HaCaT-solut - Ihon biologian ja sairauksien tutkiminen

2.haCaT-solujen geneettiset ominaisuudet ja alkuperä

HaCaT-solut ovat spontaanisti kuolematon ihmisen keratinosyyttisolulinja, joka on peräisin aikuisen ihosta ja edustaa ainutlaatuista evoluutiopolkua. Näillä soluilla on mutaatioita p53-geenin molemmissa alleeleissa, mikä on tyypillistä UV-säteilyn aiheuttamille mutaatioille [3,4]. Lisäksi HaCaT-solujen oletetaan syntyneen p53-kasvainsuppressorigeenin mutaatioiden ja sen jälkeen senesenssigeenien häviämisen seurauksena [5].

Kasvainsuppressorigeeni p53, joka tunnetaan roolistaan DNA:n korjauksessa ja genomin vartijana, indusoi ihmisen ihon vastetta DNA-vaurioille [4]. On havaittu, että HaCaT-solut ovat osittain menettäneet suojamekanisminsa DNA-vaurioita vastaan p53-geenin in vivo -mutaation vuoksi, minkä vuoksi ne ovat alttiita kertymään sytogeneettisille muutoksille vasteena kohonneisiin viljelylämpötiloihin. Toinen HaCaT-solujen kuolemattomuuden mekanismi liittyy telomeraasientsyymin lisääntyneeseen aktiivisuuteen [7]. Normaaleissa soluissa telomeerit lyhenevät jatkuvasti jokaisen solunjakautumisen yhteydessä, kunnes solujen vanheneminen saavutetaan. Telomeraasi on erikoistunut solun entsyymikompleksi, jolla on käänteistranskriptaasiaktiivisuus ja joka ylläpitää telomeerien pituuden vakaana. Sitä vastoin HaCaT-soluissa telomeraasiaktiivisuus on huomattavasti lisääntynyt, mikä johtaa telomeerien pituuden pysymiseen hyvin ylläpidettynä. Nämä havainnot vahvistavat telomeraasin roolin HaCaT-solujen kuolemattomuusprosessissa.

On tunnistettu kolme spesifistä kromosomitranslokaatiota, jotka johtavat yhden kopion menettämiseen kromosomihaaroista 3p, 4p ja 9p, 9q:n saamiseen ja isokromosomien muodostumiseen. Kromosomin 3p lyhyen haaran menetys voi johtaa senesenssigeenien häviämiseen ja HaCaT-solujen kuolemattomuuteen [8]. HaCaT-solut ovat hypodiploideja, ja niillä on erilliset ja vakaat merkkikromosomit, jotka edustavat niiden monoklonaalista alkuperää. HaCaT-solulinjan ominaisuudet ja pää vahvistettiin käyttämällä DNA-sormenjälkitutkimusta hypervariaabeleilla minisatelliittimarkkereilla [3-6].

3.haCaT-solujen kerääminen viidessä yksinkertaisessa vaiheessa

4. Poista elatusaine ja huuhtele tarttuneet solut 3-5 ml:lla PBS:ää, jossa ei ole kalsiumia ja magnesiumia T25-pullojen osalta tai 5-10 ml:lla T75-pullojen osalta.
5. Lisää 1-2 ml tuoretta 0,05-prosenttista EDTA-liuosta T25-pulloa kohti tai 2,5 ml T75-pulloa kohti varmistaen, että koko solulevy peittyy, ja inkuboi 37 °C:ssa 10 minuuttia.
6. Lisätään 1 ml tuoretta trypsiini/EDTA-liuosta (0,05 %/0,025 %) T25-pulloa kohti tai 2,5 ml T75-pulloa kohti varmistaen jälleen, että solukalvo peittyy kokonaan. Solujen pitäisi irrota 1-2 minuutissa.
7. Lopeta trypsiinin toiminta lisäämällä FBS:ää sisältävää soluviljelyalustaa.
8. Annostele solut uusiin pulloihin, jotka sisältävät tuoretta soluviljelyalustaa.

4. HaCaT-solujen sovellukset

HaCaT-solut ovat arvokas väline keratinosyyttien tutkimiseen [9]. Nämä kuolemattomat solut toimivat preneoplastisina soluina, ja ne voivat tarjota tietoa pahanlaatuiseen ja neoplastiseen transformaatioon liittyvistä muutoksista [10]. Yksikerroksiset HaCaT-soluviljelmät ovat välttämättömiä solutoksisuuden ja haavan paranemisen in vitro -analyysisovelluksissa. HaCaT-soluja voidaan käyttää myös erilaisten aineiden ja neoplastisten tai tulehduksellisten prosessien aiheuttaman ihotoksisuuden arviointiin. Niitä voidaan hyödyntää ihon allergisten reaktioiden eri mekanismien, reaktiivisten happilajien vaikutusten ja UV-säteilyn aiheuttaman säteilyn analysointiin. Stimulaation jälkeen HaCaT-solut voivat erilaistua ja ilmentää erityisiä erilaistumisen merkkiaineita, kuten involukriiniä, K14:ää ja K10:tä. HaCaT-soluja käytetään yleisesti myös mallina epidermiksen homeostaasin patofysiologian tutkimiseen [6].

HaCaT-solut säilyttävät kykynsä muodostaa uudelleen strukturoituneen epidermiksen in vivo siirron jälkeen, mikä johtaa kerrostuneeseen epidermisrakenteeseen, joka voidaan palauttaa perustilan ja erilaistuneen tilan välillä väliaineen kalsiumpitoisuuden muutoksilla. Nämä solut mahdollistavat myös useiden biologisten prosessien karakterisoinnin, kuten niiden käytön D-vitamiinin mallijärjestelmänä ja aineenvaihdunnan luonnehtimisen ihossa. Koska HaCaT-soluja ei ole geneettisesti muokattu, ne tarjoavat puolueettoman kuvan ihmisen ihon alkuperäisten geneettisten tapahtumien laajasta kirjosta.

5. Esittelyvideot: HaCaT-solujen maailmaan tutustuminen

"HaCaT-solujen migraatio": HaCaT-solujen solumigraatioprosessia esitellään tällä videolla. Solujen migraatio on olennainen prosessi erilaisissa biologisissa prosesseissa, kuten haavan paranemisessa ja syövän etäpesäkkeissä. Videolla demonstroidaan HaCaT-solujen liikkumista mikroskoopin alla, ja se tarjoaa visuaalisen esityksen siitä, miten nämä solut vaeltavat. Solujen toimintaa tarkkaillaan, kun ne liikkuvat paikasta toiseen, ja videolla havainnollistetaan selkeästi soluissa tämän prosessin aikana tapahtuvia muutoksia.

"HaCaT-soluilla suoritettu raapaisutesti": Tällä videolla esitellään HaCaT-soluilla suoritettu Scratch Assay. Scratch Assay on laajalti käytetty tekniikka solujen migraation tutkimiseen, ja tässä tapauksessa sitä käytetään HaCaT-solujen migraation analysointiin. Videolla näytetään prosessi, jossa soluviljelymaljan pintaan luodaan naarmu, jota sitten tarkkaillaan mikroskoopilla, kun HaCaT-solut vaeltavat ja sulkevat raon ajan myötä.

"HaCaT-keratinosyyttien solukasvu haavanparannuskokeita varten": Tämä video demonstroi HaCaT-keratinosyyttien solukasvuprosessia haavanparannuskokeita varten. HaCaT-keratinosyytit ovat yleisesti käytetty solulinja haavanparanemistutkimuksissa.

"HaCaT-solujen erilaistuminen": Tässä videossa esitellään HaCaT-solujen erilaistamiseen tarvittavat vaiheet. HaCaT-solut voivat erilaistua erityyppisiksi ihosoluiksi. Videolla havainnollistetaan HaCaT-solujen muutoksia niiden erilaistuessa ja esitetään visuaalisesti erilaistumisen eri merkkiaineet ja ominaisuudet. Erilaistumisprosessi on kriittinen ihon normaalin toiminnan kannalta, ja videolla tuodaan esiin HaCaT-solujen läpikäymät eri erilaistumisvaiheet.

Viitteet

1. Angel P ja Karin M: Junin, Fosin ja AP-1-kompleksin rooli solujen proliferaatiossa ja transformaatiossa. Biochim Biophys Acta 1072:129-157, 1991 Argyris TS: The regulation of epidermal hyperplastic growth. Crit Rev Toxicol 9:151-200, 1981
2. Baden HP, Kubilus J, Kvedar JC, Steinberg ML, Wolman SR: Spontaanisti syntyvän pitkäikäisen ihmisen keratinosyyttilinjan (NM-1) eristäminen ja karakterisointi. In Vitro Cell Dev Biol 23(3):205-13, 1987
3. Lehmann TA, Modali R, Boukamp P, Stanek J, Bennett WP, Welsh JA, Metcalf RA, Stampfer MR, Fusenig NE, Rogan EM, Harriss CC: p53-mutaatiot ihmisen kuolemattomiksi muuttuneissa epiteelisolulinjoissa. Carcinogenesis 14:833-839, 1993
4. Ziegler A-M, Leffell DJ, Kunala S, Sharma HW, Gailani M, Simon JA, Halperin AJ, Baden HP, Shapiro PE, Bale AE, Brash DE: Auringonvalon aiheuttamat mutaatiokeskittymät p53-geenissä ei-melanoomaisessa ihosyövässä. Proc Natl Acad Sci USA 90:4216-4220, 1993
5. Fusenig NE, Boukamp P. Ihmisen ihon keratinosyyttien kuolemattomuuden, pahanlaatuisen transformaation ja kasvaimen etenemisen useita vaiheita ja geneettisiä muutoksia. Mol Carcinog. 1998;23(3):144-158.
6. Harle-Bachor C, Boukamp P: Telomeraasiaktiivisuus ihmisen ihon epidermiksen regeneratiivisessa tyvikerroksessa sekä kuolemattomissa ja karsinoomasta peräisin olevissa ihon keratinosyyteissä. Proc Natl Acad Sci USA 93:6476-81, 1996
7. Colombo I, Sangiovanni E, Maggio R, et al. HaCaT-solut luotettavana in vitro -erilaistumismallina ihmisen keratinosyyttien tulehdus-/korjausreaktion erittelyyn. Mediators Inflamm. 2017;2017:7435621.
8. Boukamp, P. et al. Normal keratinization in a spontaneously immortalized aneuploid human keratinocyte cell line. J. Cell Biol. 106, 1996, 761-771.
9. Gibbs, Graham: Analysing qualitative data. The Sage qualitative research kit. London: Sage 978-0-7619-4980-0.
10. Hedrick TE, Bickman L, Rog DJ. 1993. Applied research design: a practical guide. Sage: London
11. Boukamp P. Petrussevska R. T. Breitkreutz D. Hornung J. Markham A. Fusenig N. E. Normal keratinization in a spontaneously immortalized aneuploid human keratinocyte cell line. Cell Biol.(1988);106:761-771.