Yayın tarihi: 2023 | Son güncelleme tarihi: Mayıs 2026

Hücrelerin Dondurulmasına İlişkin Kapsamlı Kılavuz: Canlılık ve Sterilitenin Sağlanması

Hücrelerin dondurulması, hücre kültürü yönetiminde kritik bir süreçtir ve değerli hücre hatlarının uzun süreli depolanmasını ve korunmasını sağlar. İster insan ister hayvan hücreleriyle çalışılıyor olsun, başarılı bir kriyoprezervasyon elde etmek için hassas protokollere uymak ve sıkı aseptik teknikleri uygulamak son derece önemlidir.

Bu kılavuz, hücrelerin canlılığını ve sterilliğini korurken etkili bir şekilde dondurmak için gerekli malzemeler, reaktifler ve adım adım prosedürler hakkında ayrıntılı talimatlar sunar. Araştırmacılar bu yönergelere uyarak, hücre canlılığında minimum kayıpla hücre kültürlerini güvenle saklayabilir ve daha sonra canlandırabilir, böylece deney sonuçlarının bütünlüğünü ve güvenilirliğini koruyabilirler.

Başlangıç olarak, steril bir çalışma ortamı oluşturmak çok önemlidir. Uygun aseptik teknikler, kontaminasyonu önlemek ve kültürlerin sterilliğini sağlamak için çok önemli bir rol oynar.

Aseptik Teknik

Kültürlerin sterilliğini sağlamak için süreç boyunca aseptik teknikleri uygulayın.

Kapsamlı Hücre Dondurma Süreci

Bu akış şeması, hücrelerin uygun şekilde dondurulması için gerekli adımları ayrıntılı bir şekilde gösterir. Kriyoprezervasyon süreci boyunca yüksek hücre canlılığı ve bütünlüğünü sağlamak için bu prosedürleri izleyin.

Dondurma Ortamının Hazırlanması

Hücre tipine göre kriyoprotektif dondurma ortamı hazırlayın:

FBS içeren ortam kültürleri: %90 FBS + %10 DMSO veya %70 büyüme ortamı, %20 FBS ve %10 DMSO
Gliserol gerektiren hücreler: %90 FBS + %10 gliserol

Önceden formüle edilmiş dondurma ortamımızı satın almayı düşünün:

Dondurma Ortamı CM-1: Fetal Sığır Serumu (FBS) içeren bir ortam gerektiren protokoller için
Dondurma ortamı CM-ACF - serumsuz: FBS içermeyen bir alternatif için

Etiketleme ve Belgeleme

Kriyo şişeleri aşağıdaki ayrıntılarla etiketleyin:

Tarih
Araştırmacının adı
Hücre numarası
Pasaj numarası
Hücre tipi
Ek bilgiler (örn. genetik modifikasyonlar)

Hücre Hazırlığı

Yapışkan Hücreler İçin:

Hücreler %85–95 konfluansa ulaşana kadar izlenir
Eski kültür ortamını aspire edin
Hücre tek tabakasını kalsiyum ve magnezyum içermeyen PBS ile durulayın
Hücreleri Accutase, tripsin veya tripsin-EDTA ile ayırın ve gerekirse kültür besiyeri ile nötralize edin
Hücre süspansiyonunu 50 mL'lik bir Falcon tüpüne aktarın

Süspansiyon Hücreleri için:

Mikroskop altında hücre yoğunluğunu ve sağlığını kontrol edin
Hücre süspansiyonunu doğrudan 50 mL'lik bir Falcon tüpüne aktarın

Hücre Sayımı ve Santrifüjleme

Hemositometre veya otomatik hücre sayıcı kullanarak hücreleri sayın
Hücreleri çökeltmek için oda sıcaklığında 300 g'de 3-5 dakika santrifüjleyin
Hücre topaklarının bozulmasını önleyerek süpernatantı dikkatlice eminiz
Hazırlanan dondurma ortamını kullanmadan önce 37°C'ye ısıtın

Kriyoprezervasyon

Hücre peletini dondurma ortamında, yapışkan hücreler için 2,0 milyon hücre/mL ve süspansiyon hücreleri için 5 milyon hücre/mL yoğunluğuna veya istediğiniz konsantrasyona getirin
Hücre süspansiyonundan 1,0 mL (veya gerektiği kadar daha fazla) etiketli kriyo şişelere bölün
Hücreleri uzun süreli depolamaya aktarmadan önce yavaş dondurma yöntemi kullanın

? Yöntem: ? Adımlar
❄️ Manuel Dondurma: 1️⃣ Hücreleri dondurma ortamında 4°C'lik bir dondurucuya 40 dakika boyunca koyun.
2️⃣ -80°C'lik bir dondurucuya 24 saat boyunca aktarın.
3️⃣ Uzun süreli saklama için hücreleri sıvı azot içinde saklayın.
? Mr. Frosty'yi kullanma: 1️⃣ Hücreleri dondurma ortamı içeren kriyo şişelerde hazırlayın.
2️⃣ Kriyo şişeleri Mr. Frosty kabına yerleştirin.
3️⃣ Sıvı azota aktarmadan önce 24 saat boyunca -80°C'de saklayın.
? Kontrollü Hızlı Dondurucu: 1️⃣ Cihazı, sıcaklığı kademeli olarak düşürecek şekilde programlayın.
2️⃣ Hazırlanan hücreleri dondurucuya yerleştirin.
3️⃣ Dondurma döngüsünden sonra, hücreleri sıvı azota aktarın.

Kriyoşişleri uzun süreli saklama için -130°C'nin altındaki sıcaklıklarda veya sıvı azot içinde saklayın.

Malzemeler ve Reaktifler

1–2 mL kriyoşişeler
CoolCell® dondurma ünitesi veya kontrollü hızda dondurucu
Kriyoprotektif dondurma ortamı (örn. DIY kriyoprotektif ortam, CM-1, CM-ACF veya özel ortamlar)
Fetal Sığır Serumu (FBS) veya koşullandırılmış ortam
DMSO veya gliserol
Kalsiyum ve magnezyum içermeyen PBS
Accutase, Tripsin veya Tripsin-EDTA (yapışkan hücreler için)
15 mL veya 50 mL Falcon tüpleri
Hemocitometre veya otomatik hücre sayıcı
Santrifüj