Omfattande guide till frysning av celler: Säkerställa viabilitet och sterilitet

Frysning av celler är en kritisk process inom cellkulturhantering, som säkerställer långsiktig lagring och bevarande av värdefulla cellinjer. Oavsett om man arbetar med mänskliga eller animaliska celler är det avgörande att följa exakta protokoll och upprätthålla strikta aseptiska tekniker för att uppnå framgångsrik kryopreservering.

Denna guide ger detaljerade instruktioner om nödvändiga material, reagenser och steg-för-steg-procedurer för att effektivt frysa celler samtidigt som deras livskraft och sterilitet bevaras. Genom att följa dessa riktlinjer kan forskare tryggt förvara och senare återuppliva cellkulturer med minimal förlust av cellernas livskraft, vilket bibehåller integriteten och tillförlitligheten hos deras experimentella resultat.

Till att börja med är det viktigt att skapa en steril arbetsmiljö. Korrekt aseptisk teknik spelar en avgörande roll när det gäller att förhindra kontaminering och säkerställa att odlingarna är sterila.

Aseptisk teknik

Följ aseptisk teknik under hela processen för att säkerställa att odlingarna är sterila.

Omfattande process för cellfrysning

Detta flödesschema ger en detaljerad visuell guide till de viktigaste stegen för korrekt frysning av celler. Följ dessa procedurer för att säkerställa hög cellviabilitet och -integritet under kryopreserveringsprocessen.

Beredning av frysmedium

Bered kryoskyddande frysmedium enligt celltyp:

FBS-innehållande mediekulturer: 90 % FBS + 10 % DMSO eller 70 % tillväxtmedium, 20 % FBS och 10 % DMSO
Celler som kräver glycerol: 90 % FBS + 10 % glycerol

Överväg att skaffa vårt färdigformulerade frysmedium:

FrysmediumCM-1: För protokoll som kräver ett medium som innehåller fetalt bovint serum (FBS)
Frysmedium CM-ACF - serumfritt: För ett FBS-fritt alternativ

Märkning och dokumentation

Märk kryovialerna med följande uppgifter:

Datum
Forskarens namn
Cellens nummer
Passage nummer
Typ av cell
Eventuell ytterligare information (t.ex. genetiska modifieringar)

Förberedelse av celler

För adherenta celler:

Övervaka cellerna tills de når 85-95% konfluens
Aspirera det gamla odlingsmediet
Skölj cellmonolagret med kalcium- och magnesiumfri PBS
Lossa cellerna med Accutase, trypsin eller trypsin-EDTA och neutralisera med odlingsmedium om det behövs
Överför cellsuspensionen till ett 50 mL Falcon-rör

För suspenderade celler:

Kontrollera celldensitet och hälsa under ett mikroskop
Överför cellsuspensionen direkt till ett 50 ml Falcon-rör

Cellräkning och centrifugering

Räkna celler med hjälp av en hemocytometer eller automatiserad cellräknare
Centrifugera vid 300 g i 3-5 minuter i rumstemperatur för att pelletera cellerna
Aspirera supernatanten försiktigt och undvik att störa cellpelleten
Värm det beredda frysmediet till 37°C före användning

Kryopreservering

Resuspendera cellpellet i frysmedium till en densitet av 2,0 miljoner celler/mL för vidhäftande celler och 5 miljoner celler/mL för suspenderade celler, eller önskad koncentration
Aliquotera 1,0 ml (eller mer efter behov) av cellsuspensionen i märkta kryovialer
Använd en metod för långsam frysning innan cellerna överförs till långtidsförvaring

? Metod	? Steg
❄️ Manuell frysning	1️⃣ Placera cellerna i frysmedium i en 4°C frys i 40 minuter. 2️⃣ Överför till en frys på -80°C i 24 timmar. 3️⃣ Förvara cellerna i flytande kväve för långtidsförvaring
? Använda Mr Frosty	1️⃣ Förbered celler i kryovialer med frysmedium. 2️⃣ Placera kryovialerna i Mr Frosty-behållaren. 3️⃣ Förvara vid -80°C i 24 timmar innan du överför dem till flytande kväve
? Frys med kontrollerad hastighet	1️⃣ Programmera enheten för att gradvis sänka temperaturen. 2️⃣ Placera de förberedda cellerna i frysen. 3️⃣ Efter fryscykeln överför du cellerna till flytande kväve

Förvara kryovialerna vid temperaturer under -130°C eller i flytande kväve för långtidsförvaring.

Material och reagenser

1-2 mL kryovialer
CoolCell® frysenhet eller frys med kontrollerad hastighet
Kryoskyddande frysmedium (t.ex. DIY kryoprotektivt medium, CM-1, CM-ACF eller specialiserade medier)
Fetalt bovint serum (FBS) eller konditionerat medium
DMSO eller glycerol
Kalcium- och magnesiumfri PBS
Accutase, Trypsin eller Trypsin-EDTA (för vidhäftande celler)
15 mL eller 50 mL Falconrör
Hemocytometer eller automatiserad cellräknare
Centrifug