Publicat: 2023 | Ultima revizuire: mai 2026

Ghid complet pentru congelarea celulelor: asigurarea viabilității și sterilității

Congelarea celulelor este un proces critic în gestionarea culturilor celulare, asigurând stocarea și conservarea pe termen lung a liniilor celulare valoroase. Indiferent dacă se lucrează cu celule umane sau animale, respectarea protocoalelor precise și menținerea unor tehnici aseptice stricte sunt esențiale pentru realizarea unei crioconservări reușite.

Acest ghid oferă instrucțiuni detaliate privind materialele și reactivii necesari, precum și procedurile pas cu pas pentru congelarea eficientă a celulelor, păstrându-le în același timp viabilitatea și sterilitatea. Respectând aceste linii directoare, cercetătorii pot depozita cu încredere și reînvia ulterior culturile celulare cu pierderi minime în ceea ce privește viabilitatea celulelor, menținând integritatea și fiabilitatea rezultatelor experimentale.

Pentru a începe, este esențial să se creeze un mediu de lucru steril. Tehnicile aseptice adecvate joacă un rol crucial în prevenirea contaminării și asigurarea sterilității culturilor.

Tehnica aseptică

Respectați tehnicile aseptice pe tot parcursul procesului pentru a asigura sterilitatea culturilor.

Procesul complet de congelare a celulelor

Acest diagramă oferă un ghid vizual detaliat al pașilor esențiali implicați în congelarea corespunzătoare a celulelor. Urmați aceste proceduri pentru a asigura o viabilitate și integritate ridicate a celulelor în timpul procesului de crioconservare.

Pregătirea mediului de congelare

Pregătiți mediul de congelare crioprotector în funcție de tipul de celule:

Culturi în medii care conțin FBS: 90% FBS + 10% DMSO sau 70% mediu de creștere, 20% FBS și 10% DMSO
Celule care necesită glicerol: 90% FBS + 10% glicerol

Luați în considerare achiziționarea mediului nostru de congelare preformulat:

Mediu de congelare CM-1: Pentru protocoale care necesită un mediu conținând ser fetal bovin (FBS)
Mediu de congelare CM-ACF - fără ser: Pentru o alternativă fără FBS

Etichetare și documentare

Etichetați criovialele cu următoarele detalii:

Data
Numele cercetătorului
Numărul de celule
Numărul de pas
Tipul de celule
Orice informații suplimentare (de ex., modificări genetice)

Pregătirea celulelor

Pentru celule aderente:

Monitorizați celulele până când ating o confluență de 85–95%
Aspirați mediul de cultură vechi
Clătiți monostratul celular cu PBS fără calciu și magneziu
Desprindeți celulele cu Accutase, tripsină sau tripsină-EDTA și neutralizați cu mediu de cultură, dacă este necesar
Transferați suspensia celulară într-o eprubetă Falcon de 50 ml

Pentru celulele în suspensie:

Verificați densitatea și starea celulelor la microscop
Transferați suspensia celulară direct într-o eprubetă Falcon de 50 ml

Numărarea celulelor și centrifugarea

Numărați celulele folosind un hemocitometru sau un contor automat de celule
Centrifugați la 300 g timp de 3-5 minute la temperatura camerei pentru a sedimenta celulele
Aspirați cu grijă supernatantul, evitând perturbarea sedimentului celular
Încălziți mediul de congelare pregătit la 37 °C înainte de utilizare

Crioconservare

Resuspendeți sedimentul celular în mediu de congelare la o densitate de 2,0 milioane de celule/ml pentru celulele aderente și 5 milioane de celule/ml pentru celulele în suspensie, sau la concentrația dorită
Alocați 1,0 ml (sau mai mult, după cum este necesar) din suspensia celulară în crioviale etichetate
Utilizați o metodă de congelare lentă înainte de a transfera celulele în depozitarea pe termen lung

? Metodă: ? Pași
❄️ Congelare manuală: 1️⃣ Plasați celulele în mediu de congelare într-un congelator la 4 °C timp de 40 de minute.
2️⃣ Transferați-le într-un congelator la -80 °C timp de 24 de ore.
3️⃣ Depozitați celulele în azot lichid pentru conservare pe termen lung.
? Utilizarea Mr. Frosty: 1️⃣ Pregătiți celulele în crioviale cu mediu de congelare.
2️⃣ Așezați criovialele în recipientul Mr. Frosty.
3️⃣ Păstrați la -80 °C timp de 24 de ore înainte de a le transfera în azot lichid.
? Congelator cu viteză controlată: 1️⃣ Programați dispozitivul pentru a scădea treptat temperatura.
2️⃣ Așezați celulele pregătite în congelator.
3️⃣ După ciclul de congelare, transferați celulele în azot lichid.

Depozitați criovialele la temperaturi sub -130 °C sau în azot lichid pentru conservare pe termen lung.

Materiale și reactivi

Crioviale de 1–2 ml
Unitate de congelare CoolCell® sau congelator cu viteză controlată
Mediu de congelare crioprotector (de exemplu, medii crioprotectoare DIY, CM-1, CM-ACF sau medii specializate)
Ser fetal bovin (FBS) sau medii condiționate
DMSO sau glicerol
PBS fără calciu și magneziu
Accutase, tripsină sau tripsină-EDTA (pentru celule aderente)
Tuburi Falcon de 15 ml sau 50 ml
Hemocitometru sau contor automat de celule
Centrifugă