Kattava opas solujen jäädyttämiseen: Elinkelpoisuuden ja steriiliyden varmistaminen
Solujen pakastaminen on kriittinen prosessi soluviljelyn hallinnassa, jolla varmistetaan arvokkaiden solulinjojen pitkäaikainen varastointi ja säilyminen. Olipa kyse ihmis- tai eläinsoluista, tarkkojen protokollien noudattaminen ja tiukat aseptiset tekniikat ovat ensiarvoisen tärkeitä onnistuneen kryosäilytyksen kannalta.
Tässä oppaassa annetaan yksityiskohtaiset ohjeet tarvittavista materiaaleista, reagensseista ja vaiheittaisista menettelyistä, joiden avulla soluja voidaan pakastaa tehokkaasti säilyttäen niiden elinkelpoisuus ja steriiliys. Noudattamalla näitä ohjeita tutkijat voivat varmuudella säilyttää ja myöhemmin elvyttää soluviljelmiä siten, että solujen elinkelpoisuus heikkenee mahdollisimman vähän, ja säilyttää koetulosten eheyden ja luotettavuuden.
Aluksi on tärkeää luoda steriili työympäristö. Asianmukaiset aseptiset tekniikat ovat ratkaisevassa asemassa kontaminaation estämisessä ja viljelmien steriiliyden varmistamisessa.
Aseptinen tekniikka
Noudata aseptisia tekniikoita koko prosessin ajan varmistaaksesi viljelmien steriiliyden.
Kattava solujen jäädytysprosessi
Tämä vuokaavio tarjoaa yksityiskohtaisen visuaalisen oppaan solujen asianmukaiseen jäädyttämiseen liittyvistä olennaisista vaiheista. Noudattamalla näitä menettelyjä voit varmistaa solujen korkean elinkelpoisuuden ja eheyden kryosäilytysprosessin aikana.
Pakastusmediumin valmistelu
Valmistetaan kryosuojaava pakastusmedia solutyypin mukaan:
- FBS:ää sisältävät mediakulttuurit: 90 % FBS + 10 % DMSO tai 70 % kasvualusta, 20 % FBS ja 10 % DMSO
- Glyserolia vaativat solut: 90 % FBS + 10 % glyserolia
Harkitse valmiiksi formuloidun pakastusmediamme hankkimista:
- Jäädytysmedium CM-1: Protokollia varten, jotka edellyttävät naudan sikiöseerumia (FBS) sisältävää mediumia
- Jäädytysmedium CM-ACF - seerumiton: FBS-vapaata vaihtoehtoa varten
Merkintä ja dokumentointi
Merkitse kryopullot seuraavilla tiedoilla:
- Päivämäärä
- Tutkijan nimi
- Solun numero
- Läpiviennin numero
- Solutyyppi
- Mahdolliset lisätiedot (esim. geneettiset muutokset)
Solun valmistelu
Tarttuvien solujen osalta:
- Seurataan soluja, kunnes ne saavuttavat 85-95 %:n konfluenssin
- Vanha elatusaine imetään pois
- Huuhtele solun monokerros kalsium- ja magnesiumvapaalla PBS:llä
- Solut irrotetaan Accutase-, trypsiini- tai trypsiini-EDTA-valmisteella ja neutraloidaan tarvittaessa viljelyaineella
- Siirretään solususpensio 50 ml:n Falcon-putkeen
Suspension soluja varten:
- Tarkista solujen tiheys ja terveys mikroskoopilla
- Siirrä solususpensio suoraan 50 ml:n Falcon-putkeen
Solujen laskeminen ja sentrifugointi
- Lasketaan solut hemosytometrillä tai automaattisella solulaskurilla
- Sentrifugoi 300 g:n pyörimisnopeudella 3-5 minuuttia huoneenlämmössä solujen pelletöimiseksi
- Imeytä supernatantti varovasti välttäen solupelletin häiriintymistä
- Lämmitä valmistettu pakastusmedia 37 °C:een ennen käyttöä
Kryosäilytys
- Resuspendoidaan solupelletti pakastusmediassa tiheyteen 2,0 miljoonaa solua/ml adherenttien solujen osalta ja 5 miljoonaa solua/ml suspensiosolujen osalta tai haluamaasi pitoisuuteen
- Aliquotoidaan 1,0 ml (tai enemmän tarpeen mukaan) solususpensiota merkittyihin kryopulloihin
- Käytä hidasta pakastusmenetelmää ennen solujen siirtämistä pitkäaikaissäilytykseen
| ? Menetelmä | ? Vaiheet |
|---|---|
|
❄️ Manuaalinen jäädyttäminen |
1️⃣ Aseta solut pakastusmediumiin 4 °C:n pakastimeen 40 minuutiksi. 2️⃣ Siirretään -80 °C:n pakastimeen 24 tunniksi. 3️⃣ Säilytä solut nestemäisessä typessä pitkäaikaissäilytystä varten |
|
? Mr. Frostyn käyttäminen |
1️⃣ Valmistele solut kryopulloihin pakastusmediumin kanssa. 2️⃣ Aseta kryopullot Mr. Frosty -astiaan. 3️⃣ Säilytä -80 °C:ssa 24 tuntia ennen siirtämistä nestemäiseen typpeen |
|
? Säädetyn nopeuden pakastin |
1️⃣ Ohjelmoi laite laskemaan lämpötilaa asteittain. 2️⃣ Aseta valmistetut solut pakastimeen. 3️⃣ Siirrä solut pakastussyklin jälkeen nestemäiseen typpeen |
- Säilytä kryopullot alle -130 °C:n lämpötilassa tai nestemäisessä typessä pitkäaikaissäilytystä varten.
Materiaalit ja reagenssit
- 1-2 ml:n kryopullot
- CoolCell®-pakastusyksikkö tai säädellyn nopeuden pakastin
- Kryosuojaava pakastusmedia (esim. DIY-kryosuoja-aine, CM-1, CM-ACF tai erikoismedia)
- Naudan sikiön seerumi (FBS) tai ilmastoitu väliaine
- DMSO tai glyseroli
- Kalsium- ja magnesiumvapaa PBS
- Akkutaasi, trypsiini tai trypsiini-EDTA (tarttuville soluille)
- 15 ml:n tai 50 ml:n Falcon-putket
- Hemosytometri tai automaattinen solulaskuri
- Sentrifugi