Uitgebreide gids voor het invriezen van cellen: Levensvatbaarheid en steriliteit garanderen

Het invriezen van cellen is een cruciaal proces in het beheer van celkweken, dat zorgt voor langdurige opslag en behoud van waardevolle cellijnen. Of er nu wordt gewerkt met menselijke of dierlijke cellen, het volgen van nauwkeurige protocollen en het handhaven van strikte aseptische technieken zijn van het grootste belang voor een succesvolle cryopreservatie.

Deze gids biedt gedetailleerde instructies over de benodigde materialen, reagentia en stapsgewijze procedures om cellen effectief in te vriezen met behoud van hun levensvatbaarheid en steriliteit. Door zich aan deze richtlijnen te houden, kunnen onderzoekers vol vertrouwen celculturen opslaan en later weer tot leven wekken met minimaal verlies van levensvatbaarheid van de cellen, waardoor de integriteit en betrouwbaarheid van hun experimentele resultaten behouden blijft.

Om te beginnen is het essentieel om een steriele werkomgeving te creëren. Juiste aseptische technieken spelen een cruciale rol bij het voorkomen van besmetting en het verzekeren van de steriliteit van de culturen.

Aseptische techniek

Volg tijdens het hele proces aseptische technieken om de steriliteit van de kweken te garanderen.

Uitgebreid celbevriesproces

Dit stroomschema biedt een gedetailleerde visuele handleiding voor de essentiële stappen die nodig zijn om cellen op de juiste manier in te vriezen. Volg deze procedures om een hoge levensvatbaarheid en integriteit van de cellen te garanderen tijdens het cryoconserveringsproces.

Voorbereiding invriesmedium

Bereid het cryoprotectieve invriesmedium voor volgens het celtype:

FBS-bevattende mediaculturen: 90% FBS + 10% DMSO of 70% groeimedium, 20% FBS en 10% DMSO
Cellen die glycerol nodig hebben: 90% FBS + 10% glycerol

Overweeg de aanschaf van ons voorgeformuleerde diepvriesmedium:

Invriesmedium CM-1: Voor protocollen die een medium met foetaal runderserum (FBS) vereisen
Invriesmedium CM-ACF - serumvrij: Voor een FBS-vrij alternatief

Etikettering en documentatie

Etiketteer cryovials met de volgende gegevens:

Datum
Naam onderzoeker
Celnummer
Passagenummer
Type cel
Eventuele aanvullende informatie (bijv. genetische modificaties)

Voorbereiding van de cel

Voor adherente cellen:

Bewaak de cellen totdat ze 85-95% confluentie bereiken
Zuig het oude kweekmedium af
Spoel de celmonolaag met calcium- en magnesiumvrije PBS
Maak de cellen los met Accutase, trypsine of trypsine-EDTA en neutraliseer indien nodig met kweekmedium
Breng de celsuspensie over in een 50 mL Falcon-buis

Voor suspensiecellen:

Controleer de celdichtheid en gezondheid onder een microscoop
Breng de celsuspensie direct over in een 50 mL Falcon-buis

Celtelling en centrifugatie

Tel de cellen met een hemocytometer of geautomatiseerde celteller
Centrifugeer bij 300 g gedurende 3-5 minuten bij kamertemperatuur om de cellen te pelleteren
Zuig het supernatant voorzichtig op en vermijd verstoring van de celpellet
Verwarm de bereide invriesmedia tot 37°C voor gebruik

Cryopreservatie

Resuspendeer de celpellet in de vriesmedia tot een dichtheid van 2,0 miljoen cellen/mL voor adherente cellen en 5 miljoen cellen/mL voor suspensiecellen, of de gewenste concentratie
Aliquoteer 1,0 ml (of meer indien nodig) van de celsuspensie in geëtiketteerde cryovials
Gebruik een methode voor langzaam invriezen voordat de cellen worden overgebracht naar langdurige opslag

? Methode	? Stappen
❄️ Handmatig invriezen	1️⃣ Plaats cellen in vriesmedium in een vriezer van 4°C gedurende 40 minuten. 2️⃣ Overbrengen naar een vriezer van -80°C gedurende 24 uur. 3️⃣ Bewaar de cellen in vloeibare stikstof voor langdurige bewaring
? Mr. Frosty gebruiken	1️⃣ Bereid cellen voor in cryovials met vriesmedium. 2️⃣ Plaats cryovials in de Mr. Frosty container. 3️⃣ Bewaar bij -80°C gedurende 24 uur alvorens over te hevelen naar vloeibare stikstof
? Vriezer met geregelde snelheid	1️⃣ Programmeer het apparaat om de temperatuur geleidelijk te laten dalen. 2️⃣ Plaats de geprepareerde cellen in de vriezer. 3️⃣ Breng de cellen na de vriescyclus over in vloeibare stikstof

Bewaar de cryovials bij temperaturen lager dan -130°C of in vloeibare stikstof voor langdurige bewaring.

Materialen en reagentia

1-2 ml cryovials
CoolCell® invriesapparaat of vriezer met geregelde snelheid
Cryoprotectief invriesmedium (bijv. doe-het-zelf cryoprotectieve media, CM-1, CM-ACF of gespecialiseerde media)
Fetaal runderserum (FBS) of geconditioneerde media
DMSO of glycerol
Calcium- en magnesiumvrije PBS
Accutase, trypsine of trypsine-EDTA (voor adherente cellen)
15 ml of 50 ml Falcon-buizen
Hemocytometer of geautomatiseerde celteller
Centrifuge