Cellule primarie umane

Cosa sono le cellule primarie umane?

Le cellule primarie sono la rappresentazione più pura dei rispettivi tessuti. Vengono isolate dal tessuto e trattate in modo da potersi stabilire in un ambiente di coltura con condizioni ideali. Esse imitano più da vicino lo stato in vivo e mostrano una fisiologia normale perché sono derivate dal tessuto piuttosto che modificate. Per questo motivo, possono servire come modelli utili per la ricerca in farmacologia, tossicologia e fisiologia cellulare (compresi gli studi sul metabolismo, l'invecchiamento e la trasduzione del segnale). Tenete presente che le cellule primarie sono più difficili da coltivare e mantenere rispetto a una linea cellulare continua, perché hanno una durata di vita più breve e smettono di dividersi (o senescono) dopo un certo numero di divisioni cellulari. Gli studi sulle vie di segnalazione cellulare sono complicati dalla variabilità intrinseca delle cellule primarie acquisite da donatori e attraverso le pratiche di subcultura. Prima di iniziare gli studi di segnalazione, i ricercatori spesso conducono uno screening per determinare se le cellule rispondono o meno agli stimoli comunemente utilizzati. Per evitare di perdere tempo e denaro, le cellule primarie possono essere stimolate per attivare le principali vie di segnalazione prima di essere sottoposte a screening.

Perché usare cellule primarie umane?

Le linee cellulari immortalate sono comunemente utilizzate come saggio cellulare. Anche se gli scienziati hanno riconosciuto che i cambiamenti biologici dovuti alle linee cellulari possono essere dannosi per lo studio del loro significato fisiologico. L'uso di cellule primarie umane migliora il valore fisiologico dei dati ottenuti attraverso le colture cellulari e sono sempre più considerate importanti per lo studio dei processi biologici, del progresso delle malattie e dello sviluppo di farmaci.

Le cellule primarie umane sono ampiamente utilizzate negli studi in vitro sulla comunicazione intercellulare e intracellulare, sulla biologia dello sviluppo e sui meccanismi alla base del cancro, del morbo di Parkinson e del diabete, oltre che in molte altre aree di ricerca biologica preclinica e investigativa. I ricercatori utilizzano da tempo linee cellulari immortalizzate per studiare la funzione dei tessuti; tuttavia, le linee cellulari con evidenti mutazioni e anomalie cromosomiche possono non essere un buon surrogato delle cellule normali e dello sviluppo della malattia nelle sue fasi iniziali. Oggi è possibile ottenere un modello più accurato di un tipo di cellula di un tessuto specifico utilizzando cellule primarie umane isolate da quel tessuto e mantenute in mezzi di coltura cellulari primari e integratori.

Che cos'è la coltura cellulare primaria?

Invece di utilizzare linee cellulari immortalizzate, la coltura cellulare primaria prevede la coltivazione di cellule direttamente da un organismo multicellulare al di fuori del corpo. In alcuni Paesi, come il Regno Unito, esiste un riconoscimento legale del fatto che le colture cellulari primarie sono più rappresentative dei tessuti in vivo rispetto alle linee cellulari. Tuttavia, le cellule primarie hanno bisogno del substrato e dei nutrienti giusti per crescere e, dopo un certo numero di divisioni, sviluppano un fenotipo senescente che le porta a smettere definitivamente di dividersi. Questi due fattori motivano la creazione di linee cellulari. Sia le cellule primarie immortalizzate naturalmente (ad esempio, le cellule HeLa) che quelle immortalizzate artificialmente (ad esempio, le cellule HEK) possono essere coltivate indefinitamente in coltura cellulare.

Cellule primarie umane per tipi di tessuto

Cellule epiteliali, fibroblasti, cheratinociti, melanociti, cellule endoteliali, cellule muscolari, cellule immunitarie e cellule staminali come le cellule staminali mesenchimali sono tra le cellule primarie umane più comunemente utilizzate negli studi scientifici. Innanzitutto, le colture sono eterogenee (rappresentano un mix di tipi di cellule presenti nel tessuto) e possono essere mantenute in vita in vitro solo per un periodo di tempo specifico. La trasformazione è un processo in vitro che consente di manipolare le cellule primarie umane per un numero illimitato di sottocolture. La trasformazione può avvenire naturalmente o essere indotta da sostanze chimiche o virus. Dopo essere stata sottoposta a trasformazione genetica, una coltura primaria può dividersi indefinitamente in una linea cellulare secondaria immortalizzata, se le vengono forniti nutrienti e spazio sufficienti.

Cellule endoteliali

Il trattamento del cancro, la guarigione delle ferite, la ricerca sulla segnalazione cellulare, lo screening ad alto rendimento e ad alto contenuto e lo screening tossicologico sono solo alcune delle aree che possono trarre vantaggio dall'uso di cellule endoteliali primarie come strumento di ricerca.

Cheratinociti

I cheratinociti, derivati dall'epidermide della pelle umana adulta o del prepuzio neonatale, svolgono un ruolo cruciale nello studio di malattie della pelle come la psoriasi e il cancro.

Cellule epiteliali

Dagli studi sul cancro alle indagini tossicologiche, le cellule epiteliali primarie si sono rivelate risorse preziose per modellare le difese naturali dell'organismo.

Fibroblasti

L'induzione di cellule staminali pluripotenti (iPS) e lo studio della guarigione delle ferite sono solo alcuni dei molti usi dei fibroblasti primari.

Cellule immunitarie

Le cellule mononucleate del sangue periferico, in breve PBMC, sono cellule mononucleate del sangue con un nucleo cellulare rotondo. Comprendono principalmente linfociti e monociti, che assumono importanti funzioni nel corso di una risposta immunitaria. Le cellule mononucleate del sangue periferico sono spesso utilizzate per diagnosticare le infezioni o per individuare un'eventuale protezione vaccinale. La comprensione della risposta immunitaria cellulare mediata dalle cellule T è spesso cruciale.

Melanociti

I melanociti, le cellule specializzate della pelle che producono il pigmento melanina, sono utili come modelli per la ricerca su argomenti quali la guarigione delle ferite, la tossicità, il melanoma, la risposta cutanea alle radiazioni ultraviolette (UV), le malattie della pelle e i cosmetici.

Cellule staminali

Le cellule staminali hanno il potenziale per differenziarsi in un'ampia varietà di tipi di cellule. Grazie alla loro capacità di differenziazione, offrono nuove opportunità per modellare i tessuti umani e le condizioni di salute.

Cellule staminali mesenchimali

Le cellule staminali mesenchimali, note anche come MSC, possono essere ottenute da diverse fonti umane come il midollo osseo, il grasso (tessuto adiposo), il tessuto del cordone ombelicale (gelatina di Wharton) e il liquido amniotico (il liquido che circonda un feto) e possono essere espanse in vitro. Queste cellule staminali stromali adulte hanno la capacità di svilupparsi in un'ampia varietà di tipi di cellule. Alcuni di questi tipi di cellule includono cellule ossee, cartilaginee, muscolari, neurali, cutanee e corneali.

Cellule muscolari lisce

All'interno degli organi cavi, le cellule muscolari lisce primarie (SMC) rivestono l'interno e mediano la contrattilità. Oltre che per il cancro e altre malattie, le SMC possono essere utilizzate per modellare la fibrosi da ipertensione.

Cellule primarie e linee cellulari

Sia per mutazione spontanea, come nelle linee cellulari tumorali trasformate, sia per alterazione intenzionale, come nella produzione artificiale di geni tumorali, le linee cellulari continue hanno acquisito il potenziale di riprodursi all'infinito (immortalizzate). Di norma, le linee cellulari continue sono più affidabili e convenienti da trattare rispetto alle cellule primarie. Possono espandersi indefinitamente e fornire un rapido accesso ai dati essenziali. L'uso di linee cellulari continue ha alcune limitazioni, tra cui il fatto che sono geneticamente modificate/trasformate, il che potrebbe cambiare le caratteristiche fisiologiche e non corrispondere alla condizione in vivo, che può ulteriormente cambiare nel tempo con un significativo passaging.

Progressi nella coltura di cellule primarie

Le cellule primarie hanno la fama di essere difficili da lavorare. Il processo, tuttavia, sta diventando più semplice che mai grazie agli sviluppi della coltura cellulare primaria, alla disponibilità di cellule primarie commerciali con protocolli completamente ottimizzati e alle nuove tecniche di analisi che richiedono meno input.

Il passaggio dalla coltura cellulare bidimensionale a quella tridimensionale è considerato una pietra miliare nel campo. L'architettura specifica del tessuto, le interazioni cellula-cellula e la segnalazione meccanica/biochimica possono essere attenuate in una coltura 2D. Pertanto, il valore biologico di queste colture è limitato.

D'altra parte, la coltura cellulare 3D consente alle cellule di espandersi e interagire con una struttura extracellulare 3D. Ciò consente alle cellule di interagire tra loro e con la matrice extracellulare, rendendo le colture 3D più rilevanti dal punto di vista fisiologico. L'accuratezza di questo metodo nel prevedere le risposte in vivo lo ha reso rivoluzionario in campi come la scoperta e lo sviluppo di farmaci. Per questo motivo, le tecnologie più avanzate, come gli organoidi derivati da pazienti e gli organi su chip, forniscono modelli altamente contestuali per lo screening e lo sviluppo di farmaci.

La generazione di cellule primarie è un collo di bottiglia nella coltura primaria. Per superare questo problema è necessario un volume maggiore di tessuto, che può essere difficile da ottenere. Tuttavia, il miglioramento della sensibilità analitica sta fornendo una via d'uscita. Ad esempio, la necessità di coltivare grandi quantità di cellule primarie è ridotta dall'uso della tecnologia a singola cellula, che comprende il sequenziamento, il western blotting e la citometria di massa.

Prospettive promettenti per la coltura di cellule primarie

Le difficoltà generali della coltura di cellule primarie vengono mitigate dai progressi tecnologici. A sua volta, questo metodo sta rapidamente sostituendo gli altri come gold standard nello studio e nella pratica della biologia cellulare e molecolare. La produzione di vaccini, la sostituzione di organi, le terapie con cellule staminali, la ricerca sul cancro e molto altro ancora trarranno grande beneficio dai continui progressi della coltura cellulare primaria.

Consigli e suggerimenti per la coltura cellulare primaria

Le esigenze di espansione cellulare

I due metodi più comuni per coltivare le cellule primarie sono in sospensione o su una superficie (2D). Alcune cellule sono in grado di fluttuare liberamente nel flusso sanguigno senza mai aderire a una superficie (ad esempio quelle derivate dal sangue periferico). Diverse linee cellulari sono state ingegnerizzate per prosperare in colture in sospensione, dove possono raggiungere densità irraggiungibili in condizioni di crescita 2D. Le cellule primarie che necessitano di un ancoraggio per crescere in vitro sono chiamate cellule aderenti e comprendono quelle presenti nei tessuti solidi. Per migliorare le proprietà di adesione e fornire altri segnali necessari per la crescita e la differenziazione, queste cellule sono in genere coltivate in un recipiente piatto di plastica non rivestito, ma occasionalmente in un microportatore. Quest'ultimo può essere rivestito con proteine della matrice extracellulare (come collagene e laminina). Il terreno di coltura è costituito da un terreno di base integrato con fattori di crescita e citochine. Un incubatore di cellule è un tipo speciale di incubatore da laboratorio utilizzato per coltivare e mantenere le cellule a una temperatura e a una miscela di gas specifiche (in genere 37 °C, 5% di CO2 per le cellule di mammifero). A seconda del tipo di cellula in coltura, le condizioni ottimali possono essere molto diverse. A seconda dei tipi di cellule coltivate, il terreno di coltura ottimale avrà una combinazione unica di fattori, tra cui, ma non solo, il pH, la concentrazione di glucosio, i fattori di crescita e la presenza di altri nutrienti.

La presenza di antibiotici nel terreno di coltura è fondamentale durante l'allestimento della coltura primaria per evitare la contaminazione da parte del tessuto ospite. Alcuni regimi antibiotici prevedono una combinazione di gentamicina, penicillina, streptomicina e amfotericina B. L'uso di antibiotici per un periodo di tempo prolungato è tuttavia sconsigliato, perché alcuni reagenti (come l'amfotericina B) possono essere tossici per le cellule a lungo termine.

La maggior parte delle cellule primarie va incontro a senescenza e smette di dividersi dopo un certo numero di raddoppi di popolazione, per cui è fondamentale mantenerle in vita dopo l'isolamento. La vitalità cellulare a lungo termine richiede tecniche di coltura cellulare esperte e condizioni di coltura ideali (tra cui il giusto terreno di coltura, la giusta temperatura, la giusta miscela di gas, il giusto pH, la giusta concentrazione di fattori di crescita, la presenza di nutrienti e la presenza di glucosio). Poiché molti dei fattori di crescita utilizzati per integrare i terreni di coltura sono ottenuti da sangue animale (gli ingredienti derivati dal sangue hanno un potenziale di contaminazione), si raccomanda di ridurne al minimo l'uso o di evitarlo del tutto. È inoltre importante utilizzare una tecnica asettica.

Subcultura e mantenimento

Quando le cellule in isolamento aderiscono alla superficie del piatto di coltura, inizia la fase di mantenimento. L'adesione avviene in genere 24 ore dopo l'inizio della coltura. Le cellule devono essere subcoltivate quando hanno raggiunto una certa percentuale di confluenza e si stanno replicando attivamente. Poiché le cellule post-confluenti possono subire una differenziazione e mostrare una proliferazione più lenta dopo il passaggio, è meglio subcollocare le colture cellulari primarie prima che raggiungano il 100% di confluenza.

La subcoltura in terreni freschi mantiene la crescita esponenziale delle cellule dipendenti dall'ancoraggio. La subcoltura dei monostrati interrompe le interazioni intercellulari e intracellulari della superficie cellulare. Per estrarre le cellule primarie aderenti dai monostrati o dai tessuti si utilizzano basse concentrazioni di enzimi proteolitici, come la tripsina/EDTA. Dopo essere state dissociate e diluite in una soluzione monocellulare, le cellule vengono contate e trasferite in contenitori di coltura freschi per riattaccarsi e moltiplicarsi.

Crioconservazione e recupero

La crioconservazione preserva le cellule vive congelandole a basse temperature. La crioconservazione e lo scongelamento delle cellule primarie umane previene la morte e il danneggiamento delle cellule durante la conservazione e l'uso. Le cellule primarie umane vengono crioprotette utilizzando DMSO o glicerolo (alla temperatura corretta e con una velocità di congelamento controllata). Il processo di congelamento deve essere progressivo, a -1 °C ogni minuto, per evitare la formazione di cristalli di ghiaccio. La conservazione a lungo termine richiede azoto liquido (-196 °C) o temperature inferiori a -130 °C.

Per scongelare le cellule crioconservate è sufficiente immergere le cellule congelate in un bagno d'acqua a 37 °C per circa 1 o 2 minuti. Le cellule primarie umane non devono essere centrifugate dopo lo scongelamento dal congelatore (poiché sono estremamente sensibili ai danni durante il recupero dalla crioconservazione). È adatto per l'impianto di cellule subito dopo lo scongelamento e promuove l'attaccamento nelle colture durante le prime 24 ore dopo l'impianto. 1 Dopo che le cellule primarie crioconservate si sono attaccate, il terreno di coltura deve essere rimosso (poiché il DMSO è dannoso per le cellule primarie e può causare un calo della vitalità dopo lo scongelamento).