HaCaT-cellen - Biologie en ziekte van de huid onderzoeken
HaCaT-cellen zijn afgeleid van menselijke keratinocyten van de opperhuid en worden vaak gebruikt om de homeostase van de opperhuid en daarmee samenhangende pathologieën te onderzoeken. Deze cellen worden beschouwd als spontaan geïmmortaliseerde menselijke keratinocyten, wat opmerkelijk is omdat ze zijn afgeleid van normale huidkeratinocyten zonder crisis of groeiachterstand. Deze unieke oorsprong geeft HaCaT-cellen een set genetische en groei-eigenschappen die verschillen van andere cellijnen. Ondanks het feit dat de HaCaT-cellijn in vitro een getransformeerd fenotype vertoont met klonogene eigenschappen op agar of plastic, blijft deze niet-tumorigeen. HaCaT-cellen zijn de eerste stabiele epitheelcellijn van volwassen menselijke huid met een normale differentiatie en vormen een waardevol instrument voor het onderzoeken van de regulatie van keratinisatie in menselijke cellen. Deze cellen hebben een breed scala aan toepassingen dankzij hun vermogen om effectief te prolifereren en differentiëren in vitro.
- Kenmerken van HaCaT-cellen
- Genetische kenmerken en oorsprong van HaCaT-cellen
- Hoe HaCaT-cellen te oogsten in 5 eenvoudige stappen
- Toepassingen van HaCaT-cellen
- Aanbevolen video's: De wereld van HaCaT-cellen verkennen
1.kenmerken van HaCaT-cellen
HaCaT-cellen kunnen worden gekweekt onder omstandigheden met weinig calcium en zien er spoelvormig uit zonder cel-naar-cel tight junctions, zoals primaire cellen die onder dezelfde omstandigheden worden bewaard. In de normale opperhuid ontwikkelen keratinocyten zich vanuit stamcellen in de basale laag en doorlopen de doornige en korrelige lagen voordat ze de hoornlaag bereiken en in de omgeving desquamen. Dit strak gereguleerde evenwicht tussen proliferatie en afschilfering resulteert in volledige vernieuwing of verandering om de 28 dagen, een complex proces dat keratinisatie wordt genoemd. Dit proces is sterk gereguleerd en gaat gepaard met duidelijke veranderingen in genexpressie, structureel ontwerp en enzymatische activiteit. Voor in vitro en in vivo analyse moeten HaCaT-cellen de epidermale keratines behouden die kenmerkend zijn voor de gedifferentieerde lagen van menselijke epidermiscellen, die essentieel zijn voor het behoud van de structurele integriteit en veerkracht van de huid. Hoewel sequentiële chromosomale veranderingen kunnen optreden in HaCaT-cellen, zijn deze mogelijk niet gekoppeld aan significante differentiatieproblemen en tonen ze in plaats daarvan de spontane transformatie van menselijke volwassen keratinocyten in vitro aan.
2.genetische kenmerken en oorsprong van HaCaT-cellen
HaCaT-cellen zijn een spontaan geïmmortaliseerde menselijke keratinocytencellijn afkomstig van volwassen huid en vertegenwoordigen een uniek evolutionair pad. Deze cellen bezitten mutaties in beide allelen van het p53-gen, wat typerend is voor mutaties geïnduceerd door UV-straling [3,4]. Daarnaast wordt aangenomen dat HaCaT-cellen zijn ontstaan door p53 tumorsuppressorgenmutaties, gevolgd door het verlies van senescentiegenen [5].
Het tumorsuppressorgen p53, dat bekend staat om zijn rol bij DNA-reparatie en als bewaker van het genoom, induceert de reactie van de menselijke huid op DNA-schade [4]. Er is waargenomen dat HaCaT-cellen hun beschermingsmechanisme tegen DNA-beschadiging gedeeltelijk hebben verloren door de in vivo mutatie van het p53-gen, waardoor ze gevoelig zijn voor accumulerende cytogenetische veranderingen als reactie op verhoogde kweektemperaturen. Een ander mechanisme om HaCaT-cellen te immortaliseren heeft te maken met een verhoogde telomerase enzymactiviteit [7]. In normale cellen worden de telomeren continu korter bij elke celdeling totdat cellulaire senescentie wordt bereikt. Telomerase is een gespecialiseerd cellulair enzymcomplex met reverse transcriptase activiteit dat de lengte van telomeren stabiel houdt. HaCaT-cellen daarentegen vertonen een significant verhoogde telomeraseactiviteit, wat resulteert in een goed behouden telomeerlengte. Deze observaties bevestigen de rol van telomerase in het immortalisatieproces van HaCaT-cellen.
Er zijn drie specifieke chromosomale translocaties geïdentificeerd die resulteren in het verlies van één kopie van chromosoomarmen 3p, 4p en 9p, een winst van 9q en isochromosoomvorming. Het verlies van de korte arm van chromosoom 3p kan leiden tot het verlies van senescentiegenen en de immortalisatie van HaCaT-cellen [8]. HaCaT-cellen zijn hypodiploïd en bezitten afzonderlijke en stabiele merkerchromosomen die hun monoklonale oorsprong vertegenwoordigen. De kenmerken en het hoofd van de HaCaT-cellijn werden bevestigd met behulp van DNA-fingerprinting met hypervariabele minisatellietmarkers [3-6].
3.haCaT-cellen oogsten in 5 eenvoudige stappen
- Verwijder het kweekmedium en spoel de adherente cellen af met 3-5 ml PBS zonder calcium en magnesium voor T25-flesjes of 5-10 ml voor T75-flesjes.
- Voeg 1-2 ml vers bereide 0,05% EDTA-oplossing toe per T25-kolf of 2,5 ml per T75-kolf, zorg ervoor dat het hele celblad bedekt is en incubeer 10 minuten bij 37 °C.
- Voeg 1 ml vers bereide trypsine/EDTA-oplossing (0,05%/0,025%) toe per T25-kolf of 2,5 ml per T75-kolf en zorg ervoor dat het celblad volledig bedekt is. De cellen moeten binnen 1-2 minuten loskomen.
- Stop de trypsineactiviteit door een FBS-bevattend celkweekmedium toe te voegen.
- Breng de cellen over in nieuwe kolven met vers celkweekmedium.
4. Toepassingen van HaCaT-cellen
HaCaT-cellen zijn een waardevol hulpmiddel voor het bestuderen van keratinocyten [9]. Deze onsterfelijke cellen functioneren als preneoplastische cellen en kunnen inzicht geven in veranderingen die betrokken zijn bij kwaadaardige en neoplastische transformatie [10]. Monolayer HaCaT-celculturen zijn essentieel voor cellulaire toxiciteit en in vitro analyse van wondgenezing. HaCaT-cellen kunnen ook gebruikt worden om huidtoxiciteit veroorzaakt door verschillende agentia en neoplastische of inflammatoire processen te beoordelen. Ze kunnen gebruikt worden om verschillende mechanismen van cutane allergische reacties, de effecten van reactieve zuurstofspecies en UV-straling te analyseren. Na stimulatie kunnen HaCaT-cellen differentiëren en specifieke differentiatiemarkers tot expressie brengen, zoals involucrin, K14 en K10. HaCaT-cellen worden ook vaak gebruikt als model voor het bestuderen van de pathofysiologie van epidermale homeostase [6].
HaCaT-cellen behouden hun vermogen om na transplantatie in vivo een gestructureerde epidermis te reconstrueren, wat resulteert in een gelaagde epidermale structuur die kan worden omgekeerd tussen een basale en gedifferentieerde toestand door veranderingen in de calciumconcentratie in het medium. Deze cellen maken ook de karakterisatie van verschillende biologische processen mogelijk, zoals het gebruik als vitamine D modelsysteem en het metabolisme in de huid. Omdat HaCaT-cellen niet genetisch gemanipuleerd zijn, geven ze een onbevooroordeeld beeld van het brede spectrum van initiële genetische gebeurtenissen in de menselijke huid.
5. Aanbevolen video's: De wereld van HaCaT-cellen verkennen
"Migratie van HaCaT-cellen": Deze video laat het proces van celmigratie in HaCaT-cellen zien. De migratie van cellen is een essentieel proces voor verschillende biologische processen, zoals wondgenezing en kankermetastase. De video demonstreert de beweging van HaCaT-cellen onder een microscoop en geeft een visuele voorstelling van hoe deze cellen migreren. De activiteit van de cellen wordt geobserveerd terwijl ze van de ene naar de andere locatie bewegen en de video geeft een duidelijke illustratie van de veranderingen die tijdens dit proces in de cellen plaatsvinden.
"Scratch Assay uitgevoerd op HaCaT cellen": Deze video toont een Scratch Assay uitgevoerd op HaCaT-cellen. De Scratch Assay is een veelgebruikte techniek om celmigratie te bestuderen, en in dit geval wordt het gebruikt om de migratie van HaCaT-cellen te analyseren. De video demonstreert het proces van het maken van een kras op het oppervlak van een celkweekschaaltje, dat vervolgens onder een microscoop wordt geobserveerd terwijl HaCaT-cellen migreren en het gat na verloop van tijd sluiten.
"Celgroei van HaCaT keratinocyten voor wondgenezingsexperimenten": Deze video demonstreert het proces van celgroei van HaCaT keratinocyten voor wondgenezingsexperimenten. HaCaT keratinocyten zijn een veelgebruikte cellijn in onderzoeken naar wondgenezing.
"HaCaT-cellendifferentiatie": Deze video laat de noodzakelijke stappen zien om HaCaT-cellen te differentiëren. HaCaT-cellen kunnen differentiëren in verschillende soorten huidcellen. De video demonstreert de veranderingen in HaCaT-cellen tijdens hun differentiatie, waarbij de verschillende markers en kenmerken van differentiatie visueel worden weergegeven. Het differentiatieproces is cruciaal voor het normaal functioneren van de huid en de video belicht de verschillende stadia van differentiatie die HaCaT-cellen ondergaan.
Referenties
- Angel P en Karin M: De rol van Jun, Fos en het AP-1 complex in celproliferatie en -transformatie. Biochim Biophys Acta 1072:129-157, 1991 Argyris TS: The regulation of epidermal hyperplastic growth. Crit Rev Toxicol 9:151-200, 1981
- Baden HP, Kubilus J, Kvedar JC, Steinberg ML, Wolman SR: Isolation and characterization of a spontaneously arising long-lived line of human keratinocytes (NM-1). In Vitro Cell Dev Biol 23(3):205-13, 1987
- Lehmann TA, Modali R, Boukamp P, Stanek J, Bennett WP, Welsh JA, Metcalf RA, Stampfer MR, Fusenig NE, Rogan EM, Harriss CC: p53-mutaties in menselijke geïmmortaliseerde epitheelcellijnen. Carcinogenesis 14:833-839, 1993
- Ziegler A-M, Leffell DJ, Kunala S, Sharma HW, Gailani M, Simon JA, Halperin AJ, Baden HP, Shapiro PE, Bale AE, Brash DE: Mutation hotspots due to sunlight in the p53 gene of nonmelanoma skin cancer. Proc Natl Acad Sci USA 90:4216-4220, 1993
- Fusenig NE, Boukamp P. Multiple stages and genetic alterations in immortalization, malignant transformation, and tumor progression of human skin keratinocytes. Mol Carcinog. 1998;23(3):144-158.
- Harle-Bachor C, Boukamp P: Telomerase activity in the regenerative basal layer of the epidermis in human skin and in immortal and carcinoma-derived skin keratinocytes. Proc Natl Acad Sci USA 93:6476-81, 1996
- Colombo I, Sangiovanni E, Maggio R, et al. HaCaT-cellen als betrouwbaar in vitro differentiatiemodel om de inflammatoire/herstelrespons van menselijke keratinocyten te ontleden. Mediators Inflamm. 2017;2017:7435621.
- Boukamp, P. et al. Normal keratinization in a spontaneously immortalized aneuploid human keratinocyte cell line. J. Cell Biol. 106, 1996, 761-771.
- Gibbs, Graham: Analysing qualitative data. De Sage kwalitatieve onderzoekskit. Londen: Sage 978-0-7619-4980-0.
- Hedrick TE, Bickman L, Rog DJ. 1993. Toegepast onderzoeksontwerp: een praktische gids. Sage: Londen
- Boukamp P. Petrussevska R. T. Breitkreutz D. Hornung J. Markham A. Fusenig N. E. Normal keratinization in a spontaneously immortalized aneuploid human keratinocyte cell line. E. Normal keratinization in a spontaneously immortalized aneuploid human keratinocyte cell line. Cell Biol.(1988);106:761-771.