Du-te la pagina de pornire
Coș de cumpărături 0,00 EUR*
Afișați toate categoriile Linia celulară CHO în bioproducție: Aplicații și inovații Înapoi

Celulele CHO în bioproducție: aplicații și inovații

Derivată din ovarul unui hamster chinezesc, linia celulară CHO este un motor al cercetării medicale și biologice, datorită gamei sale largi de aplicații. Această linie celulară de mamifere oferă posibilități nelimitate, de la producția de proteine recombinante la expresia genică, screeningul toxicității, nutriție și studii genetice.

📋 Linia celulară CHO — Informații succinte
Mediu de creștere
Consultați pagina produsului
Timp de dublare
Consultați pagina produsului
Tip de creștere
Aderent
Nivel de biosecuritate
BSL-1
Disponibil de la
Cytion — Comandați CHO

Articolul nostru se adâncește în lumea fascinantă a celulelor CHO, explorând modul în care aceste celule au revoluționat cercetarea biofarmaceutică și au deschis calea către terapii care salvează vieți. Pregătiți-vă să descoperiți secretele puternicelor celule CHO și să aflați cum acestea determină progrese revoluționare în medicină și nu numai! Veți afla tot ce trebuie să știți înainte de a începe, inclusiv:

Ce este linia celulară CHO?

De la crearea lor în 1957 de către Theodore T. Puck, celulele ovariene de hamster chinezesc (CHO) au devenit un element de bază în cercetarea biologică și medicală datorită creșterii lor rapide și producției ridicate de proteine. Aceste celule epiteliale, derivate din ovarul hamsterului chinezesc, sunt utilizate pe scară largă în biofabricație, genetică, screeningul toxicității, nutriție și studii privind expresia genică.

Celulele CHO pot produce proteine cu modificări post-translaționale (PTM) similare celor găsite la oameni. De asemenea, acestea prezintă o deficiență în sinteza prolinei și nu exprimă receptorul factorului de creștere epidermic (EGFR), ceea ce le face ideale pentru investigarea diverselor mutații ale EGFR.

În biofabricație, celulele CHO sunt utilizate pe scară largă pentru producerea de anticorpi monoclonali, proteine recombinante și vaccinuri. Peste 60 de proteine terapeutice obținute cu ajutorul celulelor CHO au fost aprobate pentru producție, iar utilizarea lor continuă să se extindă. Articolul nostru analizează proprietățile remarcabile și aplicațiile diverse ale celulelor CHO, evidențiind rolul lor crucial în stimularea progreselor în biomedicină și nu numai. Pregătiți-vă să explorați lumea fascinantă a celulelor CHO și să descoperiți potențialul lor de neegalat în cercetarea biomedicală!

Chinese hamster

Celulele CHO: soluția preferată a industriei biofarmaceutice pentru producția de proteine recombinante

În industria biotehnologică, celulele ovariene de hamster chinezesc (CHO) sunt utilizate frecvent pentru a crea produse biofarmaceutice precum anticorpi monoclonali, proteine recombinante și vaccinuri.

Deși este posibil să nu fiți conștienți de acest lucru, celulele ovariene de hamster chinezesc (CHO) ar putea fi responsabile dacă ați urmat vreodată o terapie cu anticorpi monoclonali. Aceste celule adaptabile sunt utilizate frecvent de industria biofarmaceutică pentru a produce proteine recombinante care sunt utilizate în cercetarea biomedicală, diagnosticare și o varietate de terapii. Terapiile pe bază de proteine numite anticorpi monoclonali (mAbs) sunt utilizate pentru tratarea unei varietăți de boli, precum cancerul, afecțiunile autoimune și bolile infecțioase. Deoarece suferă modificări post-translaționale similare cu cele din celulele umane, celulele CHO sunt frecvent utilizate pentru producerea de mAbs. Aceste modificări sunt necesare pentru ca aceste terapii să funcționeze corespunzător.

Proteinele create prin inginerie genetică sunt cunoscute sub numele de proteine recombinante. Pe lângă faptul că sunt reactivi de cercetare, ele pot fi utilizate și ca terapii și mijloace de diagnosticare. Deoarece pot suferi modificări post-translaționale și au glicozilări complexe asemănătoare celor găsite în celulele umane, celulele CHO sunt deosebit de potrivite pentru producerea de proteine recombinante datorită creșterii lor rapide, expresiei proteice ridicate și capacității de a exprima cantități mari de proteine. Cu randamente cuprinse între 3 și 10 grame pe litru de cultură, linia celulară CHO reprezintă o revoluție în domeniul biofarmaceutic, datorită capacității sale de neegalat de a produce în masă proteine terapeutice. Celulele CHO sunt acum o componentă vitală a biomedicinei contemporane datorită optimizării genetice, care le sporește capacitatea de a genera cantități mari de proteine recombinante.

Vaccinurile sunt produse biofarmaceutice utilizate pentru prevenirea și tratarea infecțiilor provocate de viruși și bacterii. Vaccinurile împotriva COVID-19 se numără printre cele fabricate cu celule CHO. Oamenii de știință au creat o serie de tehnici, inclusiv ingineria genetică, optimizarea mediilor de cultură și dezvoltarea proceselor, pentru a îmbunătăți performanța celulelor CHO în producția de produse biofarmaceutice. Aceste tehnici au dus la crearea unor sisteme de cultură cu randament ridicat și costuri reduse pentru producția de produse biofarmaceutice folosind celule CHO. Gama largă de aplicații pentru celulele CHO include:

Unitate de producție farmaceutică.

Celulele CHO în producția biofarmaceutică

Celulele CHO sunt utilizate pentru a produce diverse produse bioterapeutice, inclusiv proteine recombinante și anticorpi monoclonali folosiți în tratarea bolilor precum cancerul, tulburările autoimune și bolile infecțioase. Adoptarea celulelor CHO în domeniul biofarmaceutic se datorează în mare parte capacității lor de a efectua modificări post-translaționale similare cu cele ale celulelor umane, ceea ce le face gazde mamifere ideale pentru producerea de proteine terapeutice compatibile cu organismul uman. Înțelegerea cuprinzătoare a profilurilor proteice ale celulelor gazdă CHO și implementarea tehnicilor ELISA pentru proteinele celulelor gazdă sunt esențiale pentru asigurarea purității și siguranței produselor biofarmaceutice fabricate în sisteme de celule CHO. Drept urmare, celulele CHO și-au consolidat poziția de platformă multifuncțională în industria biotehnologică.

Progrese în producția de anticorpi pe bază de celule CHO

Celulele CHO sunt utilizate pe scară largă în producția de anticorpi monoclonali, care au revoluționat domeniul biomedicinei prin furnizarea de terapii țintite pentru diverse boli. Celulele CHO au devenit piatra de temelie în expresia anticorpilor recombinanți și în producția de terapii proteice datorită capacității lor de a plia, asambla și modifica corect proteinele umane. Producția de anticorpi din celule CHO a evoluat odată cu îmbunătățirile aduse tehnicilor de cultură celulară și ingineriei celulelor CHO, ceea ce a dus la obținerea de celule CHO de înaltă calitate, esențiale pentru dezvoltarea produselor biofarmaceutice. Au fost aplicate abordări biotehnologice cuprinzătoare, inclusiv tehnologia ADN și metode sofisticate de cultură celulară, pentru a optimiza sistemele de celule CHO în vederea creșterii eficienței producției de anticorpi.

Biologie moleculară și ingineria celulelor CHO

Fuziunea tehnicilor de biologie moleculară cu cultivarea celulelor CHO a dus la crearea de linii celulare CHO transgenice și la manipularea mutanților celulelor de hamster chinezesc pentru a obține trăsăturile dorite. Aceste progrese în ingineria celulară și tehnologia ADN-ului au facilitat dezvoltarea celulelor CHO capabile să producă proteine recombinante specifice cu eficacitate ridicată. Explorarea abordărilor de cultură a celulelor eucariote, inclusiv celulele CHO și HeLa, a contribuit la o mai bună înțelegere a mecanismelor celulare și la optimizarea culturilor de celule de mamifere pentru producția de proteine terapeutice.

Dar asta nu este tot! Celulele CHO au și alte aplicații fascinante în cercetarea biomedicală, printre care:

  • Screeningul toxicității: celulele CHO sunt utilizate pentru a evalua toxicitatea medicamentelor, inclusiv a agenților terapeutici anticancerigeni și antivirali. De exemplu, un studiu a explorat activitatea specifică împotriva cancerului de sân a acizilor grași derivați din microalge antarctice, utilizând CHO ca linie celulară de control.
  • Expresia genică: Celulele CHO sunt utilizate pentru a exprima în mod stabil și tranzitoriu gene pentru studii privind funcția genelor sau producția de proteine țintite. Instrumentele de editare genetică sunt utilizate pentru a dezvolta modele de knock-in și knockout genetic în liniile celulare CHO.

Perspective viitoare în cercetarea celulelor CHO

Cercetarea și dezvoltarea continuă în domeniul sistemelor de celule CHO se concentrează pe îmbunătățirea eficienței și versatilității acestor celule în producția biofarmaceutică. Deoarece celulele CHO rămân în prima linie a terapiei cu proteine recombinante, rolul lor în viitorul medicinei și al biotehnologiei este semnificativ, promitând noi progrese în dezvoltarea anticorpilor și producția de tratamente care salvează vieți.

Descoperiți beneficiile puternicelor celule CHO

Iată câteva avantaje cheie ale liniei celulare CHO care o fac un instrument de cercetare atractiv.

  1. Ușurința cultivării: Procedurile și condițiile de cultivare ale liniei celulare CHO nu sunt pretențioase. Aceste celule sunt rezistente și capabile să tolereze variații de temperatură și modificări ale pH-ului. Astfel, ele sunt ideale pentru cultivarea la scară largă.
  2. Modificări post-translaționale: Aceste celule sunt similare cu celulele umane și capabile să producă modificări post-translaționale similare. Astfel, celulele CHO pot fi utilizate pentru a produce produse biologice biocompatibile cu o activitate farmaceutică excelentă.
  3. Productivitate ridicată: Celulele CHO sunt utilizate pe scară largă pentru producerea de proteine recombinante în cantități mari. Optimizarea genetică a liniei celulare CHO a dus la obținerea a aproximativ 3-10 grame de proteine pe litru de cultură.
  4. Expresia genică: Celulele CHO sunt ușor de transfectat; prin urmare, sunt utilizate frecvent pentru studii de expresie tranzitorie și stabilă. În plus, multe instrumente genetice sunt utilizate pentru a dezvolta modele de knock-in și knockout genetic folosind linia celulară CHO.
  5. Aprobări guvernamentale: Celulele CHO au fost utilizate în aproape 50 de produse bioterapeutice aprobate în SUA și UE.
  6. Susceptibilitate redusă la viruși: Datorită originii de hamster, riscul de propagare a virusurilor umane este redus, ceea ce diminuează pierderile de producție și sporește biosecuritatea.

Caracteristici cheie ale celulelor CHO

  • Morfologie: Celulele CHO prezintă un aspect similar celulelor epiteliale, cu o formă alungită și asemănătoare fibroblastelor. Sunt aderente și cresc de obicei în monostraturi.

  • Dimensiunea celulei: Diametrul mediu al celulelor CHO este între 12-14 μm.

  • Genom și ploidie: Celulele CHO sunt aneuploide, având 21 de cromozomi, ceea ce diferă de numărul de cromozomi euploid găsit la hamsterul chinezesc. Cariotipul celulelor CHO se caracterizează prin multiple rearanjări structurale, inclusiv pierderea parțială a materialului cromozomial 2 și X. 

CHO cells mid confluent and at a high confluency

Imagini microscopice ale celulelor CHO: la o densitate celulară ridicată (stânga) și la o densitate celulară de aproximativ 50% (dreapta).

Comparație între liniile celulare CHO și CHO-K1

De când linia celulară CHO originală a fost descrisă în 1956, au fost create numeroase variante ale acesteia pentru diverse scopuri. CHO-K1 a fost generată dintr-o singură clonă de celule CHO în 1957, iar CHO-DXB11 (cunoscută și sub numele de CHO-DUKX) a fost creată ulterior prin mutageneză cu metansulfonat de etil. Cu toate acestea, utilitatea lor a fost limitată din cauza capacității lor de a reveni la activitatea DHFR atunci când erau mutagene. Ulterior, celulele CHO au fost mutagene cu radiații gamma pentru a produce CHO-DG44, în care ambele alele DHFR au fost eliminate în totalitate. Aceste tulpini cu deficit de DHFR necesită glicină, hipoxantină și timidină pentru creștere și sunt utilizate pe scară largă pentru producția industrială de proteine. De atunci, au devenit populare și alte sisteme de selecție, iar celulele gazdă precum CHO-K1, CHO-S și CHO-Pro minus s-au dovedit a produce niveluri ridicate de proteine. Datorită instabilității genetice, aceste linii celulare sunt adesea cultivate în medii fără componente animale sau definite chimic, în bioreactoare de cultură în suspensie. Au fost discutate, de asemenea, complexitățile geneticii celulelor CHO și derivarea clonală.

Deblocați descoperiri cu ajutorul celulelor noastre CHO

Zece sfaturi pentru cultivarea celulelor CHO

  1. Linia celulară CHO este o linie celulară care necesită puțină întreținere și este ușor de cultivat.
  2. Celulele CHO au un timp de dublare a populației rapid, de 14–17 ore.
  3. Celulele CHO sunt aderente și cresc sub formă de monostraturi sau pot fi adaptate pentru a crește în suspensie.
  4. Subcultivați celulele CHO la o confluență de 80–90% folosind Accutase.
  5. Însămânțați celulele CHO la o densitate de 1 x 104 celule/cm2 pentru a obține un monostrat confluent în aproximativ 4 zile.
  6. Pentru o cultivare optimă, utilizați un amestec 50:50 de DMEM și Ham's F12 suplimentat cu 5% FBS și L-glutamină.
  7. Reînnoiți mediul de creștere de 2-3 ori pe săptămână.
  8. Cultivați celulele CHO într-un incubator umidificat, suplimentat cu 5% CO2, la 37 °C.
  9. Depozitați celulele CHO în vapori de azot lichid sau în fază lichidă (-196 °C).
  10. Respectați ghidul de biosecuritate de nivel 1 pentru manipularea și cultivarea liniei celulare CHO.

Protocoale, videoclipuri și publicații recente despre celulele CHO

Iată câteva resurse excelente pe care le puteți consulta pentru a afla mai multe despre cultivarea și întreținerea liniei celulare CHO.

  1. Un protocol extins de cultură celulară privind celulele CHO: acest link vă poate ajuta să aflați totul despre subcultivarea și transfecția celulelor CHO.
  2. Celule CHO: Acest site vă va oferi informații de bază privind cultura celulară a liniei celulare CHO, inclusiv divizarea, depozitarea, congelarea și decongelarea celulelor etc.
  3. Decongelarea celulelor CHO: Acest videoclip prezintă un protocol exemplar de decongelare a celulelor CHO congelate.

Protocoale de transfecție pentru linia celulară CHO

Celulele CHO sunt foarte receptive atât la transfecția tranzitorie, cât și la cea stabilă a genelor. Iată câteva resurse care oferă informații utile despre protocoalele de transfecție a liniei celulare CHO.

430,00 EUR*

Conținut: 1.5 milliliter

Prețuri fără taxe plus costuri de expediere

cryovial
Numărul produsului: 603479

Publicații de cercetare interesante care utilizează celule CHO

Următoarele sunt rezumate ale diverselor studii care au utilizat celule CHO:

  1. Studiu: „Producția rapidă și cu randament ridicat a ectodomeniului spike SARS-CoV-2 complet prin expresia genică tranzitorie în celule CHO” (2021)

    • Scop: Exprimarea ectodomeniului spike SARS-CoV-2 în celule CHO utilizând trei metode de transfecție tranzitorie pentru o productivitate ridicată.
    • Metodologie: Celulele CHO au fost transfectate cu plasmide care codifică ectodomeniul spike SARS-CoV-2 complet, utilizând trei metode de transfecție tranzitorie. Expresia proteinei a fost evaluată prin ELISA și Western blot.
    • Concluzii cheie: Toate cele trei metode de transfecție tranzitorie au arătat niveluri ridicate de expresie proteică, cel mai mare randament fiind obținut prin metoda polietileniminei.

  2. Studiu: „Proiectarea unei linii celulare CHO stabile pentru exprimarea unui antigen al vaccinului împotriva coronavirusului MERS” (2018)

    • Scop: Producerea antigenului coronavirusului MERS în celule CHO pentru a fi utilizat ca viitor candidat la vaccin.
    • Metodologie: Celulele CHO au fost transfectate cu un plasmid care codifică antigenul coronavirusului MERS și selectate pentru expresie stabilă folosind geneticină. Expresia proteică a fost evaluată prin ELISA și Western blot.
    • Concluzii cheie: Linia celulară CHO stabilă a prezentat niveluri ridicate de expresie proteică și stabilitate pe parcursul mai multor pasaje.

  3. Studiu: „Activitatea citotoxică a acizilor grași din macroalge antarctice asupra creșterii celulelor canceroase mamare umane” (2018)

    • Scop: Utilizarea celulelor CHO ca martor pentru evaluarea toxicității agenților anticancerigeni asupra celulelor normale.
    • Metodologie: Celulele CHO au fost cultivate și tratate cu acizi grași din macroalge antarctice, iar viabilitatea celulară a fost evaluată folosind testul MTT.
    • Concluzii cheie: Acizii grași din macroalge antarctice nu au prezentat efecte citotoxice asupra celulelor CHO, sugerând o potențială utilizare ca agent anticancer cu selectivitate pentru celulele canceroase.

  4. Studiu: „Knockout-ul genei caspazei-7 îmbunătățește expresia proteinei recombinante în linia celulară CHO prin oprirea ciclului celular în faza G2/M” (2022)

    • Scop: Manipularea genetică a celulelor CHO pentru a îmbunătăți expresia proteinelor recombinante.
    • Metodologie: Gena caspazei-7 a fost eliminată din celulele CHO folosind tehnologia CRISPR/Cas9, iar expresia proteinei a fost evaluată prin Western blot și microscopie de fluorescență.
    • Concluzii cheie: Eliminarea genei caspazei-7 din celulele CHO a dus la îmbunătățirea expresiei proteice, probabil datorită opririi ciclului celular în faza G2/M cauzată de pierderea caspazei-7.

  5. Studiu: „Dezvoltarea unei linii celulare CHO pentru producția stabilă de anticorpi recombinanți împotriva MMP9 uman” (2015)

    • Scop: Producerea de anticorpi monoclonali împotriva proteinei MMP9 umane în celule CHO.
    • Metodologie: Celulele CHO au fost transfectate cu plasmide care codifică anticorpul împotriva MMP9 uman și selectate pentru expresie stabilă folosind geneticină. Expresia proteinei a fost evaluată prin ELISA și Western blot.
    • Concluzii cheie: Linia celulară CHO stabilă a prezentat niveluri ridicate de expresie a anticorpului și stabilitate pe parcursul mai multor pasaje, sugerând o potențială utilizare în aplicații terapeutice care vizează MMP9 uman.

Întrebări frecvente despre celulele CHO

Celulele CHO (Chinese Hamster Ovary) sunt un tip de linie celulară derivată din ovarul de hamster chinezesc. Acestea sunt utilizate pe scară largă în cercetarea biologică și medicală în diverse scopuri, inclusiv producția de proteine recombinante, studiul funcției genelor și dezvoltarea de medicamente terapeutice.
Celulele CHO sunt preferate pentru producția de proteine datorită capacității lor de a efectua modificări post-translaționale similare cu cele din celulele umane. Astfel, este mai probabil ca proteinele produse de celulele CHO să fie similare cu proteinele umane în structură și funcție, ceea ce este important pentru aplicațiile terapeutice.
Celulele CHO se pretează la transfecție, procesul de introducere a ADN-ului străin în celule, deoarece acestea preiau și exprimă cu ușurință gene străine. Acest lucru le face ideale pentru studiile privind expresia genelor și producția de proteine recombinante.
Celulele CHO sunt utilizate în mod obișnuit pentru producerea de anticorpi, deoarece pot fi modificate pentru a produce niveluri ridicate de anticorpi și pot efectua modificări posttraducționale asemănătoare cu cele umane, asigurându-se că anticorpii sunt funcționali și mai puțin susceptibili de a fi recunoscuți ca străini de sistemul imunitar uman.
Celulele CHO sunt importante în cercetarea biotehnologică și farmaceutică datorită versatilității lor în exprimarea unei game largi de proteine, compatibilității cu procesarea proteinelor umane și scalabilității în procesele de producție, ceea ce le transformă într-o piatră de temelie în dezvoltarea produselor biofarmaceutice.
Celulele CHO au devenit comune datorită geneticii lor stabile, ușurinței de cultivare, productivității ridicate și capacității de a reproduce cu acuratețe modificările proteinelor umane, ceea ce le face o alegere fiabilă și eficientă pentru producția de proteine la scară industrială.
Celulele CHO produc lactat ca produs secundar al glicolizei anaerobe, o cale metabolică care furnizează energie în condiții de oxigen scăzut sau atunci când cererea de energie depășește capacitatea de fosforilare oxidativă. Producția de lactat este, de asemenea, influențată de ingineria metabolică a celulelor pentru a optimiza creșterea și ratele de producție.
Avantajele celulelor CHO includ capacitatea acestora de a efectua modificări post-translaționale complexe, scalabilitate ridicată și robustețe în diferite condiții de cultivare. Dezavantajele pot include riscul de contaminare virală, procesarea complexă și costisitoare necesară în aval și diferențele potențiale față de modelele de glicozilare umane.
Celulele CHO au nevoie de glutamină ca nutrient esențial pentru producerea de energie, biosinteza proteinelor și a nucleotidelor și ca sursă de carbon în ciclul TCA, susținând creșterea și menținerea celulelor.
Celulele CHO sunt eucariote, capabile de modificări post-translaționale și utilizate pentru producerea de proteine complexe. Celulele E. coli sunt procariote, utilizate pentru producerea de proteine mai simple, cu randament ridicat, dar nu dispun de mecanismele necesare pentru modificări post-translaționale avansate.
Celulele HEK 293 sunt celule de rinichi embrionar uman cunoscute pentru eficiența ridicată a transfecției și procesarea proteinelor de tip uman, în timp ce celulele CHO sunt derivate din celule ovariene de hamster și sunt favorizate pentru creșterea robustă și scalabilitatea lor în producția de proteine.
Celulele CHO necesită adesea ser în mediul lor de creștere pentru o creștere și productivitate optime, furnizând hormonii, factorii de creștere și nutrienții necesari, deși au fost dezvoltate medii fără ser pentru aplicații specifice.
Celulele CHO pot fi modificate pentru a fi recombinante, ceea ce înseamnă că au fost modificate genetic pentru a exprima gene străine, ceea ce le face un instrument cheie în producerea de proteine recombinante pentru uz terapeutic.
Da, celulele CHO pot fi modificate pentru a secreta niveluri ridicate de anticorpi, ceea ce le face o alegere principală pentru producerea de anticorpi monoclonali terapeutici.
Celulele transformă piruvatul în lactat în condiții anaerobe sau atunci când cererea de energie depășește capacitatea de fosforilare oxidativă mitocondrială, permițând glicolizei să continue să producă ATP și NAD.

Referințe

  1. Reinhart, D., et al., Bioprocesarea celulelor recombinante CHO-K1, CHO-DG44 și CHO-S: gazdele de expresie CHO favorizează fie producția de anticorpi monoclonali, fie sinteza biomasei. Biotechnology journal, 2019. 14(3): p. 1700686.
  2. Pan, X., et al., Caracterizarea metabolică a unei faze de creștere a dimensiunii celulelor CHO în culturi fed-batch. Microbiologie aplicată și biotehnologie, 2017. 101: p. 8101–8313.
  3. Turilova, V.I., T.S. Goryachaya și T.K. Yakovleva, Linia celulară de ovar de hamster chinezesc DXB-11: instabilitate cromozomială și heterogenitate cariotipică. Cytogenetica moleculară, 2021, 14(1): p. 1–12.
  4. Hunter, M. și colab., optimizarea expresiei proteice în celulele mamifere. Protocoale actuale în știința proteinelor, 2019. 95(1): p. e77.
  5. Nyon, M.P., et al., Ingineria unei linii celulare CHO stabile pentru expresia unui antigen de vaccin împotriva coronavirusului MERS. Vaccine, 2018. 36(14): p. 1853–1862.
  6. Pacheco, B.S., et al., Activitatea citotoxică a acizilor grași din macroalge antarctice asupra creșterii celulelor canceroase mamare umane. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology, 2018. 6: p. 185.
  7. Ryu, J., et al., Dezvoltarea unei linii celulare CHO pentru producția stabilă de anticorpi recombinanți împotriva MMP9 uman. BMC biotechnology, 2022. 22(1): p. 8.

 

Acest site utilizează module cookie pentru a vă asigura că beneficiați de cea mai bună experiență pe site-ul nostru... Mai multe informații.
- Imprint

Am detectat că vă aflați într-o altă țară sau că utilizați o altă limbă de browser decât cea selectată în prezent. Doriți să acceptați setările sugerate?

Închidere