Technieken voor dissociatie van celkweek

Losmaken van celkweek is een kritieke stap in het onderhoud van celkweken. Hierbij worden cellen losgemaakt van hun groeioppervlak om subculturen of oogsten mogelijk te maken. In dit hoofdstuk worden twee belangrijke methoden beschreven: het gebruik van enzymvrije dissociatiebuffers en het gebruik van enzymatische reagentia.

1.enzymvrije buffers voor celdissociatie gebruiken

Deze methode is zacht en behoudt de cellulaire integriteit zonder het gebruik van enzymen:

1. Voorbereiding
   • Zorg ervoor dat alle reagentia voor gebruik tot 37°C zijn opgewarmd om een schok voor de cellen te voorkomen.
2. Verwijderen van groeimedium
   • Gooi het oude groeimedium uit het kweekvat.
3. Spoelen
   • Spoel de celmonolagen met 5 ml calcium- en magnesiumvrije PBS per T75-kolf of 100 mm schaal.
   • Schud het vat zachtjes gedurende 30 tot 60 seconden bij kamertemperatuur.
   • Zuig de spoeloplossing op en gooi deze weg.
   • Herhaal deze spoelstap nog een keer.
4. Dissociatie
   • Voeg ongeveer 5 ml enzymvrije celdissociatiebuffer toe aan het vat.
   • Schud zachtjes bij kamertemperatuur gedurende 1 tot 2 minuten en controleer dissociatie onder een microscoop.
   • Tik zo nodig met de kolf of schaal tegen de hand om de cellen los te maken.
   • Als de cellen aan elkaar vastzitten, laat ze dan nog 2 tot 5 minuten langer bij kamertemperatuur zitten en klop zo nodig opnieuw met meer dissociatiebuffer.
   • Zodra de cellen zijn losgemaakt, voeg dan ten minste 5 ml compleet groeimedium toe om de dissociatiebuffer te neutraliseren en resuspendeer de cellen.
5. Levensvatbaarheidscontrole
   • Controleer de levensvatbaarheid van de cellen tijdens de subcultuur en zorg ervoor dat deze boven 90% blijft.

2.andere reagentia voor dissociatie gebruiken

Bij deze methode kunnen verschillende dissociatiereagentia worden gebruikt:

1. Verwijdering van gebruikt medium
   • Gooi de oude media uit het kweekvat.
2. Cellen wassen
   • Was de cellen met een gebalanceerde zoutoplossing zonder calcium en magnesium, of gebruik EDTA.
   • Voeg de wasoplossing voorzichtig toe aan de kant tegenover de cellen en schommel 1 tot 2 minuten met het vat voordat u de wasoplossing weggooit.
3. Dissociatie
   • Breng 2 tot 3 ml van de gekozen dissociatieoplossing per 25 cm² groeioppervlak aan, zodat het celblad wordt bedekt.
   • Incubeer het vat bij 37 °C en schommel voorzichtig. Dissociatie treedt gewoonlijk op binnen 5 tot 15 minuten, afhankelijk van de cellijn.
   • Bij hardnekkige cellen kan kloppen op het vat het proces versnellen.
   • Observeer de cellen zorgvuldig om overbelichting en mogelijke schade te voorkomen.
4. Cellen oogsten
   • Zodra de cellen volledig zijn losgemaakt, laat u ze verzamelen op de bodem van het vat door het rechtop te zetten.
   • Voeg volledige media toe, dispergeer en verzamel de cellen door over de cellaag te pipetteren.
   • Tel de cellen en ga verder met de subcultuur.

Bij beide methoden is het belangrijk om de optimale omstandigheden voor elke cellijn te bepalen door empirische observatie. Het proces moet de levensvatbaarheid van de cellen behouden, die tijdens de subcultuur routinematig gecontroleerd moet worden op meer dan 90%. Deze procedures bieden een basis voor onderzoekers om aan te passen op basis van de specifieke vereisten en eigenschappen van hun cellijnen.

3.overzicht van technieken voor subculturen van adherente cellen

Om adherente cellen effectief te subcultureren, moeten ze worden losgemaakt van het kweekvat. Er worden verschillende methoden gebruikt, elk geschikt voor verschillende celtypen en omstandigheden. Bij het kiezen van een losmaakmethode is het cruciaal om rekening te houden met de specifieke behoeften van de cellijn en de doelen van het experiment. Regelmatige controle van de levensvatbaarheid van de cellen, met als doel meer dan 90% op het moment van subcultuur, is essentieel voor de blijvende gezondheid en productiviteit van de kweek. Hier volgt een overzicht van deze procedures: