Cellule primarie umane

Cosa sono le cellule primarie umane?

Le cellule primarie rappresentano la forma più pura dei rispettivi tessuti. Vengono isolate dal tessuto e trattate in modo da potersi stabilizzare in un ambiente di coltura con condizioni ideali. Riproducono più fedelmente lo stato in vivo e mostrano una fisiologia normale poiché derivano dal tessuto stesso anziché essere modificate. Per questo motivo, possono fungere da modelli utili per la ricerca nel campo della farmacologia cellulare, della tossicologia e della fisiologia (compresi gli studi sul metabolismo, l’invecchiamento e la trasduzione del segnale). Va tenuto presente che le cellule primarie sono più difficili da coltivare e mantenere rispetto a una linea cellulare continua, poiché hanno una durata di vita più breve e smettono di dividersi (o senescono) dopo un certo numero di divisioni cellulari. Gli studi sulle vie di segnalazione cellulare sono complicati dalla variabilità intrinseca delle cellule primarie acquisite dai donatori e dalle pratiche di subcoltura. Prima di iniziare gli studi sulla segnalazione, i ricercatori spesso conducono uno screening per determinare se le cellule rispondono o meno agli stimoli comunemente utilizzati. Per evitare sprechi di tempo e denaro, le cellule primarie possono essere stimolate per attivare le principali vie di segnalazione prima di essere sottoposte a screening.

Perché utilizzare cellule primarie umane?

Le linee cellulari immortalizzate sono comunemente utilizzate come modello cellulare. Tuttavia, gli scienziati hanno riconosciuto che le alterazioni biologiche dovute alle linee cellulari possono essere dannose per lo studio del loro significato fisiologico. L’uso di cellule primarie umane migliora il valore fisiologico dei dati ottenuti tramite colture cellulari, e tali cellule sono sempre più considerate fondamentali per lo studio dei processi biologici, della progressione delle malattie e dello sviluppo di farmaci.

Le cellule primarie umane sono ampiamente utilizzate negli studi in vitro sulla comunicazione intercellulare e intracellulare, nella biologia dello sviluppo e nei meccanismi alla base del cancro, del morbo di Parkinson e del diabete, oltre che in molte altre aree di ricerca biologica preclinica e sperimentale. I ricercatori utilizzano da tempo linee cellulari immortalizzate per studiare la funzione dei tessuti; tuttavia, le linee cellulari con mutazioni evidenti e anomalie cromosomiche potrebbero non rappresentare un buon surrogato delle cellule normali e dello sviluppo della malattia nelle sue fasi iniziali. È ora possibile ottenere un modello più accurato di un tipo specifico di cellula tissutale utilizzando cellule primarie umane isolate da quel tessuto e mantenute in terreni di coltura e integratori specifici per cellule primarie.

Che cos’è la coltura cellulare primaria?

Anziché utilizzare linee cellulari immortalizzate, la coltura di cellule primarie prevede la crescita diretta delle cellule provenienti da un organismo multicellulare al di fuori del corpo. In alcuni paesi, come il Regno Unito, è legalmente riconosciuto il fatto che le colture di cellule primarie siano più rappresentative dei tessuti in vivo rispetto alle linee cellulari. Ciononostante, le cellule primarie necessitano del substrato e dei nutrienti adeguati per crescere e, dopo un certo numero di divisioni, sviluppano un fenotipo senescente che ne determina l’arresto definitivo della divisione. Questi due fattori motivano la creazione di linee cellulari. Sia le cellule primarie immortalizzate naturalmente (ad esempio, le cellule HeLa) sia quelle immortalizzate artificialmente (ad esempio, le cellule HEK) possono essere coltivate a tempo indeterminato in coltura cellulare.

Cellule primarie umane per tipo di tessuto

Le cellule epiteliali, i fibroblasti, i cheratinociti, i melanociti, le cellule endoteliali, le cellule muscolari, le cellule immunitarie e le cellule staminali, come le cellule staminali mesenchimali, sono tra le cellule primarie umane più comunemente utilizzate nella ricerca scientifica. Inizialmente, le colture sono eterogenee (rappresentano un mix dei tipi di cellule presenti nel tessuto) e possono essere mantenute in vita in vitro solo per un determinato periodo di tempo. La trasformazione è un processo in vitro che consente di manipolare le cellule primarie umane per ottenere subcolture illimitate. La trasformazione può avvenire naturalmente oppure può essere indotta da sostanze chimiche o virus. Dopo aver subito una trasformazione genetica, una coltura primaria può dividersi all’infinito dando origine a una linea cellulare secondaria immortalizzata, purché le vengano forniti nutrienti e spazio sufficienti.

Cellule endoteliali

Il trattamento del cancro, la guarigione delle ferite, la ricerca sulla segnalazione cellulare, lo screening ad alta produttività e ad alto contenuto e lo screening tossicologico sono solo alcune delle aree che possono trarre vantaggio dall’uso delle cellule endoteliali primarie come strumento di ricerca.

Keratinociti

I cheratinociti, derivati dall’epidermide della pelle umana adulta o dal prepuzio neonatale, svolgono un ruolo cruciale nello studio di malattie della pelle come la psoriasi e il cancro.

Cellule epiteliali

Dagli studi sul cancro alle indagini tossicologiche, le cellule epiteliali primarie si sono dimostrate risorse inestimabili per la modellizzazione delle difese naturali dell’organismo.

Fibroblasti

L’induzione di cellule staminali pluripotenti (iPS) e lo studio della guarigione delle ferite sono solo alcuni dei numerosi utilizzi dei fibroblasti primari.

Cellule immunitarie

Le cellule mononucleate del sangue periferico, abbreviate in PBMC, sono cellule mononucleate del sangue con un nucleo rotondo. Comprendono principalmente linfociti e monociti, che svolgono funzioni importanti nel corso di una risposta immunitaria. Le cellule mononucleate del sangue periferico vengono spesso utilizzate per diagnosticare infezioni o per verificare l’eventuale protezione vaccinale. La comprensione della risposta immunitaria cellulare mediata dai linfociti T è spesso fondamentale.

Melanociti

I melanociti, cellule cutanee specializzate che producono il pigmento melanina, sono utili come modelli per la ricerca su argomenti quali la guarigione delle ferite, la tossicità, il melanoma, la risposta cutanea alle radiazioni ultraviolette (UV), le malattie della pelle e i cosmetici.

Cellule staminali

Le cellule staminali hanno il potenziale di differenziarsi in un’ampia varietà di tipi cellulari. Grazie alla loro capacità di differenziazione, offrono nuove opportunità per la modellizzazione dei tessuti umani e delle condizioni di salute.

Cellule staminali mesenchimali

Le cellule staminali mesenchimali, note anche come MSC, possono essere ottenute da diverse fonti umane quali il midollo osseo, il tessuto adiposo, il tessuto del cordone ombelicale (gelatina di Wharton) e il liquido amniotico (il liquido che circonda il feto) e possono essere coltivate in vitro. Queste cellule staminali stromali adulte hanno la capacità di svilupparsi in un'ampia varietà di tipi cellulari. Alcuni di questi tipi cellulari includono cellule ossee, cellule cartilaginee, cellule muscolari, cellule neurali, cellule cutanee e cellule corneali.

Cellule muscolari lisce

All’interno degli organi cavi, le cellule muscolari lisce primarie (SMC) rivestono la parete interna e mediano la contrattilità. Oltre che per lo studio del cancro e di altre malattie, le SMC possono essere utilizzate per modellare la fibrosi ipertensiva.

Cellule primarie e linee cellulari

Sia per mutazione spontanea, come nelle linee cellulari tumorali trasformate, sia attraverso alterazioni intenzionali, come nella produzione artificiale di geni tumorali, le linee cellulari continue hanno acquisito la capacità di riprodursi all’infinito (immortalizzate). Di norma, le linee cellulari continue sono più affidabili e più pratiche da gestire rispetto alle cellule primarie. Possono espandersi all’infinito e fornire un rapido accesso a dati essenziali. L’uso delle linee cellulari continue presenta alcune limitazioni, tra cui il fatto che sono geneticamente modificate/trasformate, il che potrebbe alterarne le caratteristiche fisiologiche e renderle non corrispondenti alle condizioni in vivo, e che ciò può subire ulteriori cambiamenti nel tempo a seguito di un numero significativo di passaggi.

Progressi nella coltura delle cellule primarie

Le cellule primarie sono notoriamente difficili da manipolare. Il processo, tuttavia, sta diventando più semplice che mai grazie agli sviluppi nella coltura delle cellule primarie, alla disponibilità di cellule primarie commerciali con protocolli completamente ottimizzati e alle nuove tecniche di analisi che richiedono un minore impegno.

Il passaggio dalla coltura cellulare bidimensionale a quella tridimensionale è considerato una pietra miliare fondamentale nel settore. L’architettura specifica del tessuto, le interazioni cellula-cellula e la segnalazione meccanica/biochimica possono risultare attenuate in una coltura 2D. Pertanto, il valore biologico di queste colture presenta un limite massimo.

D’altra parte, la coltura cellulare 3D consente alle cellule di espandersi e interagire con una matrice extracellulare tridimensionale. Ciò permette alle cellule di interagire tra loro e con la matrice extracellulare, rendendo le colture 3D più rilevanti dal punto di vista fisiologico. L’accuratezza di questo metodo nel prevedere le risposte in vivo lo ha reso rivoluzionario in campi quali la scoperta e lo sviluppo di farmaci. Per questo motivo, tecnologie all’avanguardia, come gli organoidi derivati dai pazienti e gli “organi su chip”, forniscono modelli altamente contestualizzati per lo screening e lo sviluppo dei farmaci.

La generazione di cellule primarie rappresenta un collo di bottiglia nella coltura primaria. Per superare questo ostacolo è solitamente necessario un volume maggiore di tessuto, che può essere difficile da ottenere. Tuttavia, una maggiore sensibilità analitica sta aprendo nuove strade. Ad esempio, la necessità di coltivare grandi quantità di cellule primarie viene ridotta grazie all’uso della tecnologia a singola cellula, che comprende il sequenziamento, il western blotting e la citometria di massa.

Prospettive promettenti per la coltura di cellule primarie

Le difficoltà generali della coltura di cellule primarie vengono mitigate dai progressi tecnologici. A sua volta, questo metodo sta rapidamente sostituendo gli altri come gold standard nello studio e nella pratica della biologia cellulare e molecolare. La produzione di vaccini, la sostituzione di organi, le terapie con cellule staminali, la ricerca sul cancro e molto altro ancora trarranno grandi benefici dai continui progressi nella coltura di cellule primarie.

Consigli e suggerimenti sulla coltura di cellule primarie

Le esigenze della proliferazione cellulare

I due metodi più comuni per la coltura delle cellule primarie sono in sospensione o su una superficie (2D). Alcune cellule sono in grado di fluttuare liberamente nel flusso sanguigno senza mai aderire a una superficie (ad esempio quelle derivate dal sangue periferico). Sono state ingegnerizzate diverse linee cellulari per prosperare in colture in sospensione, dove possono raggiungere densità irraggiungibili in condizioni di crescita 2D. Le cellule primarie che necessitano di ancoraggio per crescere in vitro sono chiamate cellule aderenti e includono quelle presenti nei tessuti solidi. Per migliorare le proprietà di adesione e fornire altri segnali necessari alla crescita e alla differenziazione, queste cellule vengono tipicamente coltivate in un recipiente piatto di plastica non rivestito, ma occasionalmente su un micro-vettore. Quest’ultima opzione può essere rivestita con proteine della matrice extracellulare (come il collagene e la laminina). I terreni utilizzati nella coltura cellulare consistono in un terreno di base integrato con i fattori di crescita e le citochine appropriati. Un incubatore cellulare è un tipo speciale di incubatore da laboratorio utilizzato per coltivare e mantenere le cellule a una temperatura e a una miscela di gas specifiche (tipicamente 37 °C, 5% di CO₂ per le cellule dei mammiferi). A seconda del tipo di cellula coltivata, le condizioni ottimali possono variare notevolmente. A seconda dei tipi di cellule coltivate, il terreno di coltura ottimale presenterà una combinazione unica di fattori, tra cui, a titolo esemplificativo ma non esaustivo, il pH, la concentrazione di glucosio, i fattori di crescita e la presenza di altri nutrienti.

La presenza di antibiotici nel terreno di coltura è fondamentale durante l’avvio della coltura primaria per prevenire la contaminazione da parte del tessuto ospite. Alcuni regimi antibiotici prevedono una combinazione di gentamicina, penicillina, streptomicina e amfotericina B. Tuttavia, l’uso prolungato di antibiotici è sconsigliato, poiché alcuni reagenti (come l’amfotericina B) possono risultare tossici per le cellule nel lungo periodo.

La maggior parte delle cellule primarie subisce la senescenza e smette di dividersi dopo un certo numero di raddoppiamenti della popolazione, rendendo fondamentale mantenerle in vita dopo l’isolamento. La vitalità cellulare a lungo termine richiede tecniche di coltura cellulare specializzate e condizioni di coltura ideali (tra cui il terreno di coltura corretto, la temperatura adeguata, la miscela di gas appropriata, il pH corretto, la giusta concentrazione di fattori di crescita, la presenza di nutrienti e la presenza di glucosio). Poiché molti dei fattori di crescita utilizzati per integrare i terreni di coltura sono ottenuti dal sangue animale (gli ingredienti di origine ematica presentano un potenziale di contaminazione), si raccomanda di ridurne al minimo l’uso o di evitarlo del tutto. È inoltre importante utilizzare una tecnica asettica.

Sottocoltura e mantenimento

Quando le cellule isolate aderiscono alla superficie della piastra di coltura, ciò segna l’inizio della fase di mantenimento. L’adesione avviene in genere 24 ore dopo l’inizio della coltura. Le cellule dovrebbero essere sottoposte a subcoltura quando hanno raggiunto una certa percentuale di confluenza e si stanno replicando attivamente. Poiché le cellule post-confluenti possono subire differenziazione e mostrare una proliferazione più lenta dopo il passaggio, è preferibile effettuare la subcoltura delle colture cellulari primarie prima che raggiungano il 100% di confluenza.

La subcoltura in terreni di coltura freschi mantiene la crescita esponenziale delle cellule dipendenti dall’ancoraggio. La subcoltura dei monostrati interrompe le interazioni intercellulari e intracellulari a livello della superficie cellulare. Per estrarre le cellule primarie aderenti dai monostrati o dai tessuti si utilizzano basse concentrazioni di enzimi proteolitici, quali la tripsina/EDTA. Dopo essere state dissociate e diluite in una soluzione a singola cellula, le cellule vengono contate e trasferite in contenitori di coltura freschi per riattaccarsi e moltiplicarsi.

Crioconservazione e ripristino

La crioconservazione preserva le cellule vive congelandole a basse temperature. La crioconservazione e lo scongelamento delle cellule primarie umane prevengono la morte cellulare e i danni durante la conservazione e l’utilizzo. Le cellule primarie umane vengono crioprotette utilizzando DMSO o glicerolo (alla temperatura corretta e con una velocità di congelamento controllata). Il processo di congelamento deve essere progressivo, a -1 °C al minuto, per impedire la formazione di cristalli di ghiaccio. La conservazione a lungo termine richiede azoto liquido (-196 °C) o temperature inferiori a -130 °C.

Per scongelare le cellule crioconservate è sufficiente immergerle in un bagno d’acqua a 37 °C per circa 1–2 minuti. Le cellule primarie umane non devono essere centrifugate dopo lo scongelamento dal congelatore (poiché sono estremamente sensibili ai danni durante il recupero dalla crioconservazione). È indicato per la semina delle cellule immediatamente dopo lo scongelamento e favorisce l’adesione nelle colture durante le prime 24 ore successive alla semina. 1 Una volta che le cellule primarie crioconservate si sono attaccate, è necessario rimuovere il terreno di coltura esausto (poiché il DMSO è dannoso per le cellule primarie e può causare un calo della vitalità post-scongelamento).