İnsan Primer Hücreleri

İnsan birincil hücreleri nedir?

Birincil hücreler kendi dokularının en saf temsilidir. Dokudan izole edilirler ve ideal koşullara sahip bir kültür ortamında yerleşik hale gelebilmeleri için işlenirler. Değiştirilmek yerine dokudan türetildikleri için in vivo durumu daha yakından taklit ederler ve normal fizyoloji sergilerler. Bu nedenle, hücresel farmakoloji, toksikoloji ve fizyoloji (metabolizma, yaşlanma ve sinyal iletimi çalışmaları dahil) araştırmaları için yararlı modeller olarak hizmet edebilirler. Birincil hücrelerin kültürünün ve bakımının sürekli bir hücre hattından daha zor olduğunu unutmayın çünkü daha kısa bir ömre sahiptirler ve belirli sayıda hücre bölünmesinden sonra bölünmeyi (veya yaşlanmayı) durduracaklardır. Hücre sinyal yolaklarına ilişkin çalışmalar, donörlerden ve alt kültür uygulamaları yoluyla elde edilen birincil hücrelerin doğal değişkenliği nedeniyle karmaşıktır. Sinyalizasyon çalışmalarına başlamadan önce, araştırmacılar genellikle hücrelerin yaygın olarak kullanılan uyaranlara yanıt verip vermediğini belirlemek için bir tarama yaparlar. Zaman ve para israfını önlemek için, birincil hücreler taranmadan önce ana sinyal yollarını aktive etmek için uyarılabilir.

Neden insan birincil hücreleri kullanılmalı?

Ölümsüzleştirilmiş hücre hatları yaygın olarak bir hücre deneyi olarak kullanılır. Her ne kadar bilim insanları hücre hatlarından kaynaklanan biyolojik değişikliklerin fizyolojik önemlerinin incelenmesinde zararlı olabileceğini kabul etmiş olsalar da. İnsan birincil hücrelerinin kullanımı, hücre kültürleri yoluyla elde edilen verilerin fizyolojik değerini artırır ve biyolojik süreçleri, hastalık ilerlemesini ve ilaç geliştirmeyi incelemek için giderek daha önemli olarak kabul edilmektedir.

İnsan birincil hücreleri, diğer birçok preklinik ve araştırmacı biyolojik araştırma alanının yanı sıra, hücreler arası ve hücre içi iletişim, gelişim biyolojisi ve kanser, Parkinson hastalığı ve diyabetin altında yatan mekanizmaların in vitro çalışmalarında yaygın olarak kullanılmaktadır. Araştırmacılar doku fonksiyonlarını incelemek için uzun süredir ölümsüzleştirilmiş hücre dizileri kullanmaktadır; ancak bariz mutasyonlara ve kromozomal anormalliklere sahip hücre dizileri normal hücreler ve hastalığın erken evrelerindeki gelişimi için iyi vekiller olmayabilir. Belirli bir doku hücre tipinin daha doğru bir modeli artık o dokudan izole edilen ve birincil hücre kültürü ortamında ve takviyelerinde muhafaza edilen insan birincil hücreleri kullanılarak elde edilebilir.

Birincil hücre kültürü nedir?

Ölümsüzleştirilmiş hücre hatları kullanmak yerine, birincil hücre kültürü doğrudan vücut dışındaki çok hücreli bir organizmadan hücre yetiştirmeyi içerir. Birleşik Krallık gibi bazı ülkelerde, birincil hücre kültürlerinin in vivo dokuları hücre dizilerinden daha iyi temsil ettiği yasal olarak kabul edilmektedir. Bununla birlikte, birincil hücreler büyümek için doğru substrat ve besin maddelerine ihtiyaç duyarlar ve belirli sayıda bölünmeden sonra, bölünmeyi kalıcı olarak durdurmalarına neden olan bir yaşlanma fenotipi geliştirirler. Bu iki faktör hücre hatlarının oluşturulmasını motive eder. Hem doğal olarak ölümsüzleştirilmiş birincil hücreler (örneğin HeLa hücreleri) hem de yapay olarak ölümsüzleştirilmiş birincil hücreler (örneğin HEK hücreleri) hücre kültüründe süresiz olarak kültürlenebilir.

Doku türlerine göre insan birincil hücreleri

Epitel hücreleri, fibroblastlar, keratinositler, melanositler, endotel hücreleri, kas hücreleri, bağışıklık hücreleri ve mezenkimal kök hücreler gibi kök hücreler bilimsel çalışmalarda en yaygın kullanılan insan birincil hücreleri arasındadır. Öncelikle, kültürler heterojendir (dokuda bulunan hücre tiplerinin bir karışımını temsil eder) ve sadece belirli bir süre boyunca in vitro ortamda canlı tutulabilirler. Transformasyon, insan birincil hücrelerinin sınırsız alt kültürler için manipüle edilmesini sağlayan bir in vitro süreçtir. Transformasyon doğal olarak gerçekleşebilir ya da kimyasallar veya virüsler tarafından indüklenebilir. Genetik dönüşüm geçirdikten sonra birincil kültür, yeterli besin ve alan sağlandığında süresiz olarak bölünerek ölümsüzleştirilmiş ikincil bir hücre hattına dönüşebilir.

Endotel hücreleri

Kanser tedavisi, yara iyileşmesi, hücre sinyali araştırmaları, yüksek verimli ve yüksek içerikli tarama ve toksikoloji taraması, birincil endotel hücrelerinin bir araştırma aracı olarak kullanılmasından yararlanabilecek alanlardan sadece birkaçıdır.

Keratinositler

Yetişkin insan derisi ya da yenidoğan sünnet derisinin epidermisinden elde edilen keratinositler, sedef hastalığı ve kanser gibi deri hastalıklarının incelenmesinde önemli bir rol oynamaktadır.

Epitel hücreleri

Kanser çalışmalarından toksikolojik araştırmalara kadar, birincil epitel hücrelerinin vücudun doğal savunmasını modellemek için çok değerli kaynaklar olduğu kanıtlanmıştır.

Fibroblastlar

Pluripotent kök (iPS) hücrelerin indüklenmesi ve yara iyileşmesinin incelenmesi, birincil fibroblastların birçok kullanım alanından sadece birkaçıdır.

Bağışıklık hücreleri

Periferik kan mononükleer hücreleri, kısaca PBMC, yuvarlak hücre çekirdeğine sahip tek çekirdekli kan hücreleridir. Temel olarak lenfositleri ve monositleri içerirler ve bunlar bağışıklık tepkisi sırasında önemli işlevler üstlenirler. Periferik kan mononükleer hücreleri genellikle enfeksiyonları teşhis etmek veya olası aşı korumasını tespit etmek için kullanılır. T hücrelerinin aracılık ettiği hücresel bağışıklık yanıtının anlaşılması genellikle çok önemlidir.

Melanositler

Melanin pigmentini üreten özelleşmiş cilt hücreleri olan melanositler, yara iyileşmesi, toksisite, melanom, ultraviyole (UV) radyasyona karşı dermal tepki, cilt hastalıkları ve kozmetik gibi konulardaki araştırmalar için model olarak faydalıdır.

Kök hücreler

Kök hücreler çok çeşitli hücre tiplerine farklılaşma potansiyeline sahiptir. Farklılaşma yetenekleri nedeniyle, insan dokusu ve sağlık koşullarının modellenmesi için yeni fırsatlar sunarlar.

Mezenkimal kök hücreler

MSC'ler olarak da bilinen mezenkimal kök hücreler kemik iliği, yağ (adipoz doku), göbek kordonu dokusu (Wharton's Jelly) ve amniyotik sıvı (fetüsü çevreleyen sıvı) gibi farklı insan kaynaklarından elde edilebilir ve in vitro olarak genişletilebilir. Bu yetişkin stromal kök hücreler çok çeşitli hücre tiplerine dönüşme yeteneğine sahiptir. Bu hücre tiplerinden bazıları kemik hücreleri, kıkırdak hücreleri, kas hücreleri, sinir hücreleri, deri hücreleri ve kornea hücreleridir.

Düz kas hücreleri

İçi boş organlarda, birincil düz kas hücreleri (SMC'ler) iç kısmı kaplar ve kontraktiliteye aracılık eder. Kanser ve diğer hastalıklara ek olarak, SMC'ler hipertansiyon fibrozunu modellemek için kullanılabilir.

Birincil hücreler ve hücre hatları

Ya dönüştürülmüş kanser hücre hatlarında olduğu gibi kendiliğinden mutasyon yoluyla ya da kanser genlerinin yapay üretiminde olduğu gibi kasıtlı değişiklik yoluyla, sürekli hücre hatları sonsuza kadar çoğalma potansiyeli kazanmıştır (ölümsüzleştirilmiştir). Kural olarak, sürekli hücre hatları birincil hücrelere göre daha güvenilir ve kullanımı daha kolaydır. Süresiz olarak genişleyebilirler ve temel verilere hızlı erişim sağlarlar. Sürekli hücre hatlarının kullanımının, fizyolojik özellikleri değiştirebilecek ve in vivo durumla eşleşmeyecek şekilde genetik olarak değiştirilmiş/transforme edilmiş olmaları ve bunun önemli pasajlama ile zaman içinde daha da değişebileceği gerçeği de dahil olmak üzere bazı sınırlamaları vardır.

Birincil hücre kültüründeki gelişmeler

Birincil hücreler, birlikte çalışmanın zor olmasıyla kötü bir üne sahiptir. Ancak birincil hücre kültüründeki gelişmeler, tamamen optimize edilmiş protokollere sahip ticari birincil hücrelerin mevcudiyeti ve daha az girdi gerektiren yeni analiz teknikleri sayesinde bu süreç her zamankinden daha kolay hale gelmektedir.

İki boyutludan üç boyutlu hücre kültürüne geçiş, bu alanda önemli bir dönüm noktası olarak kabul edilmektedir. Dokuya özgü mimari, hücre-hücre etkileşimleri ve mekanik/biyokimyasal sinyalizasyon 2 boyutlu kültürde zayıflatılabilir. Dolayısıyla, bu kültürlerin biyolojik değeri için bir tavan vardır.

Öte yandan, 3D hücre kültürü hücrelerin genişlemesini ve 3D hücre dışı bir çerçeveyle etkileşime girmesini sağlar. Bu da hücrelerin birbirleriyle ve hücre dışı matrisle etkileşime girmesini sağlayarak 3D kültürleri fizyolojik açıdan daha uygun hale getirir. Bu yöntemin in vivo tepkileri tahmin etmedeki doğruluğu, ilaç keşfi ve geliştirilmesi gibi alanlarda devrim niteliğinde olmasını sağlamıştır. Bu nedenle, hastalardan elde edilen organoidler ve çip üzerinde organlar gibi en son teknolojiler, ilaç taraması ve geliştirilmesi için son derece bağlamsal modeller sağlar.

Birincil hücre üretimi, birincil kültürde bir darboğazdır. Bunun üstesinden gelmek için genellikle daha büyük hacimde doku gereklidir ve bu da elde edilmesi zor olabilir. Ancak, gelişmiş analitik hassasiyet ileriye dönük bir yol sağlamaktadır. Örneğin, sıralama, western blot ve kütle sitometrisini içeren tek hücre teknolojisi kullanılarak büyük miktarlarda birincil hücre kültürü yapma ihtiyacı azaltılır.

Birincil hücre kültürü için umut verici beklentiler

Birincil hücre kültürünün genel zorlukları teknolojik ilerlemelerle hafifletilmektedir. Buna karşılık, bu yöntem hücresel ve moleküler biyoloji çalışma ve uygulamalarında altın standart olarak hızla diğerlerinin yerini almaktadır. Aşı üretimi, organ replasmanı, kök hücre tedavileri, kanser araştırmaları ve çok daha fazlası birincil hücre kültüründe devam eden ilerlemelerden büyük fayda sağlayacaktır.

Birincil hücre kültürü ipuçları ve püf noktaları

Hücre genişlemesinin ihtiyaçları

Birincil hücreleri yetiştirmek için en yaygın iki yöntem süspansiyon halinde veya bir yüzey üzerinde (2D) yetiştirmektir. Bazı hücreler bir yüzeye yapışmadan kan dolaşımında serbestçe yüzebilir (örneğin periferik kandan elde edilenler). Farklı hücre serileri, 2D büyüme koşullarında ulaşılamayan yoğunluklara ulaşabildikleri süspansiyon kültürlerinde gelişmek üzere tasarlanmıştır. İn vitro büyümek için ankraj ihtiyacı duyan birincil hücreler yapışık hücreler olarak adlandırılır ve katı dokularda bulunanları içerir. Yapışma özelliklerini iyileştirmek ve büyüme ve farklılaşma için gerekli diğer sinyalleri sağlamak için bu hücreler tipik olarak düz, kaplanmamış plastik bir kapta, ancak bazen bir mikro taşıyıcıda kültürlenir. Bu ikinci seçenek hücre dışı matris proteinleriyle (kolajen ve laminin gibi) kaplanmış olabilir. Hücre kültüründe kullanılan ortam, uygun büyüme faktörleri ve sitokinlerle desteklenmiş temel bir ortamdan oluşur. Hücre inkübatörü, hücreleri belirli bir sıcaklık ve gaz karışımında (memeli hücreleri için tipik olarak 37 °C, %5 CO2) yetiştirmek ve muhafaza etmek için kullanılan özel bir laboratuvar inkübatörü türüdür. Kültürü yapılan hücrenin türüne bağlı olarak, optimum koşullar çok farklı olabilir. Yetiştirilen hücre türlerine bağlı olarak, optimum büyüme ortamı pH, glikoz konsantrasyonu, büyüme faktörleri ve diğer besin maddelerinin varlığı dahil ancak bunlarla sınırlı olmamak üzere benzersiz bir faktör kombinasyonuna sahip olacaktır.

Büyüme ortamındaki antibiyotikler, konak dokudan kontaminasyonu önlemek için birincil kültür oluşumu sırasında çok önemlidir. Bazı antibiyotik rejimleri gentamisin, penisilin, streptomisin ve amfoterisin B kombinasyonunu içerir. Ancak antibiyotiklerin uzun süre kullanılması tavsiye edilmez çünkü bazı reaktifler (amfoterisin B gibi) uzun vadede hücreler için toksik olabilir.

Çoğu birincil hücre yaşlanma sürecine girer ve belirli sayıda nüfus ikiye katlandıktan sonra bölünmeyi durdurur, bu da izolasyondan sonra onları canlı tutmayı çok önemli hale getirir. Uzun vadeli hücre canlılığı, uzman hücre kültürü teknikleri ve ideal kültür koşulları (doğru ortam, doğru sıcaklık, doğru gaz karışımı, doğru pH, doğru büyüme faktörü konsantrasyonu, besinlerin varlığı ve glikoz varlığı dahil) gerektirir. Ortamı desteklemek için kullanılan büyüme faktörlerinin çoğu hayvan kanından elde edildiğinden (kan kaynaklı bileşenler kontaminasyon potansiyeline sahiptir), bunların kullanımının en aza indirilmesi veya tamamen önlenmesi önerilir. Aseptik bir teknik kullanmak da önemlidir.

Alt kültür ve bakım

İzolasyondaki hücreler kültür kabının yüzeyine yapıştığında, bu bakım aşamasının başlangıcını işaret eder. Yapışma tipik olarak kültürün başlatılmasından 24 saat sonra gerçekleşir. Hücreler belirli bir konfluens yüzdesine ulaştıklarında ve aktif olarak çoğaldıklarında alt kültüre alınmalıdır. Konfluent sonrası hücreler farklılaşmaya uğrayabileceğinden ve pasajdan sonra daha yavaş çoğalma gösterebileceğinden, birincil hücre kültürlerini %100 konfluense ulaşmadan önce alt kültüre almak en iyisidir.

Taze ortamda alt kültürleme, ankraj bağımlı hücrelerin üstel büyümesini sürdürür. Tek tabakaların alt kültüre alınması hücre içi ve hücreler arası yüzey etkileşimlerini bozar. Tripsin/EDTA gibi düşük konsantrasyonlarda proteolitik enzimler, tek tabakalardan veya dokulardan yapışık birincil hücreleri çıkarmak için kullanılır. Hücreler ayrıştırılıp tek hücreli bir çözelti halinde seyreltildikten sonra sayılır ve yeniden bağlanıp çoğalmaları için taze kültür kaplarına aktarılır.

Kriyoprezervasyon ve geri kazanım

Kriyoprezervasyon, canlı hücreleri düşük sıcaklıklarda dondurarak korur. İnsan birincil hücrelerinin kriyoprezervasyonu ve çözdürülmesi, depolama ve kullanım sırasında hücre ölümünü ve hasarını önler. İnsan birincil hücreleri DMSO veya gliserol kullanılarak (doğru sıcaklıkta ve kontrollü bir dondurma hızıyla) kriyoprotekte edilir. Buz kristali oluşumunu önlemek için dondurma işlemi her dakika -1 °C olacak şekilde aşamalı olarak gerçekleştirilmelidir. Uzun süreli saklama için sıvı nitrojen (-196 °C) veya -130 °C'nin altındaki sıcaklıklar gerekir.

Dondurulmuş hücreleri çözdürmek için 37 °C'lik su banyosunda yaklaşık 1-2 dakika bekletmek yeterlidir. İnsan birincil hücreleri dondurucudan çözüldükten sonra santrifüjlenmemelidir (kriyoprezervasyondan kurtarma sırasında hasara karşı son derece hassas olduklarından). Çözüldükten hemen sonra hücreleri kaplamak için uygundur ve kaplamadan sonraki ilk 24 saat boyunca kültürlerde tutunmayı teşvik eder. 1 Kriyoprezerve edilmiş birincil hücreler bağlandıktan sonra, kullanılmış besiyeri çıkarılmalıdır (DMSO birincil hücreler için zararlı olduğundan ve çözülme sonrası canlılıkta düşüşe neden olabileceğinden).