Ghid cuprinzător pentru congelarea celulelor: Asigurarea viabilității și sterilității

Congelarea celulelor este un proces esențial în gestionarea culturilor celulare, asigurând stocarea și conservarea pe termen lung a liniilor celulare valoroase. Indiferent dacă lucrați cu celule umane sau animale, respectarea unor protocoale precise și menținerea unor tehnici aseptice stricte sunt esențiale pentru a obține o crioconservare de succes.

Acest ghid oferă instrucțiuni detaliate cu privire la materialele, reactivii și procedurile pas cu pas necesare pentru a congela eficient celulele, păstrându-le viabilitatea și sterilitatea. Prin respectarea acestor linii directoare, cercetătorii pot stoca cu încredere și revigora ulterior culturile de celule cu pierderi minime de viabilitate celulară, menținând integritatea și fiabilitatea rezultatelor lor experimentale.

Pentru început, este esențial să se stabilească un mediu de lucru steril. Tehnicile aseptice adecvate joacă un rol crucial în prevenirea contaminării și asigurarea sterilității culturilor.

Tehnica aseptică

Respectați tehnicile aseptice pe tot parcursul procesului pentru a asigura sterilitatea culturilor.

Procesul complet de înghețare a celulelor

Această diagramă de flux oferă un ghid vizual detaliat pentru etapele esențiale implicate în congelarea corectă a celulelor. Urmați aceste proceduri pentru a asigura viabilitatea și integritatea ridicată a celulelor în timpul procesului de crioconservare.

Pregătirea mediului de congelare

Pregătiți mediul de congelare crioprotector în funcție de tipul de celulă:

Culturi cu mediu conținând FBS: 90% FBS + 10% DMSO sau 70% mediu de creștere, 20% FBS și 10% DMSO
Celule care necesită glicerol: 90% FBS + 10% glicerol

Luați în considerare achiziționarea mediului nostru de congelare preformulat:

Mediu de congelare CM-1: Pentru protocoalele care necesită un mediu care conține ser fetal bovin (FBS)
Mediu de congelare CM-ACF - fără ser: Pentru o alternativă fără FBS

Etichetare și documentație

Etichetați criovialele cu următoarele detalii:

Data
Numele cercetătorului
Numărul celulei
Numărul pasajului
Tipul celulei
Orice informații suplimentare (de exemplu, modificări genetice)

Pregătirea celulelor

Pentru celule aderente:

Monitorizați celulele până când ajung la 85-95% confluență
Se aspiră mediul de cultură vechi
Clătiți monocapa celulară cu PBS fără calciu și magneziu
Detașați celulele cu Accutase, tripsină sau tripsină-EDTA și neutralizați cu mediu de cultură, dacă este necesar
Se transferă suspensia celulară într-un tub Falcon de 50 ml

Pentru celulele în suspensie:

Verificați densitatea și sănătatea celulelor la microscop
Transferați suspensia celulară direct într-un tub Falcon de 50 mL

Numărarea și centrifugarea celulelor

Numărați celulele utilizând un hemocitometru sau un contor celular automat
Centrifugați la 300 g timp de 3-5 minute la temperatura camerei pentru a granula celulele
Se aspiră cu grijă supernatantul, evitând perturbarea peletului celular
Încălziți mediul de congelare preparat la 37°C înainte de utilizare

Crioprezervarea

Resuspendați peletul celular în mediu de congelare până la o densitate de 2,0 milioane de celule/mL pentru celulele aderente și 5 milioane de celule/mL pentru celulele în suspensie sau până la concentrația dorită
Se alicotează 1,0 ml (sau mai mult, după caz) din suspensia celulară în criotuburi etichetate
Utilizați o metodă de congelare lentă înainte de a transfera celulele la depozitarea pe termen lung

? Metoda	? Etape
❄️ Congelare manuală	1️⃣ Puneți celulele în mediu de congelare într-un congelator la 4°C timp de 40 de minute. 2️⃣ Se transferă la un congelator la -80°C timp de 24 de ore. 3️⃣ Depozitați celulele în azot lichid pentru conservare pe termen lung
? Utilizarea domnului Frosty	1️⃣ Pregătiți celulele în crioale cu mediu de congelare. 2️⃣ Așezați criovialele în recipientul Mr. Frosty. 3️⃣ Păstrați la -80°C timp de 24 de ore înainte de a le transfera în azot lichid
? Congelator cu rată controlată	1️⃣ Programați dispozitivul pentru a scădea treptat temperatura. 2️⃣ Introduceți celulele pregătite în congelator. 3️⃣ După ciclul de congelare, transferați celulele în azot lichid

Depozitați criovialele la temperaturi sub -130°C sau în azot lichid pentru conservare pe termen lung.

Materiale și reactivi

fiole criogenice de 1-2 ml
Unitate de congelare CoolCell® sau congelator cu rată controlată
Mediu de congelare crioprotector (de exemplu, mediu crioprotector DIY, CM-1, CM-ACF sau medii specializate)
Ser fetal bovin (FBS) sau medii condiționate
DMSO sau glicerol
PBS fără calciu și magneziu
Accutase, tripsină sau tripsină-EDTA (pentru celule aderente)
tuburi Falcon de 15 ml sau 50 ml
Hemocitometru sau contor automat de celule
Centrifugă