細胞培養基：概述

在生命科學領域中，細胞培養是最重要的方法之一。所謂「細胞培養」，是指從動物或植物體內取出細胞、組織或器官，並將其移植至有利於其存活和／或生長的人工環境中。 細胞要達到最佳發育，其基本環境需求包括：受控溫度、供細胞附著的基質、適當的培養基，以及能維持最佳 pH 值與滲透壓的培養箱。細胞必須具備這些條件，才能充分發揮其生長潛能。

為體外培養選擇適當的生長培養基，是細胞培養過程中既最關鍵又至關重要的一環。 生長培養基（亦稱培養基）是一種經特殊配製的液體或凝膠，旨在促進微生物、細胞或植物等微觀層面的生長發育。用於細胞培養的培養基通常含有充足的能量來源，以及能調控細胞週期的物質。 培養基的主要成分包括胺基酸、維生素、無機鹽、葡萄糖及血清。血清被添加至培養基中，是因為它能作為生長因子、荷爾蒙及附著因子的來源。除了提供營養外，培養基也有助於維持 pH 值和滲透壓水平。

細胞培養中使用的培養基類型

無論是人類細胞還是動物細胞，皆可於人工或合成培養基中生長，亦可於經天然元素補充的完全天然培養基中生長。以下將為您概述目前可用的各種培養基類型。

天然培養基

天然培養基中僅含有以自然狀態存在的生物體液。天然培養基對於培養多種動物細胞類型非常有用且容易操作。由於對構成天然培養基的精確成分缺乏了解，這正是導致使用天然培養基所獲得結果重複性較低的主要因素。

人工培養基

人工或合成培養基的製備，涉及添加營養物質（包括有機與無機）、血清蛋白、碳水化合物、輔因子、維生素及鹽類，以及 O₂ 和 CO₂ 氣相成分 [1]。

為滿足以下一項或多項功能，已開發出各類人工培養基：1) 即時存活（pH 值與滲透壓精確控制的平衡鹽溶液）。2) 長期存活（在平衡鹽溶液中添加不同配方的有機化學物質和／或血清）。 3) 無限期發育。4) 特殊功能。

人工培養基有四種明確的分類：

含血清培養基

在動物細胞培養基中最常見的補充成分是胎牛血清。其作為低成本的補充劑添加至培養基中，以實現最佳的生長條件。 除了作為不穩定或水不溶性營養物質、激素、生長因子、蛋白酶抑制劑及其他物質的載體或螯合劑外，血清還能結合並中和有害分子。

無血清培養基

培養基中存在血清有許多缺點，且可能導致免疫學研究中出現重大的解讀錯誤 [2, 3]。目前已開發出多種不同的無血清培養基 [4, 5]。 這些培養基通常是專門配製以支持單一細胞類型的培養，例如 Thermo Fisher Scientific 的 Knockout Serum Replacement 和 Knockout DMEM，以及 Stem Cell Technologies 針對幹細胞所開發的 mTESR 培養基 [6] [7]。

此外，這些培養基中還添加了精確定量的純化生長因子、脂蛋白及其他蛋白質，這些成分通常由血清提供[8]。由於構成這些培養基的成分已充分釐清，因此常被稱為「定義型培養基」。

化學定義培養基

此類培養基包含未受任何污染的超純無機及有機成分，亦可能添加純蛋白質，例如生長因子。

 透過對細菌或酵母進行基因改造，並添加特定的脂肪酸、維生素、膽固醇及胺基酸，即可製備其組成成分 [9]。

無蛋白質培養基

無蛋白質培養基是指完全不含任何蛋白質，僅包含非蛋白質成分的培養基。相較於添加血清的培養基，使用未添加蛋白質的培養基能促進更強的細胞增殖與蛋白質表達，並使下游製程中產生的任何產品更易於純化 [10-12]。 MEM 和 RPMI-1640 等配方中均不含蛋白質。然而，如有必要，仍可添加蛋白質補充劑。

培養基及其基本成分

市售培養基可購買粉末或液體形式，通常包含多種營養成分，例如胺基酸、葡萄糖、鹽類、維生素及其他營養補充劑。 

各細胞系對這些成分的需求各不相同，正是這些差異導致了培養基配方種類繁多。每個成分皆負責特定功能，以下段落將對此進行概述：

緩衝系統

為維持最佳生長條件，必須控制 pH 值，這通常透過以下兩種緩衝系統之一來實現：

天然緩衝系統

大氣中的二氧化碳（CO₂）與碳酸（H₂CO₃）比例等同於培養基中的比例，從而形成一種天然緩衝機制。為了保留這種天然緩衝機制，培養物必須置於二氧化碳濃度為 5-10% 的空氣環境中，這通常是透過使用二氧化碳培養箱來實現的。 使用天然緩衝系統的最大優點之一，在於其成本低廉且安全可靠。

HEPES

利用兩性離子 HEPES 進行的化學緩衝，在 pH 值 7.2–7.4 的範圍內具有更強的緩衝能力，且無需維持受控的氣體環境。對於特定細胞類型而言，過量的 HEPES 可能具有危害性。 同樣地，含有 HEPES 的培養基也更容易受到螢光燈的光毒性影響 [13]。

酚紅

pH 指示劑苯酚紅常被添加於市售培養基中，以便持續監測 pH 值。隨著細胞增殖，其產生的代謝物會導致 pH 值變化，進而使培養基顏色產生變化。 酚紅對培養基顏色具有雙重作用：在酸性 pH 值下呈黃色，在鹼性 pH 值下則呈紫色。pH 7.4（細胞培養的最佳值）會使培養基呈現螢光紅色。

然而，酚紅存在幾項缺點：首先，酚紅能夠模擬多種類固醇激素（主要是雌激素）的作用[14]。因此，在研究乳腺組織等對雌激素敏感的細胞時，建議使用不含酚紅的培養基。 在若干無血清培養基配方中，酚紅的存在會破壞鈉-鉀平衡。向培養基中添加血清或牛腦下垂體激素可抵消此影響 [15]。第三，酚紅的存在會妨礙流式細胞術實驗中的檢測。

無機鹽

含有無機鹽（如鈉、鉀和鈣離子）的培養基，有助於維持滲透平衡並調節膜電位。

胺基酸

由於胺基酸是蛋白質的基本組成部分，因此它們是迄今為止所有已開發細胞生長培養基中不可或缺的成分。由於細胞無法自行合成某些胺基酸，因此培養基中必須包含必需胺基酸。 這些胺基酸對細胞增殖不可或缺，其濃度決定了可達到的最大細胞密度。其中，作為必需胺基酸的 L-谷氨酰胺尤為關鍵。

L-谷氨醯胺在代謝過程中充當次要能量來源，並為 NAD、NADPH 及核苷酸的合成提供氮源。由於 L-谷氨醯胺是一種不穩定的胺基酸，隨時間推移會轉化為細胞無法利用的形式，因此必須額外添加至培養基中。

此外，可向培養基中添加非必需胺基酸，以補充生長過程中消耗的胺基酸。當培養基中補充非必需胺基酸時，可促進細胞生長並提高其存活率。

碳水化合物

以糖類形式存在的碳水化合物是主要的能量來源。許多培養基除了常見的葡萄糖和半乳糖外，還包含麥芽糖和果糖。

蛋白質與胜肽

白蛋白、轉鐵蛋白和纖維連接蛋白是最常用的蛋白質與胜肽。它們在不含血清的培養基中尤為重要。血清是蛋白質的豐富來源，其中可能包含白蛋白、轉鐵蛋白、阿普羅丁、胎蛋白和纖維連接蛋白等蛋白質。

白蛋白是血液中主要的蛋白質，其功能在於結合並運輸各種物質——包括水、鹽類、游離脂肪酸、荷爾蒙及維生素——於不同器官與細胞之間。白蛋白具有與化學物質結合的能力，使其成為從細胞培養基中去除有害化合物的有效候選物質。

阿普羅替寧是細胞培養系統中的保護劑，因為它在中性及酸性 pH 值下均保持穩定，且能耐受高溫以及蛋白水解酶可能造成的破壞。它能夠抑制多種絲氨酸蛋白酶，包括胰蛋白酶等。

胎蛋白（Fetuin）是一種糖蛋白，在動物胎兒及新生兒的血清中，其含量通常高於成年動物的血清。此外，它還具有絲氨酸蛋白酶抑制劑的作用。纖維連接蛋白（fibronectin）是細胞黏附過程中不可或缺的組成部分。 轉鐵蛋白是一種負責運輸鐵質並將鐵輸送至細胞膜的蛋白質。

脂肪酸與脂質

當血清缺失時，它們在無血清培養基中扮演著關鍵角色。

維生素

多種維生素對於細胞的發育與增殖至關重要。由於細胞無法自行合成足量的維生素，因此在組織培養中，維生素作為膳食補充劑不可或缺。

在細胞培養中，血清是維生素的主要來源；然而，培養基也會添加各種維生素，以使其適合特定類型的細胞。最常見的是，B 群維生素被用於刺激細胞生長。

微量元素

銅、鋅、硒以及三羧酸中間代謝物等化學元素被稱為微量元素。為了替代血清中通常存在的微量元素，通常會在不含血清的培養基中添加微量元素。這些元素是健康細胞發育所必需的重要化學成分。 許多生化反應（例如酶活性）都依賴於特定的微量營養素。

培養基補充劑

針對特定細胞系的建議完整生長培養基，需要額外添加基線培養基和血清中缺乏的成分。這些營養補充劑有助於支持細胞生長及維持適當的代謝功能。

儘管激素、生長因子和訊號分子對於特定細胞系的正常增殖至關重要，但應始終採取以下預防措施：由於添加補充劑可能會改變完整生長培養基的滲透壓，進而抑制細胞發育，因此建議在添加補充劑後務必驗證滲透壓。 對於大多數細胞系而言，最佳滲透壓範圍為 260 至 320 mOSM/kg。

抗生素

抗生素常被用於抑制細菌和真菌污染物的生長 [16]，儘管它們並非細胞生長所必需。由於抗生素可能會掩蓋支原體和耐藥細菌的污染，因此不建議在細胞培養中常規使用 [17, 18]。

此外，抗生素可能會干擾高敏感性細胞的代謝。MilliporeSigma 和 Life Technologies 生產的青黴素-鏈黴素組合製劑常被使用。 Plasmocin 已被應用於 TS603、TS516 及 BT260 這三種膠質瘤細胞系的培養中 [19]，且已被證實能有效清除支原體污染 (20)。

血清

血清中含有白蛋白、生長因子及生長抑制因子。血清是細胞培養基中最重要的成分之一，因為它能提供胺基酸、蛋白質、維生素（尤其是脂溶性維生素，如 A、D、E 和 K）、碳水化合物、脂質、荷爾蒙、生長因子、礦物質及微量元素。

通常使用牛胎兒血清和牛犢血清來促進培養細胞的生長。胎兒血清富含生長因子，適合用於細胞克隆及敏感細胞的培養。由於牛犢血清的促進生長能力較弱，因此常被用於接觸抑制實驗。 標準培養基通常含有 2% 至 10% 的血清。向培養基中添加血清具有以下作用 [21]：

• 血清為細胞提供必需的營養物質（包括溶解於溶液中及附著於蛋白質上的形式）。

• 血清中含有多種參與促進生長及特殊細胞活動的生長因子與激素。

• 血清提供多種結合蛋白，例如白蛋白和轉鐵蛋白，這些蛋白質能將其他化學物質運輸至細胞內。例如，白蛋白會將脂肪、維生素、荷爾蒙等物質輸送至細胞中。

• 血清還提供如纖維連接蛋白等蛋白質，可增強細胞與基質之間的黏附力。此外，血清所含的擴散因子有助於細胞在分裂前擴展。

• 血清會輸送蛋白酶抑制劑，以防止細胞內的蛋白質水解作用。

• 血清中還含有鈉離子（Na+）、鉀離子（K+）、鋅離子（Zn2+）及鐵離子（Fe2+）等礦物質。

• 它能提高培養基的黏度，從而保護細胞在懸浮培養攪拌過程中免受機械損傷。

• 它同時也具有緩衝作用。

參考文獻

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