Julkaistu: 2023 | Viimeksi tarkistettu: toukokuu 2026

Kattava opas solujen pakastamiseen: elinkelpoisuuden ja steriiliyden varmistaminen

Solujen pakastaminen on soluviljelyn hallinnassa kriittinen prosessi, joka varmistaa arvokkaiden solulinjojen pitkäaikaisen varastoinnin ja säilyttämisen. Työskennelläänpä sitten ihmis- tai eläinsoluilla, tarkkojen protokollien noudattaminen ja tiukkojen aseptisten tekniikoiden ylläpitäminen ovat ensiarvoisen tärkeitä onnistuneen kryosäilytyksen saavuttamiseksi.

Tämä opas tarjoaa yksityiskohtaiset ohjeet tarvittavista materiaaleista, reagensseista ja vaiheittaisista menettelyistä solujen tehokkaaseen pakastamiseen niiden elinkelpoisuuden ja steriiliyden säilyttäen. Noudattamalla näitä ohjeita tutkijat voivat luottavaisin mielin säilyttää ja myöhemmin elvyttää soluviljelmiä solujen elinkelpoisuuden menetyksen ollessa minimaalinen, mikä säilyttää kokeellisten tulosten eheyden ja luotettavuuden.

Aluksi on välttämätöntä luoda steriili työympäristö. Asianmukaiset aseptiset tekniikat ovat ratkaisevassa asemassa kontaminaation estämisessä ja viljelmien steriiliyden varmistamisessa.

Aseptinen tekniikka

Noudata aseptisia tekniikoita koko prosessin ajan viljelmien steriiliyden varmistamiseksi.

Kattava solujen pakastusprosessi

Tämä vuokaavio tarjoaa yksityiskohtaisen visuaalisen oppaan solujen asianmukaisen pakastamisen olennaisiin vaiheisiin. Noudata näitä menettelyjä varmistaaksesi solujen korkean elinkelpoisuuden ja eheyden kryosäilytysprosessin aikana.

Jäädytysväliaineen valmistus

Valmista kryoprotektiivinen pakastusväliaine solutyypin mukaan:

FBS:ää sisältävät viljelyalustat: 90 % FBS + 10 % DMSO tai 70 % kasvualustaa, 20 % FBS ja 10 % DMSO
Glyserolia vaativat solut: 90 % FBS + 10 % glyserolia

Harkitse valmiiksi sekoitetun pakastusliuoksen hankkimista:

Jäädytysaine CM-1: Protokollille, jotka vaativat sikiön naudan seerumia (FBS) sisältävää väliainetta
Pakastusväliaine CM-ACF – seerumiton: FBS-vapaa vaihtoehto

Merkinnät ja dokumentointi

Merkitse kryoputket seuraavilla tiedoilla:

Päivämäärä
Tutkijan nimi
Solujen lukumäärä
Passageluku
Solutyyppi
Muut tiedot (esim. geneettiset muunnokset)

Solujen valmistelu

Adherenttiset solut:

Seuraa soluja, kunnes ne saavuttavat 85–95 %:n konfluenssin
Ime vanha viljelyväliaine pois
Huuhtele solukerros kalsium- ja magnesiumittomalla PBS-liuoksella
Irrota solut Accutase-entsyymillä, trypsiinillä tai trypsiini-EDTA:lla ja neutraloi tarvittaessa viljelyalustalla
Siirrä solususpensio 50 ml:n Falcon-putkeen

Suspensiosolujen osalta:

Tarkista solutiheys ja solujen kunto mikroskoopilla
Siirrä solususpensio suoraan 50 ml:n Falcon-putkeen

Solujen laskeminen ja sentrifugointi

Laske solut hemocytometrillä tai automaattisella solulaskurilla
Sentrifugoi 300 g:n voimalla 3–5 minuuttia huoneenlämmössä solujen saostamiseksi
Ime supernatantti varovasti pois häiritsemättä solupellettiä
Lämmitä valmistettu pakastusaine 37 °C:seen ennen käyttöä

Kryokonservointi

Suspendoi solupelletti pakastusliuokseen tiheyteen 2,0 miljoonaa solua/ml kiinnittyneiden solujen osalta ja 5 miljoonaa solua/ml suspensiosolujen osalta tai haluamaasi pitoisuuteen
Jaa 1,0 ml (tai enemmän tarpeen mukaan) solususpensiota merkittyihin kryoputkiin
Käytä hidasjäädytysmenetelmää ennen solujen siirtämistä pitkäaikaiseen säilytykseen

? Menetelmä: ? Vaiheet
❄️ Manuaalinen pakastus: 1️⃣ Aseta solut jäädytysliuokseen ja säilytä niitä 4 °C:n pakastimessa 40 minuuttia.
2️⃣ Siirrä ne -80 °C:n pakastimeen 24 tunniksi.
3️⃣ Säilytä soluja nestemäisessä typessä pitkäaikaista säilytystä varten.
? Mr. Frostyn käyttö: 1️⃣ Valmistele solut kryoputkiin pakastusliuoksella.
2️⃣ Aseta kryoputket Mr. Frosty -astiaan.
3️⃣ Säilytä -80 °C:ssa 24 tuntia ennen siirtämistä nestemäiseen typpeen.
? Säädeltyä jäähdytysnopeutta käyttävä pakastin: 1️⃣ Ohjelmoi laite laskemaan lämpötilaa asteittain.
2️⃣ Aseta valmistellut solut pakastimeen.
3️⃣ Siirrä solut pakastusjakson jälkeen nestemäiseen typpeen.

Säilytä kryoputket alle -130 °C:n lämpötilassa tai nestemäisessä typessä pitkäaikaista säilytystä varten.

Materiaalit ja reagenssit

1–2 ml:n kryoputket
CoolCell®-pakastusyksikkö tai pakastin, jossa on säädettävä pakastusnopeus
Kryosuojausaine (esim. itse valmistettu kryosuojausaine, CM-1, CM-ACF tai erikoistunut aine)
Naudan sikiön seerumi (FBS) tai konditionoitu väliaine
DMSO tai glyseroli
Kalsium- ja magnesiumiton PBS
Accutase, trypsiini tai trypsiini-EDTA (adherenteille soluille)
15 ml:n tai 50 ml:n Falcon-putket
Hemocytometri tai automaattinen solulaskuri
Sentrifugi