HaCaT-celler - Utforska hudens biologi och sjukdomar

2.haCaT-cellernas genetiska egenskaper och ursprung

HaCaT-celler är en spontant immortaliserad human keratinocytcellinje som härstammar från vuxen hud och representerar en unik evolutionär väg. Dessa celler har mutationer i båda allelerna av p53-genen, vilket är typiskt för mutationer som induceras av UV-strålning [3,4]. HaCaT-celler antas dessutom ha genererats genom mutationer i tumörsuppressorgenen p53, följt av förlust av senescensgener [5].

Tumörsuppressorgenen p53, som är känd för sin roll i DNA-reparation och som genomets väktare, inducerar den mänskliga hudens svar på DNA-skador [4]. Det har observerats att HaCaT-celler delvis har förlorat sin skyddsmekanism mot DNA-skador på grund av in vivo-mutationen av p53-genen, vilket gör dem mottagliga för ackumulerade cytogenetiska förändringar som svar på förhöjda odlingstemperaturer. En annan mekanism för odödliggörande av HaCaT-celler innebär ökad aktivitet av telomerasenzymet [7]. I normala celler förkortas telomererna kontinuerligt vid varje celldelning tills cellulär senescens uppnås. Telomeras är ett specialiserat cellulärt enzymkomplex med omvänd transkriptasaktivitet som upprätthåller en stabil telomerlängd. HaCaT-celler uppvisar däremot en signifikant ökad telomerasaktivitet, vilket resulterar i en väl bibehållen telomerlängd. Dessa observationer bekräftar telomeras roll i immortaliseringsprocessen hos HaCaT-celler.

Tre specifika kromosomala translokationer har identifierats som leder till förlust av en kopia av kromosomarmarna 3p, 4p och 9p, en förstärkning av 9q och isokromosombildning. Förlusten av den korta armen av kromosom 3p kan leda till förlust av senescensgener och immortalisering av HaCaT-celler [8]. HaCaT-celler är hypodiploida och har distinkta och stabila markörkromosomer som representerar deras monoklonala ursprung. HaCaT-cellinjens egenskaper och huvud bekräftades med hjälp av DNA-fingeravtryck med hypervariabla minisatellitmarkörer [3-6].

3.hur man skördar HaCaT-celler i 5 enkla steg

4. Ta bort odlingsmediet och skölj de vidhäftande cellerna med 3-5 mL PBS utan kalcium och magnesium för T25-kolvar eller 5-10 mL för T75-kolvar.
5. Tillsätt 1-2 ml nyberedd 0,05% EDTA-lösning per T25-kolv eller 2,5 ml per T75-kolv, se till att hela cellarket täcks, och inkubera vid 37°C i 10 minuter.
6. Tillsätt 1 ml nyberedd trypsin/EDTA-lösning (0,05%/0,025%) per T25-kolv, eller 2,5 ml per T75-kolv, och se till att hela cellarket täcks. Cellerna bör lossna inom 1-2 minuter.
7. Stoppa trypsinaktiviteten genom att tillsätta ett FBS-innehållande cellodlingsmedium.
8. Fördela cellerna i nya kolvar som innehåller färskt cellodlingsmedium.

4. Tillämpningar av HaCaT-celler

HaCaT-celler är ett värdefullt verktyg för att studera keratinocyter [9]. Dessa odödliga celler fungerar som preneoplastiska celler och kan ge insikt i förändringar som är involverade i malign och neoplastisk omvandling [10]. HaCaT-cellkulturer i monolager är viktiga för analyser av cellulär toxicitet och sårläkning in vitro. HaCaT-celler kan också användas för att bedöma hudtoxicitet orsakad av olika ämnen och neoplastiska eller inflammatoriska processer. De kan användas för att analysera olika mekanismer bakom allergiska reaktioner i huden, effekterna av reaktiva syreföreningar och UV-strålning. Efter stimulering kan HaCaT-celler differentieras och uttrycka specifika differentieringsmarkörer, t.ex. involucrin, K14 och K10. HaCaT-celler används också ofta som en modell för att studera patofysiologin i epidermal homeostas [6].

HaCaT-celler behåller sin förmåga att återbilda en strukturerad epidermis in vivo efter transplantation, vilket resulterar i en stratifierad epidermal struktur som kan återställas mellan ett basalt och differentierat tillstånd genom förändringar i kalciumkoncentrationen i mediet. Dessa celler gör det också möjligt att karakterisera flera biologiska processer, till exempel deras användning som ett modellsystem för vitamin D och metabolism i huden. Eftersom HaCaT-cellerna inte är genetiskt modifierade ger de en opartisk bild av det breda spektrumet av initiala genetiska händelser i människans hud.

5. Utvalda videor: Utforska HaCaT-cellernas värld

"Migration av HaCaT-celler": I den här videon visas processen för cellmigration i HaCaT-celler. Cellernas migration är en viktig process för olika biologiska processer, t.ex. sårläkning och metastasering av cancer. Videon visar HaCaT-cellernas rörelse under ett mikroskop och ger en visuell bild av hur dessa celler migrerar. Cellernas aktivitet observeras när de förflyttar sig från en plats till en annan, och videon ger en tydlig illustration av de förändringar som sker i cellerna under denna process.

"Scratch Assay utförd på HaCaT-celler": Denna video visar en Scratch Assay som utförs på HaCaT-celler. Scratch Assay är en allmänt använd teknik för att studera cellmigration, och i det här fallet används den för att analysera migrationen av HaCaT-celler. Videon demonstrerar processen med att skapa en repa på ytan av en cellodlingsskål, som sedan observeras under ett mikroskop när HaCaT-celler migrerar och stänger gapet över tid.

"Celltillväxt av HaCaT keratinocyter för sårläkningsexperiment": Den här videon visar processen för celltillväxt av HaCaT-keratinocyter för sårläkningsexperiment. HaCaT-keratinocyter är en cellinje som ofta används i sårläkningsstudier.

"HaCaT-celldifferentiering": Den här videon visar de nödvändiga stegen för att differentiera HaCaT-celler. HaCaT-celler kan differentieras till olika typer av hudceller. Videon visar förändringarna i HaCaT-cellerna när de differentieras, med visuell representation av de olika markörerna och egenskaperna för differentiering. Differentieringsprocessen är avgörande för att huden ska fungera normalt, och videon belyser de olika differentieringsstadier som HaCaT-cellerna genomgår.

Referenser

1. Angel P och Karin M: The role of Jun, Fos and the AP-1 complex in cell proliferation and transformation. Biochim Biophys Acta 1072:129-157, 1991 Argyris TS: The regulation of epidermal hyperplastic growth. Crit Rev Toxicol 9:151-200, 1981
2. Baden HP, Kubilus J, Kvedar JC, Steinberg ML, Wolman SR: Isolering och karakterisering av en spontant uppkommen långlivad linje av humana keratinocyter (NM-1). In Vitro Cell Dev Biol 23(3):205-13, 1987
3. Lehmann TA, Modali R, Boukamp P, Stanek J, Bennett WP, Welsh JA, Metcalf RA, Stampfer MR, Fusenig NE, Rogan EM, Harriss CC: p53 mutations in human immortalized epithelial cell lines. Carcinogenesis 14:833-839, 1993
4. Ziegler A-M, Leffell DJ, Kunala S, Sharma HW, Gailani M, Simon JA, Halperin AJ, Baden HP, Shapiro PE, Bale AE, Brash DE: Mutation hotspots due to sunlight in the p53 gene of nonmelanoma skin cancer. Proc Natl Acad Sci USA 90:4216-4220, 1993
5. Fusenig NE, Boukamp P. Flera stadier och genetiska förändringar i immortalisering, malign transformation och tumörutveckling av mänskliga hudkeratinocyter. Mol Carcinog. 1998;23(3):144-158.
6. Harle-Bachor C, Boukamp P: Telomerasaktivitet i det regenerativa basala lagret av epidermis i mänsklig hud och i odödliga och karcinomderiverade hudkeratinocyter. Proc Natl Acad Sci USA 93:6476-81, 1996
7. Colombo I, Sangiovanni E, Maggio R, et al. HaCaT cells as a reliable in vitro differentiation model to dissect the inflammatory/repair response of human keratinocytes. Mediators Inflamm. 2017;2017:7435621.
8. Boukamp, P. et al. Normal keratinisering i en spontant immortaliserad aneuploid human keratinocytcellinje. J. Cell Biol. 106, 1996, 761-771.
9. Gibbs, Graham: Analys av kvalitativa data. The Sage qualitative research kit. London: Sage 978-0-7619-4980-0.
10. Hedrick TE, Bickman L, Rog DJ. 1993. Tillämpad forskningsdesign: en praktisk guide. Sage: London
11. Boukamp P. Petrussevska R. T. Breitkreutz D. Hornung J. Markham A. Fusenig N. E. Normal keratinisering i en spontant immortaliserad aneuploid human keratinocytcellinje. Cell Biol.(1988);106:761-771.