Técnicas de disociación de cultivos celulares

La disociación de cultivos celulares es un paso crítico en el mantenimiento de cultivos celulares. Consiste en separar las células de su superficie de crecimiento para permitir el subcultivo o la recolección. En esta sección se describen dos métodos principales: el uso de tampones de disociación sin enzimas y el uso de reactivos enzimáticos.

1.utilización de tampones de disociación celular sin enzimas

Este método es suave y mantiene la integridad celular sin utilizar enzimas:

1. Preparación
   • Asegúrese de que todos los reactivos se calientan a 37°C antes de su uso para evitar el choque de las células.
2. Eliminación del medio de crecimiento
   • Deseche el medio de crecimiento antiguo del recipiente de cultivo.
3. Aclarado
   • Enjuagar las monocapas celulares con 5 ml de PBS sin calcio ni magnesio por matraz T75 o placa de 100 mm.
   • Agitar suavemente el recipiente durante 30 a 60 segundos a temperatura ambiente.
   • Aspirar y desechar la solución de enjuague.
   • Repita este paso de aclarado una vez más.
4. Disociación
   • Añadir aproximadamente 5 ml de tampón de disociación celular sin enzimas al recipiente.
   • Agitar suavemente a temperatura ambiente durante 1 ó 2 minutos y comprobar la disociación al microscopio.
   • Golpear el matraz o la placa contra la mano para desalojar las células si es necesario.
   • Si las células están adheridas, déjelas reposar a temperatura ambiente de 2 a 5 minutos más y vuelva a golpearlas si es necesario, utilizando más tampón de disociación.
   • Una vez desprendidas las células, añadir al menos 5 ml de medio de crecimiento completo para neutralizar el tampón de disociación y resuspender las células.
5. Comprobación de la viabilidad
   • Controlar la viabilidad celular durante el subcultivo, asegurándose de que se mantiene por encima del 90%.

2.utilización de otros reactivos para la disociación

Este método permite el uso de varios reactivos de disociación:

1. Eliminación del medio usado
   • Deseche el medio usado del recipiente de cultivo.
2. Lavado de las células
   • Lavar las células con una solución salina equilibrada sin calcio ni magnesio, o utilizar EDTA.
   • Añadir suavemente la solución de lavado al lado opuesto a las células y agitar el recipiente durante 1 ó 2 minutos antes de desechar el lavado.
3. Disociación
   • Aplicar de 2 a 3 ml de la solución de disociación elegida por cada 25 cm² de superficie de crecimiento, asegurándose de cubrir la lámina celular.
   • Incubar el recipiente a 37°C y agitar suavemente. La disociación suele producirse en 5 a 15 minutos, dependiendo de la línea celular.
   • En el caso de células rebeldes, golpear el recipiente puede acelerar el proceso.
   • Observar cuidadosamente las células para evitar la sobreexposición y posibles daños.
4. Recolección de las células
   • Una vez que las células se hayan desprendido por completo, deje que se acumulen en el fondo del recipiente poniéndolo en posición vertical.
   • Añadir medio completo, dispersar y recoger las células pipeteando sobre la capa celular.
   • Contar y proceder al subcultivo.

En ambos métodos, es importante determinar las condiciones óptimas para cada línea celular mediante la observación empírica. El proceso debe preservar la viabilidad celular, que debe comprobarse rutinariamente para que supere el 90% durante el subcultivo. Estos procedimientos proporcionan una base que los investigadores pueden adaptar en función de las necesidades y características específicas de sus líneas celulares.

3.resumen de las técnicas de subcultivo de células adherentes

El subcultivo eficaz de células adherentes requiere su separación del recipiente de cultivo. Se emplean varios métodos, cada uno adecuado para diferentes tipos y condiciones celulares. A la hora de seleccionar un método de disociación, es fundamental tener en cuenta las necesidades específicas de la línea celular y los objetivos del experimento. El control regular de la viabilidad celular, con un objetivo superior al 90% en el momento del subcultivo, es esencial para la salud y productividad continuas del cultivo. A continuación se presenta un resumen de estos procedimientos: