Publicerad: 2023 | Senast granskad: maj 2026

Tekniker för dissociation av cellkulturer

Dissociation av cellkulturer är ett viktigt steg i underhållet av cellkulturer. Det innebär att celler lossas från sin odlingsyta för att möjliggöra subkultivering eller skörd. I detta avsnitt beskrivs två huvudsakliga metoder: användning av enzymfria dissociationsbuffertar och användning av enzymatiska reagenser.

Användning av enzymfria celldissociationsbuffertar

Denna metod är skonsam och bevarar cellernas integritet utan användning av enzymer:

1. Förberedelse
   • Se till att alla reagenser är uppvärmda till 37 °C före användning för att undvika chock för cellerna.
2. Avlägsnande av odlingsmedium:
   • Kasta det gamla odlingsmediet från odlingskärlet.
3. Sköljning
   • Skölj cellmonolagren med 5 ml kalcium- och magnesiumfritt PBS per T75-kolv eller 100 mm-skål.
   • Skaka försiktigt kärlet i 30 till 60 sekunder vid rumstemperatur.
   • Sug upp och kasta sköljvätskan.
   • Upprepa detta sköljningssteg en gång till.
4. Dissociation
   • Tillsätt cirka 5 ml enzymfri celldissociationsbuffert till kärlet.
   • Skaka försiktigt vid rumstemperatur i 1 till 2 minuter och kontrollera dissociationen under ett mikroskop.
   • Knacka kolven eller skålen mot handen för att lossa cellerna om det behövs.
   • Om cellerna sitter fast, låt dem stå i rumstemperatur i ytterligare 2 till 5 minuter och knacka igen vid behov, med mer dissociationsbuffert.
   • När cellerna har lossnat, tillsätt minst 5 ml komplett odlingsmedium för att neutralisera dissociationsbufferten och resuspendera cellerna.
5. Kontroll av livskraft
   • Övervaka cellernas livskraft under subkultivering och se till att den förblir över 90 %.

Användning av andra reagenser för dissociation

Denna metod möjliggör användning av olika dissociationsreagenser:

1. Borttagning av använt medium
   • Kasta det gamla mediet från odlingskärlet.
2. Tvättning av celler
   • Tvätta cellerna med en balanserad saltlösning fri från kalcium och magnesium, eller använd EDTA.
   • Tillsätt tvättlösningen försiktigt på sidan mittemot cellerna och skaka kärlet i 1 till 2 minuter innan du häller bort tvättvätskan.
3. Dissociation
   • Tillsätt 2 till 3 ml av den valda dissociationslösningen per 25 cm² odlingsyta och se till att cellskiktet täcks helt.
   • Inkubera kärlet vid 37 °C och skaka försiktigt. Dissociationen sker vanligtvis inom 5 till 15 minuter, beroende på cellinjen.
   • För svårlösta celler kan man påskynda processen genom att knacka lätt på kärlet.
   • Observera cellerna noggrant för att förhindra överexponering och potentiella skador.
4. Skörd av celler
   • När cellerna har lossnat helt, låt dem samlas på botten av kärlet genom att ställa det upprätt.
   • Tillsätt komplett odlingsmedium, sprid sedan ut och samla upp cellerna genom att pipettera över cellskiktet.
   • Räkna cellerna och fortsätt med subkultivering.

I båda metoderna är det viktigt att fastställa de optimala förhållandena för varje cellinje genom empirisk observation. Processen bör bevara cellernas livskraft, som rutinmässigt bör kontrolleras för att överstiga 90 % under subkultivering. Dessa procedurer utgör en grund som forskare kan anpassa utifrån de specifika kraven och egenskaperna hos sina cellinjer.

Översikt över tekniker för subkultivering av adherenta celler

Effektiv subkultivering av adherenta celler kräver att de lossas från odlingskärlet. Olika metoder används, var och en lämplig för olika celltyper och förhållanden. Vid val av dissociationsmetod är det avgörande att beakta cellinjen specifika behov och experimentets mål. Regelbunden övervakning av cellernas livskraft, med målet att den ska vara högre än 90 % vid subkultivering, är avgörande för kulturens fortsatta hälsa och produktivitet. Här följer en översikt över dessa procedurer: