Gepubliceerd: 2023 | Laatst herzien: mei 2026

Technieken voor het losmaken van celculturen

Dissociatie van celculturen is een cruciale stap in het onderhoud van celculturen. Hierbij worden cellen losgemaakt van hun groeisurface om subcultivering of oogsting mogelijk te maken. In dit gedeelte worden twee belangrijke methoden beschreven: het gebruik van enzymvrije dissociatiebuffers en het gebruik van enzymatische reagentia.

Gebruik van enzymvrije dissociatiebuffers

Deze methode is zacht en behoudt de cellulaire integriteit zonder het gebruik van enzymen:

1. Voorbereiding
   • Zorg ervoor dat alle reagentia voor gebruik zijn opgewarmd tot 37 °C om schok voor de cellen te voorkomen.
2. Verwijderen van het groeimedium:
   • Verwijder het oude groeimedium uit het kweekvat.
3. Spoelen
   • Spoel de celmonolagen met 5 ml calcium- en magnesiumvrij PBS per T75-kolf of 100 mm-schaal.
   • Schud het vat voorzichtig gedurende 30 tot 60 seconden bij kamertemperatuur.
   • Zuig de spoeloplossing op en gooi deze weg.
   • Herhaal deze spoelstap nog eenmaal.
4. Dissociatie
   • Voeg ongeveer 5 ml enzymvrije celdissociatiebuffer toe aan het vat.
   • Schud voorzichtig gedurende 1 tot 2 minuten bij kamertemperatuur en controleer de dissociatie onder een microscoop.
   • Tik de kolf of schaal tegen de hand om de cellen los te maken indien nodig.
   • Als de cellen hechten, laat ze dan nog 2 tot 5 minuten bij kamertemperatuur staan en tik indien nodig nogmaals, waarbij u meer dissociatiebuffer gebruikt.
   • Zodra de cellen loskomen, voegt u ten minste 5 ml compleet groeimedium toe om de dissociatiebuffer te neutraliseren en de cellen opnieuw in suspensie te brengen.
5. Controle van de levensvatbaarheid
   • Controleer de levensvatbaarheid van de cellen tijdens het subcultiveren en zorg ervoor dat deze boven de 90% blijft.

Gebruik van andere reagentia voor dissociatie

Bij deze methode kunnen verschillende dissociatiereagentia worden gebruikt:

1. Verwijdering van gebruikt medium
   • Gooi het oude medium uit het kweekvat weg.
2. Cellen wassen
   • Was de cellen met een gebalanceerde zoutoplossing zonder calcium en magnesium, of gebruik EDTA.
   • Voeg de wasoplossing voorzichtig toe aan de kant tegenover de cellen en schud het vat gedurende 1 tot 2 minuten voordat u de wasoplossing weggooit.
3. Dissociatie
   • Breng 2 tot 3 ml van de gekozen dissociatieoplossing aan per 25 cm² kweekoppervlak, waarbij u ervoor zorgt dat de cellaag volledig bedekt is.
   • Incubeer het vat bij 37 °C en schud zachtjes. Dissociatie vindt doorgaans plaats binnen 5 tot 15 minuten, afhankelijk van de cellijn.
   • Bij hardnekkige cellen kan het proces worden versneld door zachtjes tegen het vat te tikken.
   • Observeer de cellen zorgvuldig om overmatige blootstelling en mogelijke schade te voorkomen.
4. Cellen oogsten
   • Zodra de cellen volledig los zijn, laat u ze op de bodem van het vat verzamelen door het rechtop te zetten.
   • Voeg compleet medium toe, verspreid de cellen vervolgens en verzamel ze door over de cellaag te pipetteren.
   • Tel de cellen en ga verder met het subcultiveren.

Bij beide methoden is het belangrijk om door middel van empirische observatie de optimale omstandigheden voor elke cellijn te bepalen. Het proces moet de levensvatbaarheid van de cellen behouden, die tijdens het subcultiveren routinematig moet worden gecontroleerd en hoger dan 90% moet zijn. Deze procedures bieden een basis die onderzoekers kunnen aanpassen aan de specifieke vereisten en kenmerken van hun cellijnen.

Overzicht van technieken voor het subcultiveren van hechtende cellen

Voor een effectieve subcultivering van hechtende cellen moeten deze loskomen van het kweekvat. Er worden verschillende methoden gebruikt, elk geschikt voor verschillende celtypen en omstandigheden. Bij het kiezen van een dissociatiemethode is het cruciaal om rekening te houden met de specifieke behoeften van de cellijn en de doelstellingen van het experiment. Regelmatige controle van de levensvatbaarheid van de cellen, met als doel een percentage van meer dan 90% op het moment van subcultivering, is essentieel voor de voortdurende gezondheid en productiviteit van de kweek. Hier volgt een overzicht van deze procedures: