Sistemas sin células para la producción de proteínas: Ventajas sobre las células vivas

La síntesis de proteínas sin células (CFPS) representa un enfoque revolucionario para la producción de proteínas fuera del complejo entorno de las células vivas, utilizando maquinaria celular extraída en mezclas de reacción optimizadas. En Cytion, aunque nuestra principal experiencia se centra en células vivas y líneas celulares, reconocemos que los sistemas libres de células complementan los enfoques basados en células ofreciendo ventajas únicas para aplicaciones específicas. Estos sistemas liberan la producción de proteínas de las limitaciones de la viabilidad celular, las vías reguladoras y las barreras de membrana, permitiendo la síntesis de proteínas tóxicas, la incorporación de aminoácidos no naturales, la creación rápida de prototipos de construcciones genéticas y la producción en entornos con recursos limitados. Para saber cuándo emplear sistemas libres de células frente a cultivos celulares tradicionales es preciso conocer los puntos fuertes y las limitaciones de cada enfoque.

Principios de la síntesis proteica sin células

Los sistemas CFPS contienen los componentes celulares mínimos necesarios para la síntesis de proteínas: ribosomas, factores de traducción, aminoacil-ARNt sintetasas, ARNt, aminoácidos, fuentes de energía (ATP, GTP) y un sistema de regeneración de energía. Estos componentes se preparan normalmente como lisados celulares de bacterias (E. coli), eucariotas (germen de trigo, reticulocitos de conejo, células de insectos o células de mamíferos) o se reconstituyen a partir de componentes purificados (sistema PURE). Cuando se les proporciona un molde de ADN o ARNm que codifica la proteína diana, estos sistemas sintetizan proteínas a través de los mismos mecanismos fundamentales que las células vivas, pero sin la complejidad de mantener la homeostasis celular, la integridad de la membrana o las redes reguladoras. Esta simplificación es a la vez una limitación (ausencia de funciones celulares) y una ventaja (eliminación de la complejidad no deseada).

Tipos de sistemas sin células

Los sistemas sin células bacterianas, basados principalmente en lisados de E. coli, ofrecen una alta productividad, un bajo coste y una amplia optimización. Sin embargo, carecen de modificaciones postraduccionales eucarióticas y pueden no plegar correctamente proteínas eucarióticas complejas. Los extractos de germen de trigo proporcionan una maquinaria de traducción eucariota con baja actividad de nucleasas y proteasas, excelente para producir proteínas intactas. Los lisados de reticulocitos de conejo, enriquecidos en factores de traducción, son excelentes para producir pequeñas cantidades de proteínas altamente activas. Los lisados de mamíferos (derivados de HeLa, CHO o HEK293) son los que más se asemejan a la maquinaria celular humana, ya que favorecen el plegamiento y las modificaciones auténticas. El sistema PURE, reconstituido a partir de componentes purificados de E. coli, ofrece un control total de la composición, pero su preparación y optimización requieren una gran experiencia. La selección entre ellos depende de los requisitos y la aplicación de la proteína objetivo.

Ventajas: Velocidad y rendimiento

Los sistemas libres de células sintetizan proteínas en cuestión de minutos u horas, en comparación con los días necesarios para la expresión celular, incluyendo la transformación, la selección de colonias, el crecimiento del cultivo y la inducción. Esta velocidad permite aplicaciones de alto rendimiento: el cribado de cientos de variantes de proteínas, el ensayo de diferentes construcciones de expresión o la optimización de codones y elementos reguladores. Para las aplicaciones de investigación que requieren la creación rápida de prototipos, este ahorro de tiempo es transformador. Se pueden producir en paralelo grandes bibliotecas de variantes proteínicas en formatos de microplaca, lo que permite realizar estudios sistemáticos de estructura-función o campañas de cribado de anticuerpos que serían impracticables utilizando métodos basados en células. La eliminación de los pasos de clonación, transformación y cultivo reduce drásticamente el tiempo que transcurre desde la obtención del gen hasta la proteína.

Ventajas: Proteínas tóxicas y difíciles

Algunas proteínas son imposibles de producir en células vivas porque alteran procesos celulares esenciales. Las proteínas de membrana que provocan lisis, las proteasas que degradan las proteínas celulares, los factores de transcripción que interfieren en la expresión génica o las proteínas que desencadenan la apoptosis plantean problemas para la producción celular. Los sistemas sin células evitan por completo estos problemas: no hay células que matar. Del mismo modo, las proteínas propensas a agregarse o plegarse mal pueden producirse a veces en sistemas sin células con condiciones modificadas (potencial redox ajustado, chaperonas específicas o temperatura alterada) que serían incompatibles con la viabilidad celular. Esta capacidad amplía el espacio proteico accesible más allá de lo que pueden producir las células vivas.

Ventajas: Incorporación de aminoácidos no naturales

Los sistemas libres de células permiten la incorporación directa de aminoácidos no naturales, etiquetas fluorescentes, agentes reticulantes o etiquetas isotópicas para estudios estructurales. Al omitir un aminoácido natural de la reacción y sustituirlo por un análogo, los investigadores pueden reemplazar aminoácidos de forma específica o global. Este enfoque permite el etiquetado de proteínas sin sistemas de codificación genética, la producción de proteínas con propiedades novedosas (mayor estabilidad, capacidad de fotocruzamiento, asas espectroscópicas) o la preparación de proteínas marcadas isotópicamente para estudios de RMN sin costosos medios de crecimiento marcados con isótopos. La naturaleza abierta de las reacciones sin células hace que estas modificaciones sean mucho más sencillas que en las células vivas, donde las barreras de membrana y la complejidad metabólica crean obstáculos.

Ventajas: Manipulación directa de las condiciones de reacción

La accesibilidad de las reacciones libres de células permite una optimización imposible en las células. Los investigadores pueden ajustar directamente el pH, la fuerza iónica, el potencial redox, las concentraciones de iones metálicos o la temperatura sin tener en cuenta la viabilidad celular. Pueden añadirse catalizadores de plegamiento específicos, chaperonas o cofactores en concentraciones precisas. En el caso de las proteínas unidas por disulfuro, el equilibrio de oxidación-reducción puede ajustarse añadiendo proporciones específicas de glutatión reducido y oxidado. En el caso de las metaloproteínas, pueden añadirse los iones metálicos adecuados. Este nivel de control sobre el entorno bioquímico permite optimizar el rendimiento y el plegamiento adecuado de objetivos difíciles que fallan en entornos celulares estándar.

Limitaciones: Modificaciones postraduccionales

Una de las principales limitaciones de los sistemas sin células son las modificaciones postraduccionales incompletas o inexistentes. Los extractos bacterianos carecen de maquinaria de glicosilación, sistemas de fosforilación y muchas otras modificaciones eucarióticas. Incluso los extractos eucarióticos pueden mostrar una eficiencia de modificación reducida en comparación con las células vivas. Esto es problemático para las proteínas que requieren glicosilación, fosforilación u otras modificaciones auténticas para su actividad. Existen soluciones parciales: la cotraducción con microsomas de membrana (vesículas derivadas del RE) permite cierta glicosilación e inserción en la membrana; la suplementación con quinasas específicas permite la fosforilación; los métodos de ligación química pueden añadir modificaciones después de la síntesis. Sin embargo, para las proteínas que requieren modificaciones complejas y maduras, las células vivas -en particular las células de mamíferos que producen auténticas proteínas humanas- siguen siendo superiores.

Limitaciones: Escalabilidad y coste

Los sistemas sin células suelen funcionar a pequeña escala (de microlitros a mililitros), produciendo cantidades de microgramos a miligramos. Aunque esto es suficiente para muchas aplicaciones de investigación, palidece en comparación con los cultivos de células vivas, que se escalan rutinariamente a cientos de litros produciendo cantidades de gramos. Los costes de los reactivos para las reacciones sin células son elevados debido a los componentes caros (nucleótidos, aminoácidos, sistemas de regeneración de energía), lo que hace que la producción a gran escala sea económicamente desfavorable. Para aplicaciones que requieren cantidades importantes de proteínas -producción terapéutica, estudios estructurales que requieren grandes cantidades o enzimas industriales-, la fermentación de células vivas sigue siendo mucho más rentable. Los sistemas sin células son más adecuados para aplicaciones a pequeña escala y de gran diversidad que para la producción a gran escala.

Limitaciones: Estabilidad y acumulación de proteínas

En las células vivas, las proteínas pueden acumularse intracelularmente en altas concentraciones, secretarse en el medio o formar cuerpos de inclusión estables para su posterior purificación. Las reacciones sin células carecen de tal compartimentación, y las proteínas sintetizadas permanecen en la mezcla de reacción cruda con toda la maquinaria celular, las enzimas de degradación y los contaminantes. Esto puede conducir a la degradación proteolítica con el tiempo. La síntesis prolongada requiere configuraciones de flujo continuo o diálisis que suministren nutrientes y eliminen los productos de desecho, lo que añade complejidad. La purificación a partir de reacciones sin células puede ser sencilla (mediante etiquetas de afinidad), pero el material de partida suele ser más diluido y complejo que los extractos celulares, lo que puede reducir el rendimiento tras la purificación.

Aplicaciones en biología sintética e ingeniería metabólica

Los sistemas libres de células son plataformas excelentes para crear prototipos de circuitos genéticos sintéticos antes de implementarlos en células vivas. Los investigadores pueden probar promotores, sitios de unión a ribosomas, elementos reguladores y diseños de circuitos genéticos en horas en lugar de días, lo que acelera drásticamente el ciclo de diseño-construcción-prueba. La ausencia de metabolismo celular elimina los efectos de confusión de las redes reguladoras nativas, lo que permite comprender mejor el comportamiento de los componentes sintéticos. Las rutas metabólicas multienzimáticas pueden reconstituirse in vitro, lo que permite optimizar las proporciones de enzimas, las condiciones de reacción y los sistemas de reciclaje de cofactores antes de diseñar estas rutas en células vivas. Esta creación de prototipos sin células reduce el proceso de ensayo y error tradicionalmente necesario para la ingeniería metabólica.

Aplicaciones en biología estructural

Los biólogos estructurales utilizan sistemas sin células para producir proteínas marcadas para espectroscopia de RMN o cristalografía de rayos X. El etiquetado isotópico selectivo o uniforme (¹⁵N, ¹³C, ²H) se consigue fácilmente utilizando aminoácidos etiquetados en la reacción sin células, lo que evita los costosos medios de crecimiento etiquetados con isótopos. En el caso de las proteínas de membrana, cuya producción en células es notoriamente difícil, los sistemas libres de células complementados con micelas detergentes o nanodiscos pueden producir proteínas funcionales en entornos de membrana casi nativos. El cribado de cristalización de alto rendimiento es posible gracias a la producción paralela de muchas variantes, construcciones con diferentes límites o proteínas de fusión diseñadas para mejorar la cristalización. Aunque las células vivas también pueden producir proteínas marcadas con isótopos, la simplicidad y el control de los sistemas sin células ofrecen ventajas para muchas aplicaciones estructurales.

Aplicaciones en el descubrimiento y la ingeniería de anticuerpos

Los sistemas sin células aceleran la ingeniería de anticuerpos al permitir la producción y el cribado rápidos de grandes bibliotecas de anticuerpos. Las tecnologías de visualización como la visualización de ribosomas vinculan físicamente el genotipo y el fenotipo mediante el estancamiento de los ribosomas, lo que permite la selección de ligantes de alta afinidad a partir de bibliotecas que superan las 10¹² variantes, mucho mayores que los métodos de visualización basados en células. Los fragmentos de anticuerpos (scFv, Fab) pueden producirse en formatos de alto rendimiento para el cribado de actividad, la maduración por afinidad o los esfuerzos de humanización. Los sistemas sin células también permiten la incorporación de reticulantes o marcadores específicos para estudios biofísicos. Aunque las células de mamífero siguen siendo esenciales para producir anticuerpos terapéuticos glicosilados de longitud completa, los sistemas sin células destacan en las fases de descubrimiento y optimización, en las que la velocidad y el tamaño de la biblioteca son primordiales.

Aplicaciones en diagnóstico y pruebas en el punto de atención

Los sistemas libres de células permiten la producción descentralizada de proteínas para diagnóstico, especialmente valiosa en entornos con recursos limitados. Las reacciones sin células liofilizadas pueden almacenarse a temperatura ambiente durante meses y, a continuación, reconstituirse con ADN molde para producir sensores de proteínas, anticuerpos o enzimas a demanda. Esta capacidad permite el despliegue sobre el terreno de herramientas de diagnóstico sin necesidad de una cadena de frío. Durante la pandemia de COVID-19, se exploraron sistemas libres de células para la producción rápida de antígenos virales para pruebas serológicas o componentes moleculares para ensayos de diagnóstico. La portabilidad y estabilidad de los reactivos liofilizados libres de células los hacen atractivos para aplicaciones de salud global donde la infraestructura tradicional de cultivo celular no está disponible.

Aplicaciones en educación y creación de prototipos

La simplicidad y la seguridad de los sistemas sin células los convierten en excelentes herramientas educativas, ya que introducen a los estudiantes en los conceptos de la biología molecular sin las preocupaciones de bioseguridad de los organismos vivos modificados genéticamente. Los kits sin células de fácil uso en el aula permiten realizar experimentos prácticos de síntesis de proteínas en cuestión de horas, en lugar de los días necesarios para la expresión bacteriana. Para la creación de prototipos de investigación, los sistemas sin células aceleran el ciclo diseño-construcción-prueba: comprobar si un gen produce proteínas antes de invertir en el desarrollo de líneas celulares, optimizar el uso de codones, cribar etiquetas de fusión o validar construcciones antes de la producción a gran escala. Esta rápida creación de prototipos reduce el esfuerzo desperdiciado en construcciones que no se expresarán, agilizando los flujos de trabajo de investigación.

Integración con sistemas de células vivas

En lugar de considerar que los sistemas sin células y los basados en células son competidores, los investigadores experimentados los utilizan de forma complementaria. Los sistemas sin células destacan en el cribado inicial, la optimización y la producción de proteínas difíciles, mientras que las células vivas se encargan de la producción a gran escala de proteínas de buen comportamiento que requieren modificaciones complejas. Un flujo de trabajo típico podría utilizar la síntesis sin células para el cribado rápido de variantes, identificar las construcciones óptimas y, a continuación, transferir las ganadoras a células y líneas celulares para su producción a escala. Alternativamente, los sistemas libres de células pueden producir una enzima tóxica para un ensayo específico, mientras que las proteínas complementarias se producen en células. Este enfoque integrado aprovecha los puntos fuertes de cada sistema al tiempo que mitiga sus puntos débiles.

Avances recientes: Mayor rendimiento y funcionalidad

Los avances continuos mejoran el rendimiento de los sistemas sin células. Los sistemas libres de células de intercambio continuo (CECF) utilizan la diálisis para suministrar nutrientes y eliminar los subproductos inhibidores, ampliando las reacciones de horas a días y aumentando drásticamente el rendimiento. La optimización de los sistemas de regeneración de energía, a menudo con fosfato de creatina o fosfoenolpiruvato, mantiene los niveles de ATP durante las reacciones prolongadas. La suplementación con chaperonas, foldasas o cofactores específicos mejora el plegamiento y la actividad de proteínas complejas. Los sistemas híbridos que combinan extractos de distintos organismos aprovechan los puntos fuertes complementarios, por ejemplo, utilizando maquinaria de traducción bacteriana con chaperonas eucariotas. Estos avances reducen la diferencia de rendimiento entre los sistemas sin células y los basados en células.

Consideraciones económicas y viabilidad comercial

Los aspectos económicos de la producción de proteínas sin células dependen en gran medida de la aplicación. En el caso de productos de alto valor y bajo volumen (reactivos de investigación, terapias personalizadas o componentes de diagnóstico), los sistemas sin células pueden resultar rentables a pesar del elevado coste de los reactivos. La eliminación del tiempo de cultivo, los requisitos de las instalaciones y la mano de obra pueden compensar los gastos en reactivos. Para las proteínas básicas o los anticuerpos terapéuticos que requieren cantidades de kilogramos, la fermentación sigue siendo mucho más económica. Los servicios comerciales de producción sin células ofrecen ahora la producción de proteínas por contrato, lo que hace que la tecnología sea accesible sin experiencia interna. A medida que los costes de los reactivos disminuyan gracias a la economía de escala y a las mejoras de los procesos, los sistemas sin células serán viables para otras aplicaciones, aunque probablemente nunca sustituirán a las células para la producción a granel.

Futuras direcciones y células sintéticas

La evolución definitiva de los sistemas sin células puede ser la de las células sintéticas, compartimentos artificiales que contienen maquinaria de síntesis de proteínas sin células dentro de vesículas o gotitas lipídicas, creando entidades similares a las células sin células vivas. Estas células sintéticas mínimas podrían desempeñar funciones útiles (biodetección, bioproducción, administración de fármacos) siendo más sencillas y controlables que las células vivas. Los avances en los proyectos de genoma mínimo informan de qué componentes son realmente esenciales, guiando la simplificación de los sistemas sin células. Los sistemas de traducción ortogonal que utilizan pares de bases no naturales o códigos genéticos alternativos amplían el espacio químico accesible a la biología. A medida que estas tecnologías maduren, la distinción entre sistemas sin células y células vivas puede difuminarse, creando un continuo de plataformas de producción biológica y sintética.

La perspectiva de Cytion: Tecnologías complementarias

En Cytion, aunque nuestra experiencia se centra en proporcionar líneas celulares vivas de alta calidad para la investigación y el bioprocesamiento, reconocemos que los sistemas libres de células desempeñan funciones complementarias en el panorama más amplio de la biotecnología. Los investigadores que utilizan nuestras células y líneas celulares para la producción de proteínas, ensayos funcionales o modelización de enfermedades pueden beneficiarse de los enfoques libres de células para aplicaciones específicas: cribado rápido antes de comprometerse con el desarrollo de líneas celulares estables, producción de proteínas tóxicas que las células no pueden expresar o incorporación de modificaciones no naturales. Comprender los puntos fuertes y las limitaciones de los sistemas vivos y libres de células permite tomar decisiones informadas sobre la plataforma más adecuada para cada aplicación y, en última instancia, acelerar la investigación y el desarrollo en las ciencias de la vida.