Celule HaCaT - Explorarea biologiei și bolilor pielii

2.caracteristicile genetice și originea celulelor HaCaT

Celulele HaCaT sunt o linie celulară de keratinocite umane imortalizate spontan, provenind din pielea adultă și reprezentând o cale evolutivă unică. Aceste celule prezintă mutații în ambele alele ale genei p53, ceea ce este tipic pentru mutațiile induse de radiațiile UV [3,4]. În plus, se presupune că celulele HaCaT au fost generate prin mutații ale genei supresoare de tumori p53, urmate de pierderea genelor de senescență [5].

Gena supresoare de tumori p53, cunoscută pentru rolul său în repararea ADN și ca gardian al genomului, induce răspunsul pielii umane la deteriorarea ADN [4]. S-a observat că celulele HaCaT și-au pierdut parțial mecanismul de protecție împotriva deteriorării ADN datorită mutației in vivo a genei p53, ceea ce le face susceptibile la acumularea de modificări citogenetice ca răspuns la temperaturi de cultură ridicate. Un alt mecanism de imortalizare a celulelor HaCaT implică creșterea activității enzimei telomerază [7]. În celulele normale, telomerii se scurtează continuu cu fiecare diviziune celulară până la atingerea senescenței celulare. Telomeraza este un complex enzimatic celular specializat cu activitate de transcriptază inversă care menține lungimea telomerilor stabilă. În schimb, celulele HaCaT prezintă o activitate a telomerazei semnificativ crescută, rezultând o lungime bine menținută a telomerilor. Aceste observații confirmă rolul telomerazei în procesul de imortalizare a celulelor HaCaT.

Au fost identificate trei translocații cromozomiale specifice care duc la pierderea unei copii a brațelor cromozomiale 3p, 4p și 9p, la un câștig al brațului 9q și la formarea de izocromosomi. Pierderea brațului scurt al cromozomului 3p poate duce la pierderea genelor de senescență și la imortalizarea celulelor HaCaT [8]. Celulele HaCaT sunt hipodiploide și posedă cromozomi marker distincți și stabili care reprezintă originea lor monoclonală. Caracteristicile și capul liniei de celule HaCaT au fost confirmate utilizând amprentarea ADN cu markeri minisateliți hipervariabili [3-6].

3.cum se recoltează celulele HaCaT în 5 pași simpli

4. Îndepărtați mediul de cultură și clătiți celulele aderente folosind 3-5 mL de PBS fără calciu și magneziu pentru flacoane T25 sau 5-10 mL pentru flacoane T75.
5. Adăugați 1-2 ml de soluție EDTA 0,05% proaspăt preparată pentru fiecare balon T25 sau 2,5 ml pentru fiecare balon T75, asigurându-vă că întreaga foaie celulară este acoperită, și incubați la 37°C timp de 10 minute.
6. Se adaugă 1 ml de soluție de tripsină/EDTA (0,05%/0,025%) proaspăt preparată pentru fiecare flacon T25 sau 2,5 ml pentru fiecare flacon T75, asigurându-se din nou acoperirea completă a stratului celular. Celulele ar trebui să se desprindă în 1-2 minute.
7. Opriți activitatea tripsinei prin adăugarea unui mediu de cultură celulară care conține FBS.
8. Se distribuie celulele în flacoane noi care conțin mediu de cultură celular proaspăt.

4. Aplicații ale celulelor HaCaT

Celulele HaCaT sunt un instrument valoros pentru studiul keratinocitelor [9]. Aceste celule nemuritoare funcționează ca celule preneoplazice și pot oferi o perspectivă asupra modificărilor implicate în transformarea malignă și neoplastică [10]. Culturile monocelulare de celule HaCaT sunt esențiale pentru toxicitatea celulară și pentru aplicațiile de analiză in vitro a vindecării rănilor. Celulele HaCaT pot fi, de asemenea, utilizate pentru a evalua toxicitatea cutanată cauzată de diverși agenți și procese neoplazice sau inflamatorii. Ele pot fi utilizate pentru a analiza diferite mecanisme ale reacțiilor alergice cutanate, efectele speciilor reactive de oxigen și iradierea cu UV. La stimulare, celulele HaCaT se pot diferenția și pot exprima markeri specifici de diferențiere, precum involucrina, K14 și K10. Celulele HaCaT sunt, de asemenea, frecvent utilizate ca model pentru studierea fiziopatologiei homeostaziei epidermice [6].

Celulele HaCaT își păstrează capacitatea de a reconstitui o epidermă structurată in vivo după transplant, rezultând o structură epidermică stratificată care poate fi inversată între o stare bazală și una diferențiată prin modificări ale concentrației de calciu din mediu. Aceste celule permit, de asemenea, caracterizarea mai multor procese biologice, cum ar fi utilizarea lor ca sistem model pentru vitamina D și metabolismul în piele. Deoarece celulele HaCaT nu sunt modificate genetic, ele prezintă o imagine imparțială a spectrului larg de evenimente genetice inițiale din pielea umană.

5. Videoclipuri prezentate: Explorarea lumii celulelor HaCaT

"Migrația celulelor HaCaT": Acest videoclip prezintă procesul de migrare celulară în celulele HaCaT. Migrarea celulelor este un proces esențial pentru diverse procese biologice, cum ar fi vindecarea rănilor și metastazarea cancerului. Videoclipul demonstrează mișcarea celulelor HaCaT sub microscop, oferind o reprezentare vizuală a modului în care aceste celule migrează. Activitatea celulelor este observată în timp ce acestea se deplasează dintr-un loc în altul, iar videoclipul oferă o ilustrare clară a schimbărilor care au loc în celule în timpul acestui proces.

"Testul Scratch efectuat pe celule HaCaT": Acest videoclip prezintă un test Scratch efectuat pe celule HaCaT. Testul Scratch este o tehnică utilizată pe scară largă pentru a studia migrația celulară și, în acest caz, este utilizată pentru a analiza migrația celulelor HaCaT. Videoclipul demonstrează procesul de creare a unei zgârieturi pe suprafața unei plăci de cultură celulară, care este apoi observată la microscop pe măsură ce celulele HaCaT migrează și închid spațiul în timp.

"Creșterea celulară a keratinocitelor HaCaT pentru experimente de vindecare a rănilor": Acest videoclip demonstrează procesul de creștere celulară a keratinocitelor HaCaT pentru experimente de vindecare a rănilor. Keratinocitele HaCaT sunt o linie celulară frecvent utilizată în studiile de vindecare a rănilor.

"Diferențierea celulelor HaCaT": Acest videoclip prezintă pașii necesari pentru diferențierea celulelor HaCaT. Celulele HaCaT se pot diferenția în diferite tipuri de celule ale pielii. Videoclipul demonstrează schimbările din celulele HaCaT pe măsură ce se diferențiază, reprezentând vizual diverși markeri și caracteristici ale diferențierii. Procesul de diferențiere este esențial pentru funcționarea normală a pielii, iar videoclipul evidențiază diferitele etape de diferențiere prin care trec celulele HaCaT.

Referințe

1. Angel P și Karin M: Rolul Jun, Fos și al complexului AP-1 în proliferarea și transformarea celulară. Biochim Biophys Acta 1072:129-157, 1991 Argyris TS: The regulation of epidermal hyperplastic growth. Crit Rev Toxicol 9:151-200, 1981
2. Baden HP, Kubilus J, Kvedar JC, Steinberg ML, Wolman SR: Izolarea și caracterizarea unei linii spontane de keratinocite umane de lungă durată (NM-1). In Vitro Cell Dev Biol 23(3):205-13, 1987
3. Lehmann TA, Modali R, Boukamp P, Stanek J, Bennett WP, Welsh JA, Metcalf RA, Stampfer MR, Fusenig NE, Rogan EM, Harriss CC: Mutații p53 în liniile de celule epiteliale imortalizate umane. Carcinogeneză 14:833-839, 1993
4. Ziegler A-M, Leffell DJ, Kunala S, Sharma HW, Gailani M, Simon JA, Halperin AJ, Baden HP, Shapiro PE, Bale AE, Brash DE: Hotspoturi de mutații datorate luminii solare în gena p53 a cancerului de piele nonmelanoma. Proc Natl Acad Sci USA 90:4216-4220, 1993
5. Fusenig NE, Boukamp P. Multiple etape și modificări genetice în imortalizarea, transformarea malignă și progresia tumorală a keratinocitelor pielii umane Mol Carcinog. 1998;23(3):144-158.
6. Harle-Bachor C, Boukamp P: Activitatea telomerazei în stratul bazal regenerativ al epidermei în pielea umană și în keratinocitele cutanate nemuritoare și derivate din carcinom. Proc Natl Acad Sci USA 93:6476-81, 1996
7. Colombo I, Sangiovanni E, Maggio R, et al. Celulele HaCaT ca model de diferențiere in vitro fiabil pentru disecarea răspunsului inflamator/reparator al keratinocitelor umane. Mediators Inflamm. 2017;2017:7435621.
8. Boukamp, P. și colab. Keratinizare normală într-o linie celulară de keratinocite umane aneuploide imortalizate spontan. J. Cell Biol. 106, 1996, 761-771.
9. Gibbs, Graham: Analiza datelor calitative. The Sage qualitative research kit. Londra: Sage 978-0-7619-4980-0.
10. Hedrick TE, Bickman L, Rog DJ. 1993. Proiectarea cercetării aplicate: un ghid practic. Sage: Londra
11. Boukamp P. Petrussevska R. T. Breitkreutz D. Hornung J. Markham A. Fusenig N. E. Keratinizarea normală într-o linie celulară de keratinocite umane aneuploide imortalizate spontan. Cell Biol.(1988);106:761-771.