İnsan Birincil Hücreleri

İnsan birincil hücreleri nedir?

Birincil hücreler, ilgili dokuların en saf temsilidir. Dokudan izole edilir ve ideal koşullara sahip bir kültür ortamında yerleşebilmeleri için işlenirler. Değiştirilmemiş, dokudan elde edildikleri için in vivo durumu daha yakından taklit ederler ve normal fizyolojiyi sergilerler. Bu nedenle, hücresel farmakoloji, toksikoloji ve fizyoloji (metabolizma, yaşlanma ve sinyal iletimi çalışmaları dahil) alanlarındaki araştırmalar için yararlı modeller olarak kullanılabilirler. Birincil hücrelerin, sürekli hücre hatlarına kıyasla kültürlenmesi ve sürdürülmesinin daha zor olduğunu unutmayın; çünkü ömürleri daha kısadır ve belirli sayıda hücre bölünmesinden sonra bölünmeyi durdururlar (ya da yaşlanırlar). Hücre sinyal yolakları üzerine yapılan çalışmalar, donörlerden elde edilen birincil hücrelerin doğasında bulunan değişkenlik ve alt kültür uygulamaları nedeniyle karmaşıktır. Sinyal çalışmalarına başlamadan önce, araştırmacılar genellikle hücrelerin yaygın olarak kullanılan uyaranlara yanıt verip vermediğini belirlemek için bir tarama yaparlar. Zaman ve para kaybını önlemek için, birincil hücreler taranmadan önce başlıca sinyal yolaklarını aktive etmek üzere uyarılabilir.

Neden insan birincil hücreleri kullanılır?

Ölümsüzleştirilmiş hücre hatları, hücre analizi olarak yaygın olarak kullanılmaktadır. Ancak bilim insanları, hücre hatlarından kaynaklanan biyolojik değişikliklerin, bunların fizyolojik önemini araştırırken zararlı olabileceğini kabul etmiştir. İnsan birincil hücrelerinin kullanımı, hücre kültürleri yoluyla elde edilen verilerin fizyolojik değerini artırır ve bu hücreler, biyolojik süreçleri, hastalık seyrini ve ilaç geliştirmeyi incelemek açısından giderek daha önemli kabul edilmektedir.

İnsan birincil hücreleri, hücreler arası ve hücre içi iletişim, gelişim biyolojisi ile kanser, Parkinson hastalığı ve diyabetin altında yatan mekanizmaların yanı sıra diğer birçok preklinik ve araştırmacı biyolojik araştırma alanındaki in vitro çalışmalarda yaygın olarak kullanılmaktadır. Araştırmacılar, doku fonksiyonlarını incelemek için uzun süredir ölümsüzleştirilmiş hücre hatlarını kullanmaktadır; ancak, belirgin mutasyonlar ve kromozomal anormallikler içeren hücre hatları, normal hücreler ve hastalığın erken aşamalarındaki gelişimi için iyi birer yedek olmayabilir. Artık, belirli bir doku hücre tipinin daha doğru bir modeli, o dokudan izole edilen ve birincil hücre kültür ortamları ile takviyelerde muhafaza edilen insan birincil hücreleri kullanılarak elde edilebilir.

Birincil hücre kültürü nedir?

Ölümsüzleştirilmiş hücre hatları kullanmak yerine, birincil hücre kültürü, hücrelerin vücut dışındaki çok hücreli bir organizmadan doğrudan yetiştirilmesini içerir. Birincil hücre kültürlerinin, hücre hatlarına kıyasla in vivo dokuları daha iyi temsil ettiği gerçeği, Birleşik Krallık gibi bazı ülkelerde yasal olarak kabul görmektedir. Bununla birlikte, birincil hücrelerin büyümesi için uygun substrat ve besin maddelerine ihtiyaçları vardır ve belirli sayıda bölünmeden sonra, bölünmeyi kalıcı olarak durdurmalarına neden olan bir yaşlanma fenotipi geliştirirler. Bu iki faktör, hücre hatlarının oluşturulmasına neden olmaktadır. Hem doğal olarak ölümsüzleştirilmiş birincil hücreler (örn. HeLa hücreleri) hem de yapay olarak ölümsüzleştirilmiş birincil hücreler (örn. HEK hücreleri), hücre kültüründe süresiz olarak yetiştirilebilir.

Doku türlerine göre insan birincil hücreleri

Epitel hücreleri, fibroblastlar, keratinositler, melanositler, endotel hücreleri, kas hücreleri, bağışıklık hücreleri ve mezenkimal kök hücreler gibi kök hücreler, bilimsel çalışmalarda en yaygın olarak kullanılan insan birincil hücreleri arasındadır. Başlangıçta, kültürler heterojendir (dokuda bulunan hücre tiplerinin bir karışımını temsil eder) ve in vitro ortamda yalnızca belirli bir süre canlı tutulabilirler. Dönüşüm, insan birincil hücrelerinin sınırsız alt kültürler için manipüle edilmesini sağlayan bir in vitro süreçtir. Dönüşüm doğal olarak gerçekleşebilir veya kimyasallar ya da virüsler tarafından tetiklenebilir. Genetik dönüşümden geçen bir birincil kültür, yeterli besin ve alan sağlandığında, ölümsüzleştirilmiş bir ikincil hücre hattına sonsuza kadar bölünebilir.

Endotel hücreleri

Kanser tedavisi, yara iyileşmesi, hücre sinyalleşmesi araştırmaları, yüksek verimli ve yüksek içerikli tarama ile toksikoloji taraması, birincil endotel hücrelerinin araştırma aracı olarak kullanılmasından fayda sağlayabilecek alanlardan sadece birkaçıdır.

Keratinositler

Yetişkin insan derisinin epidermisinden veya yenidoğan sünnet derisinden elde edilen keratinositler, sedef hastalığı ve kanser gibi cilt hastalıklarının araştırılmasında çok önemli bir rol oynar.

Epitel hücreleri

Kanser çalışmalarından toksikolojik araştırmalara kadar, birincil epitel hücreleri vücudun doğal savunma mekanizmalarını modellemek için paha biçilmez kaynaklar olduklarını kanıtlamıştır.

Fibroblastlar

Pluripotent kök (iPS) hücrelerinin indüksiyonu ve yara iyileşmesinin incelenmesi, birincil fibroblastların sayısız kullanım alanından sadece birkaçıdır.

Bağışıklık hücreleri

Kısaca PBMC olarak adlandırılan periferik kan mononükleer hücreleri, yuvarlak hücre çekirdeğine sahip kan mononükleer hücreleridir. Bunlar, bağışıklık tepkisi sürecinde önemli işlevler üstlenen lenfositler ve monositlerden oluşur. Periferik kan mononükleer hücreleri, enfeksiyonların teşhisinde veya olası aşı korumasının saptanmasında sıklıkla kullanılır. T hücrelerinin aracılık ettiği hücresel bağışıklık tepkisi hakkında bilgi edinmek genellikle çok önemlidir.

Melanositler

Melanin pigmentini üreten özel cilt hücreleri olan melanositler, yara iyileşmesi, toksisite, melanom, ultraviyole (UV) radyasyona karşı dermal tepki, cilt hastalıkları ve kozmetik gibi konularda yapılan araştırmalar için yararlı modeller olarak kullanılır.

Kök Hücreler

Kök hücreler, çok çeşitli hücre tiplerine farklılaşabilme potansiyeline sahiptir. Farklılaşma yetenekleri sayesinde, insan dokusu ve sağlık durumlarının modellenmesi için yeni fırsatlar sunarlar.

Mezenkimal kök hücreler

MSC olarak da bilinen mezenkimal kök hücreler, kemik iliği, yağ (adipoz doku), göbek kordonu dokusu (Wharton jeli) ve amniyotik sıvı (fetüsü çevreleyen sıvı) gibi farklı insan kaynaklarından elde edilebilir ve in vitro olarak çoğaltılabilir. Bu yetişkin stromal kök hücreler, çok çeşitli hücre tiplerine dönüşme yeteneğine sahiptir. Bu hücre tiplerinden bazıları arasında kemik hücreleri, kıkırdak hücreleri, kas hücreleri, sinir hücreleri, deri hücreleri ve kornea hücreleri bulunur.

Düz kas hücreleri

İçi boş organlarda, birincil düz kas hücreleri (SMC'ler) iç yüzeyi kaplar ve kasılmayı sağlar. Kanser ve diğer hastalıkların yanı sıra, SMC'ler hipertansiyon fibrozunu modellemek için de kullanılabilir.

Birincil hücreler ve hücre hatları

Dönüştürülmüş kanser hücre hatlarında olduğu gibi kendiliğinden mutasyon yoluyla ya da kanser genlerinin yapay olarak üretilmesinde olduğu gibi kasıtlı değişiklik yoluyla, sürekli hücre hatları sonsuza kadar çoğalma potansiyeli kazanmıştır (ölümsüzleştirilmiştir). Kural olarak, sürekli hücre hatları birincil hücrelere kıyasla daha güvenilirdir ve kullanımı daha kolaydır. Sürekli hücre hatları sınırsız olarak çoğalabilir ve temel verilere hızlı erişim sağlar. Sürekli hücre hatlarının kullanımında bazı sınırlamalar vardır; bunlar arasında, genetik olarak modifiye edilmiş/dönüştürülmüş olmaları (bu durum fizyolojik özellikleri değiştirebilir ve in vivo koşullara uymayabilir) ve zaman içinde önemli sayıda pasajdan geçtikten sonra bu özelliklerin daha da değişebilmesi sayılabilir.

Birincil hücre kültüründeki gelişmeler

Birincil hücreler, çalışılması zor olmalarıyla ünlüdür. Ancak birincil hücre kültüründeki gelişmeler, tamamen optimize edilmiş protokollere sahip ticari birincil hücrelerin mevcudiyeti ve daha az çaba gerektiren yeni analiz teknikleri sayesinde bu süreç her zamankinden daha kolay hale gelmektedir.

İki boyutlu hücre kültüründen üç boyutlu hücre kültürüne geçiş, bu alanda önemli bir dönüm noktası olarak kabul edilmektedir. Dokuya özgü mimari, hücre-hücre etkileşimleri ve mekanik/biyokimyasal sinyalleşme, 2D kültürde zayıflayabilir. Dolayısıyla, bu kültürlerin biyolojik değeri sınırlıdır.

Öte yandan, üç boyutlu hücre kültürü, hücrelerin çoğalmasına ve üç boyutlu bir hücre dışı iskeletle etkileşime girmesine olanak tanır. Bu, hücrelerin birbirleriyle ve hücre dışı matriksle etkileşime girmesini sağlayarak üç boyutlu kültürleri fizyolojik açıdan daha anlamlı hale getirir. Bu yöntemin in vivo tepkileri tahmin etmedeki doğruluğu, onu ilaç keşfi ve geliştirme gibi alanlarda devrim niteliğinde bir yöntem haline getirmiştir. Bu nedenle, hastalardan elde edilen organoidler ve çip üzerinde organlar gibi en son teknolojiler, ilaç taraması ve geliştirme için son derece bağlamsal modeller sunmaktadır.

Birincil hücre üretimi, birincil kültürde bir darboğaz oluşturmaktadır. Bunu aşmak için genellikle daha büyük hacimde doku gerekir ve bunu elde etmek zor olabilir. Ancak, analitik hassasiyetin artması bu konuda bir çözüm yolu sunmaktadır. Örneğin, sekanslama, western blot ve kütle sitometrisi gibi tek hücre teknolojilerinin kullanılmasıyla büyük miktarlarda birincil hücre kültürü oluşturma ihtiyacı azalır.

Birincil hücre kültürü için umut verici beklentiler

Birincil hücre kültürünün genel zorlukları, teknolojik gelişmeler sayesinde hafifletilmektedir. Buna bağlı olarak, bu yöntem hücresel ve moleküler biyoloji çalışmaları ve uygulamalarında altın standart olarak diğer yöntemlerin yerini hızla almaktadır. Aşı üretimi, organ nakli, kök hücre tedavileri, kanser araştırmaları ve daha pek çok alan, birincil hücre kültüründeki sürekli gelişmelerden büyük fayda sağlayacaktır.

Birincil hücre kültürü için ipuçları ve püf noktaları

Hücre çoğaltma ihtiyaçları

Birincil hücrelerin kültürlenmesi için en yaygın iki yöntem, süspansiyon halinde veya bir yüzey üzerinde (2D) kültürlenmesidir. Bazı hücreler, hiçbir yüzeye yapışmadan kan dolaşımında serbestçe yüzebilir (örneğin, periferik kandan elde edilenler). Farklı hücre hatları, 2D büyüme koşullarında ulaşılamayacak yoğunluklara ulaşabildikleri süspansiyon kültürlerinde gelişecek şekilde tasarlanmıştır. İn vitro olarak büyümek için bir yüzeye tutunmaya ihtiyaç duyan birincil hücrelere yapışkan hücreler denir ve bunlar arasında katı dokularda bulunan hücreler de yer alır. Yapışma özelliklerini iyileştirmek ve büyüme ile farklılaşma için gerekli diğer sinyalleri sağlamak amacıyla, bu hücreler genellikle düz, kaplamasız plastik bir kapta, ancak bazen de bir mikro-taşıyıcı üzerinde kültürlenir. Bu ikinci seçenek, hücre dışı matris proteinleri (kollajen ve laminin gibi) ile kaplanabilir. Hücre kültüründe kullanılan besiyeri, uygun büyüme faktörleri ve sitokinlerle takviye edilmiş bir temel besiyerinden oluşur. Hücre inkübatörü, hücreleri belirli bir sıcaklık ve gaz karışımında (memeli hücreleri için tipik olarak 37 °C, %5 CO₂) yetiştirmek ve muhafaza etmek için kullanılan özel bir laboratuvar inkübatörü türüdür. Kültürlenen hücre türüne bağlı olarak, optimal koşullar çok farklı olabilir. Yetiştirilen hücre türlerine bağlı olarak, optimal büyüme ortamı, pH, glikoz konsantrasyonu, büyüme faktörleri ve diğer besin maddelerinin varlığı dahil olmak üzere, bunlarla sınırlı olmamak üzere, benzersiz bir faktör kombinasyonuna sahip olacaktır.

Büyüme ortamındaki antibiyotikler, konak dokusundan kaynaklanan kontaminasyonu önlemek için birincil kültürün kurulması sırasında hayati öneme sahiptir. Bazı antibiyotik rejimleri, gentamisin, penisilin, streptomisin ve amfoterisin B'nin bir kombinasyonunu içerir. Ancak, bazı reaktiflerin (amfoterisin B gibi) uzun vadede hücreler için toksik olabileceği için, antibiyotiklerin uzun süreli kullanımı tavsiye edilmez.

Çoğu birincil hücre, yaşlanma sürecinden geçer ve belirli sayıda popülasyon ikiye katlanmasından sonra bölünmeyi durdurur; bu nedenle, izolasyon sonrasında bu hücreleri hayatta tutmak hayati önem taşır. Uzun vadeli hücre canlılığı, uzman hücre kültürü teknikleri ve ideal kültür koşullarını (doğru besiyeri, doğru sıcaklık, doğru gaz karışımı, doğru pH, doğru büyüme faktörleri konsantrasyonu, besin maddelerinin varlığı ve glikozun varlığı dahil) gerektirir. Besiyerini takviye etmek için kullanılan büyüme faktörlerinin çoğu hayvan kanından elde edildiğinden (kandan elde edilen bileşenler kontaminasyon riski taşır), bunların kullanımının en aza indirilmesi veya tamamen kaçınılması önerilir. Aseptik teknik kullanılması da önemlidir.

Alt kültür ve bakım

İzolasyon halindeki hücreler kültür kabının yüzeyine yapıştığında, bu durum bakım aşamasının başlangıcını işaret eder. Yapışma genellikle kültürün başlatılmasından 24 saat sonra gerçekleşir. Hücreler, belirli bir konfluans yüzdesine ulaştıklarında ve aktif olarak çoğaldıklarında alt kültüre alınmalıdır. Konfluans sonrası hücreler farklılaşmaya uğrayabilir ve pasajdan sonra daha yavaş çoğalma gösterebilir; bu nedenle, birincil hücre kültürlerini %100 konfluansa ulaşmadan alt kültüre almak en iyisidir.

Taze besiyerinde alt kültür oluşturmak, tutunmaya bağlı hücrelerin üstel büyümesini sürdürür. Tek tabakalı hücrelerin alt kültüre alınması, hücreler arası ve hücre içi hücre yüzeyi etkileşimlerini bozar. Tek tabakalı hücrelerden veya dokulardan yapışık birincil hücreleri çıkarmak için tripsin/EDTA gibi düşük konsantrasyonlu proteolitik enzimler kullanılır. Ayrıştırıldıktan ve tek hücreli bir çözeltiye seyreltildikten sonra, hücreler sayılır ve yeniden yapışıp çoğalmaları için taze kültür kaplarına aktarılır.

Kriyoprezervasyon ve geri kazanım

Kriyoprezervasyon, canlı hücreleri düşük sıcaklıklarda dondurarak korur. İnsan birincil hücrelerinin kriyoprezervasyonu ve çözülmesi, depolama ve kullanım sırasında hücre ölümünü ve hasarını önler. İnsan birincil hücreleri, DMSO veya gliserol kullanılarak (doğru sıcaklıkta ve kontrollü bir donma hızıyla) kriyokorunur. Buz kristali oluşumunu önlemek için dondurma işlemi, her dakika -1 °C'lik bir artışla kademeli olarak gerçekleştirilmelidir. Uzun süreli saklama için sıvı azot (-196 °C) veya -130 °C'nin altındaki sıcaklıklar gereklidir.

Kriyokorunmuş hücreleri çözdürmek için donmuş hücreleri yaklaşık 1 ila 2 dakika boyunca 37 °C'lik bir su banyosuna daldırmak yeterlidir. İnsan birincil hücreleri, dondurucudan çıkarıldıktan sonra santrifüjlenmemelidir (çünkü kriyokorunmadan geri kazanım sırasında hasara karşı son derece hassastırlar). Çözüldükten hemen sonra hücrelerin plakaya ekilmesi uygundur ve bu işlem, ekimden sonraki ilk 24 saat boyunca kültürlerde hücrelerin yapışmasını destekler. 1 Kriyoprezervasyonlu birincil hücreler yapıştıktan sonra, kullanılmış besiyeri uzaklaştırılmalıdır (çünkü DMSO birincil hücrelere zararlıdır ve çözülme sonrası canlılıkta düşüşe neden olabilir).