Publicat: 2023 | Ultima revizuire: mai 2026

Tehnici de disociere a culturilor celulare

Disocierea culturii celulare este o etapă critică în întreținerea culturii celulare. Aceasta implică detașarea celulelor de pe suprafața de creștere pentru a permite subcultivarea sau recoltarea. Această secțiune prezintă două metode principale: utilizarea tampoanelor de disociere fără enzime și utilizarea reactivilor enzimatici.

Utilizarea tampoanelor de disociere celulară fără enzime

Această metodă este delicată și menține integritatea celulară fără utilizarea enzimelor:

1. Pregătire
   • Asigurați-vă că toți reactanții sunt încălziți la 37 °C înainte de utilizare, pentru a evita șocul asupra celulelor.
2. Îndepărtarea mediului de creștere:
   • Aruncați mediul de creștere vechi din vasul de cultură.
3. Clătire
   • Clătiți monostraturile celulare cu 5 ml de PBS fără calciu și magneziu pentru fiecare flacon T75 sau vas de 100 mm.
   • Agitați ușor recipientul timp de 30 până la 60 de secunde la temperatura camerei.
   • Aspirați și aruncați soluția de clătire.
   • Repetați această etapă de clătire încă o dată.
4. Disociere
   • Adăugați aproximativ 5 ml de tampon de disociere celulară fără enzime în recipient.
   • Agitați ușor la temperatura camerei timp de 1-2 minute și verificați disocierea la microscop.
   • Bateți balonul sau vasul de cultură de mână pentru a desprinde celulele, dacă este necesar.
   • Dacă celulele sunt aderente, lăsați-le la temperatura camerei pentru încă 2-5 minute și loviți ușor din nou, dacă este necesar, folosind mai mult tampon de disociere.
   • Odată ce celulele s-au desprins, adăugați cel puțin 5 ml de mediu de creștere complet pentru a neutraliza tamponul de disociere și a resuspende celulele.
5. Verificarea viabilității
   • Monitorizați viabilitatea celulară în timpul subcultivării, asigurându-vă că aceasta rămâne peste 90%.

Utilizarea altor reactivi pentru disociere

Această metodă permite utilizarea diverselor reactivi de disociere:

1. Îndepărtarea mediului utilizat
   • Aruncați mediul vechi din vasul de cultură.
2. Spălarea celulelor
   • Spălați celulele cu o soluție salină echilibrată, fără calciu și magneziu, sau utilizați EDTA.
   • Adăugați soluția de spălare ușor pe partea opusă celulelor și agitați vasul timp de 1-2 minute înainte de a arunca soluția de spălare.
3. Disociere
   • Aplicați 2-3 ml din soluția de disociere aleasă la fiecare 25 cm² de suprafață de creștere, asigurându-vă că acoperiți stratul celular.
   • Incubați vasul la 37 °C și agitați ușor. Disocierea are loc de obicei în 5-15 minute, în funcție de linia celulară.
   • Pentru celulele rezistente, lovirea ușoară a vasului poate accelera procesul.
   • Observați cu atenție celulele pentru a preveni supraexpunerea și potențialele deteriorări.
4. Recoltarea celulelor
   • Odată ce celulele sunt complet desprinse, lăsați-le să se adune la fundul vasului, așezându-l în poziție verticală.
   • Adăugați mediu complet, apoi dispersați și colectați celulele prin pipetare peste stratul celular.
   • Numărați și continuați cu subcultivarea.

În ambele metode, este important să se determine condițiile optime pentru fiecare linie celulară prin observare empirică. Procesul trebuie să păstreze viabilitatea celulară, care trebuie verificată în mod regulat pentru a depăși 90% în timpul subcultivării. Aceste proceduri oferă o bază pe care cercetătorii o pot adapta în funcție de cerințele și caracteristicile specifice ale liniilor lor celulare.

Prezentare generală a tehnicilor de subcultivare a celulelor aderente

Subcultivarea eficientă a celulelor aderente necesită detașarea acestora de vasul de cultură. Se utilizează diverse metode, fiecare potrivită pentru diferite tipuri de celule și condiții. Atunci când se selectează o metodă de disociere, este esențial să se ia în considerare nevoile specifice ale liniei celulare și obiectivele experimentului. Monitorizarea regulată a viabilității celulare, cu un obiectiv de peste 90% în momentul subcultivării, este esențială pentru menținerea sănătății și productivității culturii. Iată o prezentare generală a acestor proceduri: