Publicado: 2023 | Última revisión: mayo de 2026

Técnicas de disociación de cultivos celulares

La disociación de cultivos celulares es un paso fundamental en el mantenimiento de los cultivos celulares. Consiste en separar las células de su superficie de crecimiento para permitir el subcultivo o la recolección. En esta sección se describen dos métodos principales: el uso de tampones de disociación sin enzimas y el uso de reactivos enzimáticos.

Uso de tampones de disociación celular sin enzimas

Este método es suave y mantiene la integridad celular sin el uso de enzimas:

1. Preparación
   • Asegúrese de que todos los reactivos estén a 37 °C antes de su uso para evitar un choque térmico en las células.
2. Eliminación del medio de crecimiento:
   • Deseche el medio de cultivo antiguo del recipiente de cultivo.
3. Enjuague
   • Enjuague las monocapas celulares con 5 ml de PBS sin calcio ni magnesio por cada frasco T75 o placa de 100 mm.
   • Agite suavemente el recipiente durante 30 a 60 segundos a temperatura ambiente.
   • Aspirar y desechar la solución de enjuague.
   • Repita este paso de enjuague una vez más.
4. Disociación
   • Añada aproximadamente 5 ml de tampón de disociación celular sin enzimas al recipiente.
   • Agite suavemente a temperatura ambiente durante 1 a 2 minutos y compruebe la disociación con un microscopio.
   • Si es necesario, golpee suavemente el matraz o la placa contra la mano para desprender las células.
   • Si las células están adheridas, déjelas reposar a temperatura ambiente durante otros 2 a 5 minutos y golpéelas de nuevo si es necesario, utilizando más tampón de disociación.
   • Una vez que las células se hayan desprendido, añada al menos 5 ml de medio de crecimiento completo para neutralizar el tampón de disociación y resuspender las células.
5. Comprobación de la viabilidad
   • Controle la viabilidad celular durante el subcultivo, asegurándose de que se mantenga por encima del 90 %.

Uso de otros reactivos para la disociación

Este método permite el uso de diversos reactivos de disociación:

1. Eliminación del medio usado
   • Deseche los medios viejos del recipiente de cultivo.
2. Lavado de las células
   • Lave las células con una solución salina equilibrada libre de calcio y magnesio, o utilice EDTA.
   • Añada la solución de lavado con cuidado por el lado opuesto a las células y agite el recipiente durante 1 o 2 minutos antes de desechar el lavado.
3. Disociación
   • Aplique de 2 a 3 ml de la solución de disociación elegida por cada 25 cm² de superficie de crecimiento, asegurándose de cubrir toda la lámina celular.
   • Incube el recipiente a 37 °C y agítelo suavemente. La disociación suele producirse en un plazo de 5 a 15 minutos, dependiendo de la línea celular.
   • En el caso de células rebeldes, dar unos golpecitos al recipiente puede acelerar el proceso.
   • Observe las células con cuidado para evitar la sobreexposición y posibles daños.
4. Recolección de células
   • Una vez que las células se hayan desprendido por completo, deje que se acumulen en el fondo del recipiente colocándolo en posición vertical.
   • Añada medio completo, luego disperse y recoja las células pipeteando sobre la capa celular.
   • Cuéntelas y proceda al subcultivo.

En ambos métodos, es importante determinar las condiciones óptimas para cada línea celular mediante observación empírica. El proceso debe preservar la viabilidad celular, que debe comprobarse de forma rutinaria para que supere el 90 % durante el subcultivo. Estos procedimientos proporcionan una base que los investigadores pueden adaptar en función de los requisitos y características específicos de sus líneas celulares.

Resumen de las técnicas para el subcultivo de células adherentes

El subcultivo eficaz de células adherentes requiere su desprendimiento del recipiente de cultivo. Se emplean diversos métodos, cada uno adecuado para diferentes tipos de células y condiciones. A la hora de seleccionar un método de disociación, es crucial tener en cuenta las necesidades específicas de la línea celular y los objetivos del experimento. El control regular de la viabilidad celular, con el objetivo de superar el 90 % en el momento del subcultivo, es esencial para la salud y la productividad continuadas del cultivo. A continuación se ofrece una descripción general de estos procedimientos: