Coltura di cellule di mammifero: Fondamenti e tecniche
La coltura cellulare di mammifero è una tecnica fondamentale nella ricerca biologica, che consente agli scienziati di studiare le cellule in un ambiente controllato al di fuori degli organismi viventi. Questo processo prevede l'isolamento delle cellule dai tessuti, il loro mantenimento in condizioni attentamente controllate e la loro propagazione per vari scopi sperimentali. La coltura di cellule di mammifero è fondamentale per comprendere i processi cellulari, i meccanismi delle malattie e lo sviluppo di nuove terapie, comprese quelle che utilizzano linee cellulari immortali
Aspetti salienti:
- Le cellule possono essere isolate dai tessuti utilizzando metodi di digestione enzimatica o di coltura di espianto
- Le cellule primarie hanno una durata limitata, mentre le linee cellulari immortali possono proliferare indefinitamente
- Le condizioni di coltura, compresa la composizione del terreno di coltura, sono fondamentali per la sopravvivenza e la proliferazione delle cellule
- Le cellule possono essere coltivate in sospensione o in coltura aderente, a seconda del tipo e delle esigenze di ricerca
- I terreni di coltura più comuni sono MEM, DMEM e RPMI 1640, ognuno dei quali è adatto a tipi di cellule specifici
- Le condizioni di crescita tipiche prevedono una temperatura di 37°C, 5% di CO2 e 95% di umidità relativa
- Le alternative al siero, come il lisato piastrinico umano (hPL), sono sempre più utilizzate per evitare potenziali problemi di contaminazione
Tecniche di isolamento cellulare
Il processo di creazione di una coltura cellulare inizia con l'isolamento delle cellule dai tessuti. Esistono diversi metodi per raggiungere questo obiettivo, ciascuno adatto a diversi tipi di tessuto e obiettivi di ricerca. Per i campioni di sangue, l'isolamento delle cellule è relativamente semplice: i globuli bianchi sono l'obiettivo principale della coltura, grazie alle loro capacità di crescita. I tessuti solidi richiedono tecniche di isolamento più complesse. Un metodo comune è la digestione enzimatica, in cui enzimi come la collagenasi, la tripsina o la pronasi vengono utilizzati per rompere la matrice extracellulare, liberando le singole cellule in sospensione. In alternativa, i ricercatori possono utilizzare il metodo della coltura di espianto, in cui piccoli pezzi di tessuto vengono posti direttamente nei terreni di coltura, permettendo alle cellule di migrare e proliferare. La scelta tra questi metodi dipende spesso dal tipo di tessuto specifico, dalla popolazione cellulare desiderata e dall'uso sperimentale previsto. È importante notare che le cellule isolate direttamente da un organismo sono definite cellule primarie e, con alcune eccezioni come le cellule derivate da un tumore, hanno in genere una durata di vita limitata in coltura prima di subire la senescenza
Prodotti essenziali per la coltura di cellule di mammifero
| Nome del prodotto | Numero del prodotto | Categoria | Applicazione |
|---|---|---|---|
| DMEM, w: 4,5 g/L di glucosio, w: 4 mM di L-Glutammina, w: 1,5 g/L di NaHCO3, w: 1,0 mM di piruvato di sodio | 820300a | Terreni di coltura | Terreno di coltura generico per vari tipi di cellule di mammifero |
| DMEM:Ham's F12 (1:1), w: 3,1 g/L di glucosio, w: 1,6 mM di L-Glutammina, w: 15 mM di HEPES, w: 1,0 mM di Sodio piruvato, w: 1,2 g/L di NaHCO3 | 820400a | Terreni di coltura | Adatto per un'ampia gamma di cellule di mammifero, in particolare per le cellule epiteliali |
| RPMI 1640, w: 2,1 mM di glutammina stabile, w: 2,0 g/L NaHCO3 | 820700a | Terreni di coltura | Comunemente usato per cellule linfoidi e linee cellulari ibride |
| Accutase | 830100 | Dissociazione cellulare | Soluzione delicata per il distacco delle cellule aderenti |
| Terreno di congelamento CM-1 | 800150 | Crioconservazione | Per il congelamento e la conservazione a lungo termine di cellule di mammifero |
| Terreno di congelamento CM-ACF, senza siero | 800650 | Crioconservazione | Terreno privo di componenti animali per il congelamento delle cellule |
| PBS | 860015 | Soluzione tampone | Per lavare le cellule e mantenere l'equilibrio del pH |
| Terreno di crescita per cellule endoteliali | 820731 | Terreno specializzato | Ottimizzato per la coltura di cellule endoteliali |
| Test del micoplasma | 900159 | Controllo di qualità | Essenziale per rilevare la contaminazione da micoplasma nelle colture |
| Autenticazione di linee cellulari - Umane | 900154 | Controllo di qualità | Verifica l'identità delle linee cellulari umane |
Questa tabella rappresenta una selezione di prodotti essenziali per la coltura di cellule di mammifero. Per la nostra gamma completa di prodotti per la coltura cellulare, compresi i terreni e i reagenti specializzati, visitate la nostra pagina della categoria Media e Reagenti.
Accutase è una soluzione per il distacco cellulare pronta all'uso e filtrata sterilmente, progettata come alternativa delicata alla tripsina/EDTA per la dissociazione delle cellule mammifere aderenti da strumenti standard in plastica per coltura tissutale e da superfici rivestite per l'adesione. Combina l'attività degli enzimi proteolitici e collagenolitici in una soluzione salina bilanciata per garantire una dissociazione efficace ma controllata, preservando le proteine della superficie cellulare e favorendo un'elevata vitalità post-passaggio e un rapido riattaccamento.
La formulazione di Accutase si basa sulla soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco (DPBS) con EDTA e rosso fenolo come indicatore visivo del pH. Gli enzimi sono di origine non mammifera e non batterica, rendendo Accutase particolarmente adatto alla ricerca sulle cellule staminali, ai flussi di lavoro relativi ai vaccini e a qualsiasi applicazione in cui sia necessario ridurre al minimo i contaminanti di origine animale o microbica. La soluzione si autoinibisce a 37 °C, quindi dopo il distacco non sono necessari reagenti neutralizzanti o terreni di coltura contenenti siero: le cellule possono essere trasferite direttamente in un terreno fresco.
Caratteristiche principali
Liquido 1x filtrato sterile pronto all'uso – non richiede diluizione o ricostituzione
Attività enzimatica combinata proteolitica e collagenolitica per una dissociazione delicata
Ogni lotto è standardizzato a un'attività di dissociazione definita per garantire l'uniformità tra i lotti
Enzimi di origine non mammifera e non batterica
Autoinibizione a 37 °C – non è necessaria alcuna soluzione neutralizzante
Formulato in PBS di Dulbecco con EDTA
Fenolo rosso incluso come indicatore visivo del pH
pH 6,8 – 7,8
Applicazioni tipiche
Accutase dissocia delicatamente un'ampia varietà di tipi di cellule aderenti e sensibili, tra cui cellule staminali embrionali umane (hESC), cellule staminali pluripotenti indotte umane (iPSC), cellule staminali neurali, neuroni primari e linee aderenti coltivate di routine come HeLa, HEK 293, CHO, MDCK, Vero, NIH/3T3, BHK-21 e A549. I casi d'uso tipici includono:
Subcoltura e passaggi di routine di cellule mammifere aderenti
Delicata dissociazione di singole cellule di hESC, iPSC e altre linee sensibili
Preparazione dei campioni per la citometria a flusso e l'analisi FACS
Analisi dei marcatori di superficie cellulare in cui l'integrità dell'epitopo è fondamentale
Test di migrazione, proliferazione e apoptosi cellulare
Test di quiescenza mediante privazione di siero e studi di trasfezione di oncogeni
Test di migrazione delle cellule tumorali e delle cellule della cresta neurale
Aumento della produzione nei flussi di lavoro dei bioreattori
Per il lavoro di routine, applicare circa 10 ml di Accutase per 75 cm2 di superficie di coltura e incubare per 5-10 minuti a temperatura ambiente. Il tempo di incubazione ottimale deve essere determinato per ciascuna linea cellulare e non deve superare un'ora. Prima dell'aggiunta, risciacquare lo strato cellulare con una soluzione salina priva di Ca2+/Mg2+, come il DPBS senza calcio e magnesio, per rimuovere il siero residuo e i cationi bivalenti.
Manipolazione e conservazione
Conservare il flacone chiuso congelato a -15 °C o a temperature inferiori. Scongelare a temperatura ambiente o durante la notte a una temperatura compresa tra +2 °C e +8 °C. Non scongelare Accutase in un bagno d’acqua a 37 °C, poiché le temperature elevate riducono l’attività enzimatica. Dopo lo scongelamento, la soluzione può essere conservata per un massimo di 2 mesi a una temperatura compresa tra +2 °C e +8 °C; non conservare a temperatura ambiente. Non preriscaldare il reagente a 37 °C prima dell'applicazione: aggiungerlo direttamente alle cellule lavate a temperatura ambiente. Per una conservazione a lungo termine, si raccomanda l'aliquotazione monouso per evitare cicli di scongelamento ripetuti. Lavorare sempre in condizioni asettiche.
Qualità
Prodotto secondo rigorosi standard di qualità. Ogni lotto di Accutase viene filtrato in modo sterile e testato per sterilità, pH, aspetto e attività di dissociazione per garantire prestazioni costanti e riproducibili da lotto a lotto.
Specifiche del prodotto
Specifiche
Dettagli
Tipo di prodottoReagente per il distacco/la dissociazione cellulare
FormatoLiquido filtrato sterile, pronto all'uso
Volume100 ml
Concentrazione di lavoro1x (pronto all'uso)
Attività enzimaticaProteolitica e collagenolitica combinata
Origine dell'enzimaNon mammifera e non batterica
Sistema tamponePBS di Dulbecco con EDTA
Indicatore di pHRosso fenolo
Intervallo di pH6,8 – 7,8
AspettoSoluzione limpida, di colore da rosso pallido ad arancione
Temperatura di conservazione-15 °C o inferiore
Stabilità dopo lo scongelamentoFino a 2 mesi a una temperatura compresa tra +2 °C e +8 °C
Volume d'uso raccomandato~10 ml per 75 cm² di superficie di coltura
Tempo di incubazione tipico5 – 10 minuti a temperatura ambiente
Condizioni di spedizioneCongelato in ghiaccio secco
Destinazione d'usoSolo per uso di ricerca e ulteriore produzione
Formulazione (Composizione per litro)
Componente
Concentrazione (mg/L)
Sali inorganici
Cloruro di sodio (NaCl)8000,00
Idrogenofosfato disodico (Na2HPO4)1150,00
Cloruro di potassio (KCl)200,00
Dihidrogenofosfato di potassio (KH2PO4)200,00
Altri componenti
EDTA · 4Na (EDTA tetrasodico)220,00
Rosso fenolo3,00
Miscela enzimatica brevettata (attività proteolitica e collagenolitica)1x
Accutase è un marchio registrato di Innovative Cell Technologies, Inc.
La soluzione salina fosfato-bufferata (PBS) è una soluzione tampone ampiamente utilizzata nella ricerca biologica e chimica. Svolge un ruolo cruciale nel mantenere l'equilibrio del pH e l'osmolarità durante varie procedure sperimentali, tra cui l'elaborazione dei tessuti e la coltura cellulare. La nostra soluzione PBS è formulata meticolosamente con ingredienti di elevata purezza per garantire stabilità e affidabilità in ogni esperimento. L'osmolarità e le concentrazioni di ioni del nostro PBS imitano fedelmente quelle del corpo umano, rendendolo isotonico e non tossico per la maggior parte delle cellule.
Composizione della nostra soluzione PBS
La nostra soluzione PBS è una miscela regolata in base al pH di tamponi fosfatici e soluzioni saline di grado ultrapuro. A una concentrazione di lavoro 1X, contiene:
8000 mg/L di cloruro di sodio (NaCl)
200 mg/L Cloruro di potassio (KCl)
1150 mg/L Fosfato di sodio bibasico anidro (Na2HPO4)
200 mg/L Fosfato di potassio monobasico anidro (KH2PO4)
Questa composizione garantisce un pH e un equilibrio ionico ottimali, adatti a un'ampia gamma di applicazioni biologiche.
Applicazioni della nostra soluzione PBS
La nostra soluzione PBS è ideale per diverse applicazioni nella ricerca biologica. Le sue proprietà isotoniche e non tossiche la rendono adatta alla diluizione delle sostanze e al risciacquo dei contenitori cellulari. Le soluzioni PBS contenenti EDTA sono efficaci per staccare le cellule attaccate e raggrumate. Tuttavia, i metalli divalenti come lo zinco non devono essere aggiunti al PBS, poiché possono causare precipitazioni. In questi casi, si consiglia di utilizzare i tamponi Good's. Inoltre, la nostra soluzione di PBS è un'alternativa accettabile al terreno di trasporto virale per il trasporto e la conservazione dei virus a RNA, compreso il SARS-CoV-2.
Controllo di qualità
Filtrato sterile
Conservazione e durata di conservazione
Conservare a +2°C a +25°C, al riparo dalla luce.
Una volta aperto, conservare a 2°C
- 25°C e utilizzare entro 24 mesi.
Condizioni di spedizione
Temperatura ambiente
Manutenzione
Conservare in frigorifero a +2°C a +8°C al buio. Evitare il congelamento e il riscaldamento frequente a +37°C, in quanto riduce la qualità del prodotto.
Non riscaldare il terreno di coltura oltre i 37°C e non utilizzare fonti di calore non controllate come le microonde.
Se si deve utilizzare solo una parte del terreno di coltura, prelevare la quantità necessaria e riscaldarla a temperatura ambiente prima dell'uso.
Composizione
Categoria
Componenti
Concentrazione (mg/L)
Sali
Cloruro di potassio
200
Potassio fosfato monobasico anidro
200
Cloruro di sodio
8000
Sodio fosfato bibasico anidro
1150
Metodo di analisi
Il CLS offre test a breve e a lungo termine per il rilevamento dei micoplasmi. Nel primo caso, i campioni vengono analizzati immediatamente dopo l'arrivo, mentre nel secondo viene avviata una coltura cellulare e le cellule vengono analizzate dopo 14 giorni di coltivazione senza antibiotici. L'analisi del micoplasma viene eseguita utilizzando un sistema di rilevamento a due punti con il PlasmoTest™
- Mycoplasma Detection Kit (Invivogen) e il Certus QC
- mycoADVANCED kit (Certus).
Campioni
Per il test rapido, fornire una sospensione cellulare di almeno 50 µl contenente 50.000 cellule. La sospensione cellulare può essere spedita a temperatura ambiente.
Per il test premium, fornire un minimo di 1 milione di cellule in un terreno di coltura idoneo per garantire una coltura robusta e sana per la coltivazione e il successivo test delle cellule. I campioni devono essere spediti con ghiaccio secco.
Compilare il modulo per il test del micoplasma e allegarlo alla spedizione dei campioni.
Test colorimetrico reporter
Questo test è un'analisi colorimetrica basata sulle cellule. In presenza di micoplasma, una linea cellulare reporter induce una cascata di segnalazione che innesca un cambiamento di colore nel terreno di coltura da rosso a blu. Il test viene eseguito in piastre multipozzetto da 96 pozzetti. I segnali vengono rilevati in uno spettrofotometro per micropiastre a 620-655 nm. Vengono rilevate tutte le specie di micoplasma e acoleplasma, ma anche altri contaminanti nella coltura cellulare come i batteri.
Amplificazione isotermica
L'amplificazione isotermica è un test rapido e affidabile basato sull'amplificazione isotermica del DNA specifico del micoplasma, combinata con la rilevazione in tempo reale mediante un colorante intercalare del DNA. Il test è in grado di rilevare sei delle specie più comuni che rappresentano >95% delle contaminazioni: M.orale, M.hyorhinis, M.arginini, M.fermentans, M.hominis e A.laidlawii. Grazie all'omologia di sequenza, vengono rilevate anche altre specie di micoplasmi (M.pneumoniae, M.gallisepticum e M.synoviae). Per identificare se il campione è positivo o negativo al micoplasma, viene studiata la temperatura di fusione (Tm).
Conclusioni: Il ruolo centrale della coltura cellulare di mammifero nella ricerca moderna
La coltura cellulare di mammifero ha rivoluzionato la ricerca biologica e medica, fornendo agli scienziati strumenti potenti per studiare processi cellulari complessi, meccanismi di malattia e potenziali interventi terapeutici. Dall'isolamento di cellule primarie allo sviluppo di linee cellulari immortalizzate, questa tecnica è diventata una parte indispensabile del moderno kit di strumenti scientifici
Il viaggio della coltura delle cellule di mammifero inizia con accurate tecniche di isolamento, progredisce attraverso il mantenimento meticoloso delle cellule in mezzi specializzati e culmina in un'ampia gamma di applicazioni in vari campi di studio. Che si tratti di ricerca sul cancro, di scoperta di farmaci o di biologia cellulare di base, la capacità di coltivare e manipolare le cellule di mammifero in vitro ha aperto strade senza precedenti per l'esplorazione scientifica
La chiave del successo della coltura cellulare di mammifero sono le condizioni attentamente controllate in cui le cellule vengono mantenute. Dalla composizione dei terreni di coltura ai precisi parametri ambientali degli incubatori, ogni aspetto è ottimizzato per imitare il più possibile le condizioni naturali delle cellule. Questa attenzione ai dettagli garantisce l'affidabilità e la riproducibilità degli esperimenti, una pietra miliare della buona pratica scientifica
Lo sviluppo di linee cellulari immortalizzate, come le cellule HeLa, ampiamente utilizzate, ha ulteriormente ampliato le possibilità della coltura cellulare. Queste linee cellulari forniscono modelli cellulari coerenti e prontamente disponibili che hanno accelerato la ricerca in numerose discipline
Guardando al futuro, la coltura cellulare dei mammiferi continua a evolversi. I progressi nelle tecniche di coltura 3D, lo sviluppo di organoidi e l'uso di terreni chimicamente definiti stanno spingendo i confini di ciò che è possibile fare nella coltura cellulare. Questi sviluppi promettono di portare i modelli in vitro ancora più vicini alla complessità dei sistemi in vivo, rivoluzionando potenzialmente la scoperta di farmaci, la medicina personalizzata e la nostra comprensione della biologia umana
In conclusione, la coltura di cellule di mammifero rimane una tecnica dinamica ed essenziale nella ricerca sulle scienze della vita. Il suo continuo perfezionamento e la sua applicazione giocheranno senza dubbio un ruolo cruciale nell'affrontare alcune delle domande più pressanti della biologia e della medicina, guidando il progresso scientifico per gli anni a venire