Tekniker för dissociation av cellkulturer

Dissociation av cellkulturer är ett kritiskt steg i underhållet av cellkulturer. Det innebär att cellerna lossas från sin odlingsyta för att möjliggöra subkultur eller skörd. I detta avsnitt beskrivs två huvudmetoder: användning av enzymfria dissociationsbuffertar och användning av enzymatiska reagens.

1.användning av enzymfria celldissociationsbuffertar

Denna metod är skonsam och upprätthåller cellulär integritet utan användning av enzymer:

1. Förberedelse
   • Se till att alla reagenser värms upp till 37°C före användning för att undvika chock för cellerna.
2. Avlägsnande av tillväxtmedium
   • Kassera det gamla tillväxtmediet från odlingskärlet.
3. Sköljning
   • Skölj cellmonolayers med 5 ml kalcium- och magnesiumfri PBS per T75-kolv eller 100 mm-skål.
   • Vicka försiktigt på kärlet i 30-60 sekunder i rumstemperatur.
   • Aspirera och kassera sköljlösningen.
   • Upprepa detta sköljningssteg ytterligare en gång.
4. Dissociation
   • Tillsätt ca 5 ml enzymfri celldissociationsbuffert till kärlet.
   • Skaka försiktigt i rumstemperatur i 1 till 2 minuter och kontrollera dissociationen under mikroskop.
   • Knacka kolven eller skålen mot handen för att lossa cellerna om det behövs.
   • Om cellerna är vidhäftande, låt dem stå i rumstemperatur i ytterligare 2-5 minuter och knacka igen vid behov, med mer dissociationsbuffert.
   • När cellerna har lossnat, tillsätt minst 5 ml komplett tillväxtmedium för att neutralisera dissociationsbufferten och resuspendera cellerna.
5. Kontroll av viabilitet
   • Övervaka cellernas viabilitet under subkultureringen och se till att den förblir över 90 %.

2.användning av andra reagenser för dissociation

Denna metod gör det möjligt att använda olika dissociationsreagenser:

1. Borttagning av använt medium
   • Kassera det gamla mediet från odlingskärlet.
2. Tvättning av celler
   • Tvätta cellerna med en balanserad saltlösning som är fri från kalcium och magnesium, eller använd EDTA.
   • Tillsätt tvättlösningen försiktigt till sidan mittemot cellerna och skaka kärlet i 1 till 2 minuter innan du kasserar tvätten.
3. Dissociation
   • Applicera 2 till 3 ml av den valda dissociationslösningen per 25 cm² av tillväxtytan och se till att cellskiktet täcks.
   • Inkubera kärlet vid 37°C och skaka försiktigt. Dissociationen sker normalt inom 5 till 15 minuter, beroende på cellinjen.
   • För envisa celler kan man påskynda processen genom att knacka på kärlet.
   • Observera cellerna noga för att förhindra överexponering och potentiella skador.
4. Skörd av celler
   • När cellerna har lossnat helt kan du låta dem samlas i botten av kärlet genom att ställa det upprätt.
   • Tillsätt komplett media och skingra och samla sedan in cellerna genom att pipettera över cellagret.
   • Räkna och fortsätt med subkulturering.

I båda metoderna är det viktigt att fastställa de optimala förhållandena för varje cellinje genom empirisk observation. Processen ska bevara cellernas livskraft, som rutinmässigt ska kontrolleras så att den överstiger 90 % under subodlingen. Dessa förfaranden utgör en grund för forskare att anpassa utifrån de specifika kraven och egenskaperna hos sina cellinjer.

3.översikt över tekniker för subodling av adherenta celler

Effektiv subkultur av adherenta celler kräver att de lossnar från odlingskärlet. Det finns olika metoder som var och en lämpar sig för olika celltyper och förhållanden. När man väljer en dissociationsmetod är det viktigt att ta hänsyn till cellinjens specifika behov och målen med experimentet. Regelbunden övervakning av cellviabiliteten, med ett mål på över 90% vid tidpunkten för subkulturen, är avgörande för cellkulturens fortsatta hälsa och produktivitet. Här följer en översikt över dessa procedurer: