Guide complet de la congélation des cellules : Garantir la viabilité et la stérilité
La congélation des cellules est un processus essentiel dans la gestion des cultures cellulaires, assurant le stockage et la préservation à long terme de lignées cellulaires précieuses. Qu'il s'agisse de cellules humaines ou animales, il est essentiel de suivre des protocoles précis et de maintenir des techniques aseptiques strictes pour réussir la cryoconservation.
Ce guide fournit des instructions détaillées sur le matériel, les réactifs et les procédures étape par étape nécessaires pour congeler efficacement les cellules tout en préservant leur viabilité et leur stérilité. En respectant ces lignes directrices, les chercheurs peuvent stocker en toute confiance des cultures de cellules et les faire revivre ultérieurement avec une perte minimale de viabilité cellulaire, tout en préservant l'intégrité et la fiabilité de leurs résultats expérimentaux.
Pour commencer, il est essentiel d'établir un environnement de travail stérile. Des techniques aseptiques appropriées jouent un rôle crucial dans la prévention de la contamination et la garantie de la stérilité des cultures.
Technique aseptique
Suivez des techniques aseptiques tout au long du processus pour garantir la stérilité des cultures.
Processus complet de congélation des cellules
Cet organigramme fournit un guide visuel détaillé des étapes essentielles de la congélation correcte des cellules. Suivez ces procédures pour garantir la viabilité et l'intégrité des cellules pendant le processus de cryoconservation.
Préparation du milieu de congélation
Préparer le milieu de congélation cryoprotecteur en fonction du type de cellule :
- Cultures en milieu contenant du FBS : 90% FBS + 10% DMSO ou 70% milieu de croissance, 20% FBS et 10% DMSO
- Cellules nécessitant du glycérol : 90% FBS + 10% glycérol
Envisagez d'acquérir notre milieu de congélation préformulé :
- Milieude congélation CM-1: Pour les protocoles nécessitant un milieu contenant du sérum bovin fœtal (FBS)
- Milieu de congélation CM-ACF - sans sérum: Pour une alternative sans FBS
Étiquetage et documentation
Étiqueter les cryovials avec les détails suivants :
- Date
- Nom du chercheur
- Numéro de cellule
- Numéro de passage
- Type de cellule
- Toute information supplémentaire (par exemple, modifications génétiques)
Préparation des cellules
Pour les cellules adhérentes :
- Surveiller les cellules jusqu'à ce qu'elles atteignent 85-95% de confluence
- Aspirer l'ancien milieu de culture
- Rincer la monocouche cellulaire avec du PBS exempt de calcium et de magnésium
- Détacher les cellules avec de l'Accutase, de la trypsine ou de la trypsine-EDTA et neutraliser avec du milieu de culture si nécessaire
- Transférer la suspension cellulaire dans un tube Falcon de 50 ml
Pour les cellules en suspension :
- Vérifier la densité et la santé des cellules au microscope
- Transférer la suspension cellulaire directement dans un tube Falcon de 50 ml
Comptage des cellules et centrifugation
- Compter les cellules à l'aide d'un hémocytomètre ou d'un compteur de cellules automatisé
- Centrifuger à 300 g pendant 3 à 5 minutes à température ambiante pour culotter les cellules
- Aspirer le surnageant avec précaution, en évitant de perturber le culot cellulaire
- Réchauffer le milieu de congélation préparé à 37 °C avant de l'utiliser
Cryoconservation
- Remettre en suspension le culot cellulaire dans le milieu de congélation à une densité de 2 millions de cellules/mL pour les cellules adhérentes et de 5 millions de cellules/mL pour les cellules en suspension, ou à la concentration souhaitée
- Aliquoter 1,0 ml (ou plus si nécessaire) de la suspension cellulaire dans des cryovials étiquetés
- Utiliser une méthode de congélation lente avant de transférer les cellules vers un stockage à long terme
| ? Méthode | ? Etapes |
|---|---|
|
❄️ Congélation manuelle |
1️⃣ Placer les cellules dans un milieu de congélation dans un congélateur à 4°C pendant 40 minutes. 2️⃣ Transférer dans un congélateur à -80°C pendant 24 heures. 3️⃣ Stocker les cellules dans de l'azote liquide pour une conservation à long terme |
|
? Utilisation de M. Frosty |
1️⃣ Préparer les cellules dans des cryovials avec du milieu de congélation. 2️⃣ Placer les cryovials dans le récipient Mr. Frosty. 3️⃣ Conserver à -80°C pendant 24 heures avant de les transférer dans l'azote liquide |
|
? Congélateur à débit contrôlé |
1️⃣ Programmer l'appareil pour diminuer progressivement la température. 2️⃣ Placer les cellules préparées dans le congélateur. 3️⃣ Après le cycle de congélation, transférer les cellules dans l'azote liquide |
- Stocker les cryovials à des températures inférieures à -130°C ou dans l'azote liquide pour une conservation à long terme.
Matériel et réactifs
- flacons cryogéniques de 1 à 2 ml
- Unité de congélation CoolCell® ou congélateur à débit contrôlé
- Milieu de congélation cryoprotecteur (par exemple, milieu cryoprotecteur DIY, CM-1, CM-ACF ou milieu spécialisé)
- Sérum bovin fœtal (FBS) ou milieu conditionné
- DMSO ou glycérol
- PBS sans calcium ni magnésium
- Accutase, Trypsine ou Trypsine-EDTA (pour les cellules adhérentes)
- tubes Falcon de 15 ou 50 ml
- Hémocytomètre ou compteur de cellules automatisé
- Centrifugeuse