعض هذه الأنواع خلايا العظام، وخلايا الغضاريف، وخلايا العضلات، والخلايا العصبية، وخلايا الجلد، وخلايا القرنية.

خلايا العضلات الملساء

داخل الأعضاء المجوفة، تبطّن خلايا العضلات الملساء الأولية (SMCs) الجدار الداخلي وتتولى عملية الانقباض. بالإضافة إلى السرطان والأمراض الأخرى، يمكن استخدام خلايا العضلات الملساء الأولية (SMCs) لنمذجة التليف الناتج عن ارتفاع ضغط الدم.

الخلايا الأولية والخطوط الخلوية

سواء عن طريق الطفرة العفوية، كما هو الحال في سلالات الخلايا السرطانية المتحولة، أو من خلال التغيير المتعمد، كما هو الحال في الإنتاج الاصطناعي للجينات السرطانية، اكتسبت السلالات الخلوية المستمرة القدرة على التكاثر إلى ما لا نهاية (أصبحت خالدة). وكقاعدة عامة، تُعد السلالات الخلوية المستمرة أكثر موثوقية وسهولة في التعامل معها مقارنة بالخلايا الأولية. يمكنها التكاثر إلى ما لا نهاية وتوفر وصولاً سريعًا إلى البيانات الأساسية. ويواجه استخدام السلالات الخلوية المستمرة بعض القيود، بما في ذلك حقيقة أنها معدلة وراثيًا/محولة، مما قد يغير خصائصها الفسيولوجية ويجعلها لا تتطابق مع الظروف الحيوية، كما أن هذه الخصائص قد تتغير بمرور الوقت مع تكرار التمرير بشكل كبير.

التطورات في زراعة الخلايا الأولية

تشتهر الخلايا الأولية بصعوبة التعامل معها. ومع ذلك، أصبحت العملية أسهل من أي وقت مضى بفضل التطورات في زراعة الخلايا الأولية، وتوافر الخلايا الأولية التجارية مع بروتوكولات مُحسَّنة بالكامل، وتقنيات التحليل الجديدة التي تتطلب جهدًا أقل.

يُعتبر الانتقال من زراعة الخلايا ثنائية الأبعاد إلى ثلاثية الأبعاد علامة فارقة رئيسية في هذا المجال. فقد تتضاءل البنية الخاصة بالأنسجة، والتفاعلات بين الخلايا، والإشارات الميكانيكية/البيوكيميائية في الزراعة ثنائية الأبعاد. وبالتالي، هناك حدود قصوى للقيمة البيولوجية لهذه الزراعات.

من ناحية أخرى، تتيح زراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد للخلايا التكاثر والتفاعل مع هيكل خارج الخلية ثلاثي الأبعاد. وهذا يسمح للخلايا بالتفاعل مع بعضها البعض ومع المصفوفة خارج الخلية، مما يجعل الزراعات ثلاثية الأبعاد أكثر صلة من الناحية الفسيولوجية. وقد جعلت دقة هذه الطريقة في التنبؤ بالاستجابات داخل الجسم الحي منها طريقة ثورية في مجالات مثل اكتشاف الأدوية وتطويرها. ولهذا السبب، توفر التقنيات المتطورة، مثل الأعضاء المصغرة المستمدة من المرضى والأعضاء على رقاقة، نماذج سياقية للغاية لفحص الأدوية وتطويرها.

يُعد توليد الخلايا الأولية عقبة رئيسية في المزارع الأولية. وعادةً ما يتطلب التغلب على هذه العقبة حجمًا أكبر من الأنسجة، وهو ما قد يكون من الصعب تحقيقه. ومع ذلك، فإن تحسين الحساسية التحليلية يوفر طريقًا للمضي قدمًا. على سبيل المثال، تقل الحاجة إلى زراعة كميات كبيرة من الخلايا الأولية باستخدام تقنية الخلية الواحدة، والتي تشمل التسلسل الجيني، واختبار ويسترن بلوت، والقياس الخلوي الكتلي.

آفاق واعدة لزراعة الخلايا الأولية

يتم التخفيف من الصعوبات العامة لزراعة الخلايا الأولية بفضل التقدم التكنولوجي. وبالتالي، فإن هذه الطريقة تحل بسرعة محل الطرق الأخرى باعتبارها المعيار الذهبي في دراسة وممارسة البيولوجيا الخلوية والجزيئية. ومن المتوقع أن تستفيد صناعة اللقاحات، وزراعة الأعضاء، والعلاجات بالخلايا الجذعية، وأبحاث السرطان، وغيرها الكثير، بشكل كبير من التقدم المستمر في زراعة الخلايا الأولية.

نصائح وحيل حول زراعة الخلايا الأولية

متطلبات تكاثر الخلايا

الطريقتان الأكثر شيوعًا لزراعة الخلايا الأولية هما في المعلق أو على سطح (ثنائي الأبعاد). بعض الخلايا قادرة على الطفو بحرية في مجرى الدم دون أن تلتصق أبدًا بسطح ما (على سبيل المثال تلك المشتقة من الدم المحيطي). وقد تم هندسة سلالات خلوية مختلفة لتنمو بشكل جيد في مزارع التعليق، حيث يمكنها الوصول إلى كثافات لا يمكن تحقيقها في ظروف النمو ثنائية الأبعاد. وتُسمى الخلايا الأولية التي تحتاج إلى التثبيت لتنمو في المختبر بالخلايا الملتصقة، وتشمل تلك الموجودة في الأنسجة الصلبة. ولتحسين خصائص الالتصاق وتوفير الإشارات الأخرى اللازمة للنمو والتمايز، تُزرع هذه الخلايا عادةً في وعاء بلاستيكي مسطح غير مطلي، ولكن في بعض الأحيان تُزرع على حامل دقيق. وقد يكون هذا الخيار الأخير مطليًّا ببروتينات المصفوفة خارج الخلية (مثل الكولاجين واللامينين). تتكون الوسائط المستخدمة في زراعة الخلايا من وسط أساسي تم استكماله بعوامل النمو والسيتوكينات المناسبة. حاضنة الخلايا هي نوع خاص من حاضنات المختبرات تُستخدم لزراعة الخلايا والحفاظ عليها عند درجة حرارة محددة ومزيج غازي معين (عادةً 37 درجة مئوية، و5% ثاني أكسيد الكربون للخلايا الثديية). قد تختلف الظروف المثلى اختلافًا كبيرًا اعتمادًا على نوع الخلية التي يتم زراعتها. واعتمادًا على أنواع الخلايا التي يتم زراعتها، سيحتوي الوسط الأمثل للنمو على مزيج فريد من العوامل، بما في ذلك على سبيل المثال لا الحصر درجة الحموضة (pH)، وتركيز الجلوكوز، وعوامل النمو، ووجود مغذيات أخرى.

تعد المضادات الحيوية في وسط النمو أمرًا بالغ الأهمية أثناء إنشاء المزرعة الأولية لمنع التلوث من نسيج المضيف. تتضمن بعض أنظمة المضادات الحيوية مزيجًا من الجنتاميسين والبنسلين والستربتومايسين والأمفوتريسين B. ومع ذلك، لا يُنصح باستخدام المضادات الحيوية لفترة طويلة، لأن بعض الكواشف (مثل الأمفوتريسين B) قد تكون سامة للخلايا على المدى الطويل.

تمر معظم الخلايا الأولية بمرحلة الشيخوخة وتتوقف عن الانقسام بعد عدد معين من مرات تضاعف عدد الخلايا، مما يجعل من الضروري الحفاظ على بقائها حية بعد عزلها. تتطلب قابلية الخلايا للبقاء على المدى الطويل تقنيات متخصصة في زراعة الخلايا وظروف زراعة مثالية (بما في ذلك الوسط المناسب، ودرجة الحرارة المناسبة، ومزيج الغاز المناسب، ودرجة الحموضة المناسبة، والتركيز المناسب لعوامل النمو، ووجود العناصر الغذائية، ووجود الجلوكوز). ونظرًا لأن العديد من عوامل النمو المستخدمة لتكملة الوسائط يتم الحصول عليها من دم الحيوانات (حيث أن المكونات المشتقة من الدم تنطوي على احتمال التلوث)، يُوصى بتقليل استخدامها إلى الحد الأدنى أو تجنبها تمامًا. ومن المهم أيضًا استخدام تقنية معقمة.

إعادة الاستزراع والصيانة

عندما تلتصق الخلايا المعزولة بسطح طبق الاستزراع، فإن ذلك يمثل بداية مرحلة الصيانة. وعادةً ما يحدث الالتصاق بعد 24 ساعة من بدء عملية الاستزراع. يجب إعادة زراعة الخلايا عندما تصل إلى نسبة تلاقي معينة وتكون في حالة تكاثر نشط. ونظرًا لأن الخلايا بعد التلاقي قد تمر بمرحلة التمايز وتظهر تكاثرًا أبطأ بعد التمرير، فمن الأفضل إعادة زراعة المزارع الخلوية الأولية قبل أن تصل إلى نسبة تلاقي تبلغ 100٪.

يحافظ إعادة الاستزراع في وسائط جديدة على النمو الأسي للخلايا المعتمدة على التثبيت. تؤدي إعادة استزراع الطبقات الأحادية إلى تعطيل التفاعلات بين الخلايا وداخلها على سطح الخلية. تُستخدم تركيزات منخفضة من الإنزيمات البروتينية، مثل التريبسين/EDTA، لاستخراج الخلايا الأولية الملتصقة من الطبقات الأحادية أو الأنسجة. بعد فصل الخلايا وتخفيفها في محلول خلية واحدة، يتم عد الخلايا ونقلها إلى أوعية استزراع جديدة لإعادة الالتصاق والتكاثر.

الحفظ بالتبريد والاستعادة

يحافظ الحفظ بالتبريد على الخلايا الحية عن طريق تجميدها عند درجات حرارة منخفضة. ويمنع الحفظ بالتبريد وإذابة الخلايا الأولية البشرية موت الخلايا وتلفها أثناء التخزين والاستخدام. يتم حماية الخلايا الأولية البشرية من التلف الناتج عن التجميد باستخدام DMSO أو الجلسرين (عند درجة الحرارة الصحيحة وبمعدل تجميد متحكم فيه). يجب أن تكون عملية التجميد تدريجية، بمعدل -1 درجة مئوية في الدقيقة، لمنع تكوين بلورات الجليد. يتطلب التخزين طويل الأمد استخدام النيتروجين السائل (-196 درجة مئوية) أو درجات حرارة أقل من -130 درجة مئوية.

كل ما يتطلبه الأمر لإذابة الخلايا المحفوظة بالتبريد هو غمر الخلايا المجمدة في حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة تتراوح بين دقيقة واحدة ودقيقتين تقريبًا. لا ينبغي طرد الخلايا الأولية البشرية بعد إخراجها من الفريزر (لأنها شديدة الحساسية للتلف أثناء استعادتها من الحفظ بالتبريد). وهو مناسب لزراعة الخلايا مباشرة بعد إذابتها، كما أنه يعزز الالتصاق في المزارع خلال الـ 24 ساعة الأولى بعد الزراعة. 1 بعد أن تلتصق الخلايا الأولية المحفوظة بالتبريد، يجب إزالة الوسط المستهلك (نظرًا لأن DMSO ضار بالخلايا الأولية وقد يتسبب في انخفاض في قابلية البقاء على قيد الحياة بعد الذوبان).