人類原代細胞

何謂人類原代細胞？

原代細胞是其所屬組織最純粹的代表。它們從組織中分離出來並經過處理，以便能在具備理想條件的培養環境中建立穩定細胞系。 由於它們源自組織而非經人工改造，因此更能模擬體內狀態並展現正常的生理功能。正因如此，它們可作為細胞藥理學、毒理學及生理學（包括代謝、老化與訊號傳導研究）的實用研究模型。 請注意，與連續細胞系相比，原代細胞的培養與維護更具挑戰性，因為其壽命較短，且在經歷一定次數的細胞分裂後便會停止分裂（或進入衰老狀態）。 由於來自捐贈者及經由傳代培養所獲得的原代細胞具有固有的變異性，這使得細胞訊號傳導路徑的研究變得更加複雜。在開始訊號傳導研究之前，研究人員通常會進行篩選，以確定細胞是否對常用刺激物產生反應。為避免浪費時間和金錢，可在篩選前先刺激原代細胞以激活主要訊號傳導路徑。

為何使用人類原代細胞？

不朽化細胞系常被用作細胞檢測模型。儘管科學家已承認，細胞系所導致的生物學變化可能對研究其生理意義造成不利影響。使用人類原代細胞可提升透過細胞培養所獲得數據的生理學價值，且其重要性在研究生物過程、疾病進展及藥物開發等領域中日益受到重視。

人類原代細胞廣泛應用於細胞間與細胞內通訊的體外研究、發育生物學，以及癌症、帕金森氏症和糖尿病等疾病背後的機制研究，並涵蓋許多其他臨床前與探索性生物研究領域。 研究人員長期以來一直使用永生化細胞系來研究組織功能；然而，具有明顯突變和染色體異常的細胞系，可能無法作為正常細胞及其早期疾病發展的良好替代模型。 如今，透過從特定組織中分離出人類原代細胞，並將其維持在原代細胞培養基及補充劑中，已能建立更精確的特定組織細胞類型模型。

何謂原代細胞培養？

與使用不朽化細胞系不同，原代細胞培養是將來自多細胞生物體的細胞直接在體外培養。部分國家（例如英國）在法律上已承認，相較於細胞系，原代細胞培養更能代表體內組織的特性。 儘管如此，原代細胞仍需適當的基質和營養物質才能生長，且經過一定次數的分裂後，會呈現衰老表型，導致其永久停止分裂。這兩個因素促使了細胞系的建立。 無論是自然不老化的原代細胞（例如 HeLa 細胞），還是人工不老化的原代細胞（例如 HEK 細胞），皆可在細胞培養中無限期地持續培養。

按組織類型劃分的人類原代細胞

上皮細胞、成纖維細胞、角質形成細胞、黑色素細胞、內皮細胞、肌肉細胞、免疫細胞，以及間質幹細胞等幹細胞，均屬科學研究中最常使用的人類原代細胞。 首先，這些培養物具有異質性（代表組織中存在的多種細胞類型），且僅能在體外維持生命一段特定時間。轉化是一種體外過程，可使人類原代細胞經過操作後進行無限次傳代。 轉化可能自然發生，亦可由化學物質或病毒誘導。經過基因轉化後，若提供足夠的營養與空間，原代培養物便能無限分裂，形成不朽化的次代細胞系。

內皮細胞

癌症治療、傷口癒合、細胞訊號傳導研究、高通量與高內容篩選，以及毒理學篩選，僅是部分能從將原代內皮細胞用作研究工具中受益的領域。

角質形成細胞

角質形成細胞源自成人皮膚表皮或新生兒包皮，在銀屑病和癌症等皮膚疾病的研究中扮演著關鍵角色。

上皮細胞

從癌症研究到毒理學調查，原代上皮細胞已被證實是模擬人體自然防禦機制的無價資源。

成纖維細胞

誘導多能幹細胞（iPS）及研究傷口癒合，僅是原代成纖維細胞眾多用途中的少數幾項。

免疫細胞

外周血單核細胞（簡稱 PBMC）是血液中具有圓形細胞核的單核細胞。它們主要包含淋巴細胞和單核細胞，這兩類細胞在免疫反應過程中扮演著重要角色。 外周血單核細胞常被用於診斷感染或檢測疫苗可能提供的保護作用。深入了解由 T 細胞介導的細胞免疫反應，往往至關重要。

黑色素細胞

黑色素細胞是能產生色素「黑色素」的專一性皮膚細胞，可作為研究傷口癒合、毒性、黑色素瘤、皮膚對紫外線（UV）輻射的反應、皮膚疾病及化妝品等議題的理想模型。

幹細胞

幹細胞具有分化為多種細胞類型的潛力。憑藉其分化能力，它們為建模人體組織及健康狀況提供了嶄新的機會。

間充質幹細胞

間質幹細胞（亦稱 MSC）可從人體不同來源取得，例如骨髓、脂肪（脂肪組織）、臍帶組織（華頓膠）及羊水（包圍胎兒的液體），並可在體外擴增。 這些成人基質幹細胞具有發育為多種細胞類型的能力，其中包括骨細胞、軟骨細胞、肌肉細胞、神經細胞、皮膚細胞及角膜細胞等。

平滑肌細胞

在中空器官內，原代平滑肌細胞（SMCs）鋪設於內壁並調節收縮功能。除了癌症及其他疾病外，平滑肌細胞亦可用於建立高血壓纖維化的模型。

原代細胞與細胞系

無論是透過自發性突變（如轉化後的癌細胞系），還是透過人為改變（如人工製備癌基因），連續細胞系皆已具備無限繁殖的潛力（不朽化）。一般而言，連續細胞系比原代細胞更可靠且更便於處理。 它們能夠無限擴增，並能快速提供關鍵數據。使用連續細胞系存在某些限制，包括其經過基因改造／轉化，這可能改變生理特徵而與體內狀況不符；此外，隨著傳代次數增加，這些特徵還可能隨時間進一步改變。

原代細胞培養的進展

原代細胞素來以操作困難而聞名。然而，得益於原代細胞培養技術的發展、附帶完全優化操作流程的商業化原代細胞的普及，以及所需投入較少的新分析技術，其操作過程正變得比以往任何時候都更加簡便。

從二維細胞培養轉向三維細胞培養，被視為該領域的一項重要里程碑。在二維培養中，組織特異性結構、細胞間相互作用以及機械／生化訊號傳導可能受到削弱。因此，此類培養的生物學價值存在上限。

另一方面，三維細胞培養使細胞能夠擴增並與三維細胞外支架相互作用。這使細胞得以彼此互動並與細胞外基質交互作用，使三維培養更具生理相關性。 此方法在預測體內反應方面的準確性，使其在藥物發現與開發等領域帶來革命性變革。正因如此，諸如源自患者的類器官及「晶片上的器官」等尖端技術，為藥物篩選與開發提供了高度情境化的模型。

原代細胞的建立是原代培養中的瓶頸。 為克服此難題，通常需要較大的組織量，但這往往難以達成。然而，分析靈敏度的提升正為我們開闢新的出路。例如，透過運用單細胞技術（包括定序、Western blot 及質譜流式細胞術），可減少對大量原代細胞培養的需求。

原代細胞培養的前景可期

隨著技術的進步，原代細胞培養所面臨的整體困難正逐漸減輕。相應地，此方法正迅速取代其他方法，成為細胞與分子生物學研究及實踐中的黃金標準。疫苗製造、器官移植、幹細胞療法、癌症研究等眾多領域，都將從原代細胞培養的持續進步中獲益匪淺。

原代細胞培養的訣竅與技巧

細胞擴增的需求

培養原代細胞最常見的兩種方法是懸浮培養或表面附著培養（2D）。某些細胞能夠在血液中自由漂浮，而無需附著於任何表面（例如源自外周血的細胞）。 部分細胞系經過基因工程改造，能在懸浮培養中茁壯成長，其密度可達到二維生長條件下無法企及的水平。需要在體外依附於表面才能生長的原代細胞稱為黏附細胞，其中包括實體組織中的細胞。 為了改善黏附特性並提供生長與分化所需的其他訊號，這些細胞通常在平底未塗層的塑膠培養皿中培養，但偶爾也會使用微載體。後者可能塗覆有細胞外基質蛋白（例如膠原蛋白和層黏蛋白）。 細胞培養所使用的培養基，是由基礎培養基中添加適當生長因子和細胞因子所組成。細胞培養箱是一種特殊的實驗室培養箱，用於在特定溫度與氣體混合物（哺乳動物細胞通常為 37 °C、5% CO₂）下培養和維持細胞。 根據所培養細胞的類型不同，最佳培養條件可能大相逕庭。視所培養細胞的種類而定，最佳生長培養基將具有獨特的因子組合，包括但不限於 pH 值、葡萄糖濃度、生長因子以及其他營養物質的存在。

在建立原代培養過程中，培養基中的抗生素對於防止來自宿主組織的污染至關重要。 某些抗生素方案會結合使用慶大黴素、青黴素、鏈黴素和兩性黴素 B。然而，不建議長期使用抗生素，因為某些試劑（例如兩性黴素 B）長期而言可能對細胞具有毒性。

大多數原代細胞在經歷一定次數的細胞群倍增後會進入衰老階段並停止分裂，因此，在分離後維持其存活至關重要。 要維持細胞的長期存活，需要嫻熟的細胞培養技術以及理想的培養條件（包括適當的培養基、適當的溫度、適當的氣體混合物、適當的 pH 值、適當濃度的生長因子、營養物質的存在以及葡萄糖的存在）。 由於用於補充培養基的許多生長因子是從動物血液中提取的（源自血液的成分可能存在污染風險），因此建議盡量減少或完全避免使用這些生長因子。此外，採用無菌操作技術也至關重要。

傳代與維持

當分離出的細胞附著於培養皿表面時，即標誌著維持階段的開始。細胞通常在培養開始後 24 小時發生附著。 當細胞達到一定的匯合百分比且處於活躍增殖狀態時，應進行傳代。由於過匯合後的細胞可能發生分化，且在傳代後增殖速度會變慢，因此最好在原代細胞培養達到 100% 匯合度之前進行傳代。

使用新鮮培養基進行傳代，可維持依附型細胞的指數級生長。對單層細胞進行傳代會破壞細胞間及細胞內的細胞表面相互作用。 使用低濃度的蛋白水解酶（例如胰蛋白酶/EDTA）可將附著於單層或組織上的原代細胞分離出來。細胞經分離並稀釋成單細胞懸浮液後，需進行計數，並轉移至新的培養容器中，以便重新附著並增殖。

冷凍保存與復原

冷凍保存是透過低溫冷凍來保存活細胞。對人類原代細胞進行冷凍保存與解凍，可防止細胞在儲存及使用過程中死亡或受損。人類原代細胞使用二甲基亞砜（DMSO）或甘油進行冷凍保護（須在正確溫度下並以受控的冷凍速率進行）。 冷凍過程必須循序漸進，每分鐘降溫 1 °C，以防止冰晶形成。長期儲存需使用液態氮（-196 °C）或低於 -130 °C 的溫度。

將冷凍細胞浸入 37 °C 水浴中約 1 至 2 分鐘，即可完成冷凍保存細胞的解凍。人類原代細胞從冷凍庫解凍後不應進行離心（因其從冷凍保存狀態恢復期間極易受損）。 此方法適合在解凍後立即將細胞接種，並能促進接種後首24小時內的細胞附著。1 當冷凍保存的原代細胞附著後，必須移除用過的培養基（因為二甲基亞砜（DMSO）對原代細胞有害，並可能導致解凍後的存活率下降）。