Publicerad: 2023 | Senast granskad: maj 2026

Omfattande guide till frysning av celler: Säkerställa livskraft och sterilitet

Frysning av celler är en kritisk process inom cellodlingshantering som säkerställer långvarig lagring och bevarande av värdefulla cellinjer. Oavsett om man arbetar med mänskliga eller djurceller är det avgörande att följa exakta protokoll och upprätthålla strikta aseptiska tekniker för att uppnå en framgångsrik kryokonservering.

Denna guide innehåller detaljerade instruktioner om nödvändiga material, reagenser och steg-för-steg-procedurer för att effektivt frysa celler samtidigt som deras livskraft och sterilitet bevaras. Genom att följa dessa riktlinjer kan forskare med säkerhet lagra och senare återuppliva cellkulturer med minimal förlust av cellernas livskraft, vilket upprätthåller integriteten och tillförlitligheten i deras experimentella resultat.

För att börja med är det viktigt att skapa en steril arbetsmiljö. Korrekt aseptisk teknik spelar en avgörande roll för att förhindra kontaminering och säkerställa odlingarnas sterilitet.

Aseptisk teknik

Följ aseptiska tekniker under hela processen för att säkerställa kulturernas sterilitet.

Omfattande process för frysning av celler

Detta flödesschema ger en detaljerad visuell guide till de väsentliga stegen för korrekt frysning av celler. Följ dessa procedurer för att säkerställa hög cellviabilitet och integritet under kryokonserveringsprocessen.

Beredning av frysmedel

Bered kryoskyddande frysmedel enligt celltyp:

FBS-innehållande odlingsmedier: 90 % FBS + 10 % DMSO eller 70 % odlingsmedium, 20 % FBS och 10 % DMSO
Celler som kräver glycerol: 90 % FBS + 10 % glycerol

Överväg att skaffa vårt färdigblandade frysmedel:

Frysmedel CM-1: För protokoll som kräver ett medium innehållande fetalt bovint serum (FBS)
Frysmedium CM-ACF – serumfritt: För ett FBS-fritt alternativ

Märkning och dokumentation

Märk kryorör med följande uppgifter:

Datum
Forskarens namn
Cellnummer
Passagenummer
Celltyp
Eventuell ytterligare information (t.ex. genetiska modifieringar)

Cellberedning

För adherenta celler:

Övervaka cellerna tills de når 85–95 % konfluens
Sug ut det gamla odlingsmediet
Skölj cellmonolagret med kalcium- och magnesiumfritt PBS
Lossa cellerna med Accutase, trypsin eller trypsin-EDTA och neutralisera med odlingsmedium om så krävs
Överför cellsuspensionen till ett 50 ml Falcon-rör

För suspensionsceller:

Kontrollera celltätheten och cellernas hälsa under mikroskop
Överför cellsuspensionen direkt till ett 50 ml Falcon-rör

Cellräkning och centrifugering

Räkna cellerna med hjälp av en hemocytometer eller en automatisk cellräknare
Centrifugera vid 300 g i 3–5 minuter vid rumstemperatur för att pelletera cellerna
Sug försiktigt bort supernatanten utan att störa cellpelleten
Värm det beredda frysmediet till 37 °C före användning

Kryokonservering

Resuspendera cellpelleten i frysmediet till en densitet på 2,0 miljoner celler/ml för vidhäftande celler och 5 miljoner celler/ml för suspensionsceller, eller till önskad koncentration
Fördela 1,0 ml (eller mer efter behov) av cellsuspensionen i märkta kryorör
Använd en metod för långsam frysning innan cellerna överförs till långtidsförvaring

? Metod: ? Steg
❄️ Manuell frysning: 1️⃣ Placera cellerna i frysmediet i en frys vid 4 °C i 40 minuter.
2️⃣ Flytta dem till en frys vid -80 °C i 24 timmar.
3️⃣ Förvara cellerna i flytande kväve för långvarig bevarande.
? Användning av Mr. Frosty: 1️⃣ Förbered cellerna i kryorör med frysmedel.
2️⃣ Placera kryorören i Mr. Frosty-behållaren.
3️⃣ Förvara vid -80 °C i 24 timmar innan du överför dem till flytande kväve.
? Frys med kontrollerad hastighet: 1️⃣ Programmera enheten så att temperaturen sänks gradvis.
2️⃣ Placera de förberedda cellerna i frysen.
3️⃣ Efter fryscykeln överförs cellerna till flytande kväve.

Förvara kryorör vid temperaturer under -130 °C eller i flytande kväve för långvarig förvaring.

Material och reagenser

1–2 ml kryorör
CoolCell®-frysenhet eller frys med kontrollerad hastighet
Kryoskyddande frysmedel (t.ex. DIY-kryoskyddsmedel, CM-1, CM-ACF eller specialmedier)
Fosterkalvsserum (FBS) eller konditionerade medier
DMSO eller glycerol
Kalcium- och magnesiumfritt PBS
Accutase, trypsin eller trypsin-EDTA (för vidhäftande celler)
15 ml eller 50 ml Falcon-rör
Hemocytometer eller automatisk cellräknare
Centrifug