Κύτταρα HaCaT - Εξερευνώντας τη βιολογία και τις ασθένειες του δέρματος

2.γενετικά χαρακτηριστικά και προέλευση των κυττάρων HaCaT

Τα κύτταρα HaCaT είναι μια αυθόρμητα αθάνατη ανθρώπινη κυτταρική σειρά κερατινοκυττάρων που προέρχεται από το δέρμα ενηλίκων και αντιπροσωπεύει μια μοναδική εξελικτική πορεία. Τα κύτταρα αυτά διαθέτουν μεταλλάξεις και στα δύο αλληλόμορφα του γονιδίου p53, οι οποίες είναι τυπικές για μεταλλάξεις που προκαλούνται από υπεριώδη ακτινοβολία [3,4]. Επιπλέον, τα κύτταρα HaCaT θεωρείται ότι έχουν δημιουργηθεί από μεταλλάξεις του ογκοκατασταλτικού γονιδίου p53, ακολουθούμενες από την απώλεια γονιδίων γήρανσης [5].

Το ογκοκατασταλτικό γονίδιο p53, γνωστό για το ρόλο του στην επιδιόρθωση του DNA και ως φύλακας του γονιδιώματος, επάγει την απόκριση του ανθρώπινου δέρματος σε βλάβη του DNA [4]. Έχει παρατηρηθεί ότι τα κύτταρα HaCaT έχουν χάσει εν μέρει τον μηχανισμό προστασίας τους έναντι βλαβών στο DNA λόγω της in vivo μετάλλαξης του γονιδίου p53, καθιστώντας τα ευάλωτα στη συσσώρευση κυτταρογενετικών αλλαγών ως απόκριση σε αυξημένες θερμοκρασίες καλλιέργειας. Ένας άλλος μηχανισμός αθανατισμού των κυττάρων HaCaT περιλαμβάνει την αυξημένη δραστηριότητα του ενζύμου τελομεράση [7]. Στα φυσιολογικά κύτταρα, τα τελομερή μειώνονται συνεχώς με κάθε κυτταρική διαίρεση μέχρι να επιτευχθεί η κυτταρική γήρανση. Η τελομεράση είναι ένα εξειδικευμένο κυτταρικό ενζυμικό σύμπλεγμα με δραστηριότητα αντίστροφης μεταγραφάσης που διατηρεί σταθερό μήκος τελομερών. Αντίθετα, τα κύτταρα HaCaT παρουσιάζουν σημαντικά αυξημένη δραστηριότητα τελομεράσης, με αποτέλεσμα να διατηρείται καλά το μήκος των τελομερών. Οι παρατηρήσεις αυτές επιβεβαιώνουν το ρόλο της τελομεράσης στη διαδικασία αθανασίας των κυττάρων HaCaT.

Έχουν εντοπιστεί τρεις συγκεκριμένες χρωμοσωμικές μετατοπίσεις που έχουν ως αποτέλεσμα την απώλεια ενός αντιγράφου των χρωμοσωμικών βραχιόνων 3p, 4p και 9p, την αύξηση του 9q και τον σχηματισμό ισοχρωμοσωμάτων. Η απώλεια του σύντομου βραχίονα του χρωμοσώματος 3p μπορεί να οδηγήσει στην απώλεια γονιδίων γήρανσης και στην αθανασία των κυττάρων HaCaT [8]. Τα κύτταρα HaCaT είναι υποδιπλοειδή και διαθέτουν διακριτά και σταθερά χρωμοσώματα-δείκτες που αντιπροσωπεύουν τη μονοκλωνική τους προέλευση. Τα χαρακτηριστικά και η κεφαλή της κυτταρικής σειράς HaCaT επιβεβαιώθηκαν με τη χρήση δακτυλικών αποτυπωμάτων DNA με υπερμεταβλητούς μινισατελικούς δείκτες [3-6].

3.πώς να συλλέξετε κύτταρα HaCaT σε 5 απλά βήματα

4. Αφαιρέστε το μέσο καλλιέργειας και ξεπλύνετε τα προσκολλημένα κύτταρα χρησιμοποιώντας 3-5 mL PBS χωρίς ασβέστιο και μαγνήσιο για φιάλες T25 ή 5-10 mL για φιάλες T75.
5. Προσθέστε 1-2 mL φρεσκοπαρασκευασμένου διαλύματος EDTA 0,05% ανά φιάλη T25 ή 2,5 mL ανά φιάλη T75, διασφαλίζοντας ότι καλύπτεται ολόκληρο το φύλλο των κυττάρων, και επωάστε στους 37°C για 10 λεπτά.
6. Προσθέστε 1 mL φρεσκοπαρασκευασμένου διαλύματος θρυψίνης/EDTA (0,05%/0,025%) ανά φιάλη T25 ή 2,5 mL ανά φιάλη T75, εξασφαλίζοντας και πάλι την πλήρη κάλυψη του κυτταρικού φύλλου. Τα κύτταρα θα πρέπει να αποκολληθούν εντός 1-2 λεπτών.
7. Σταματήστε τη δραστηριότητα της θρυψίνης προσθέτοντας ένα μέσο κυτταρικής καλλιέργειας που περιέχει FBS.
8. Διανείμετε τα κύτταρα σε νέες φιάλες που περιέχουν φρέσκο μέσο κυτταροκαλλιέργειας.

4. Εφαρμογές των κυττάρων HaCaT

Τα κύτταρα HaCaT αποτελούν πολύτιμο εργαλείο για τη μελέτη των κερατινοκυττάρων [9]. Αυτά τα αθάνατα κύτταρα λειτουργούν ως προνεοπλασματικά κύτταρα και μπορούν να παράσχουν πληροφορίες για τις αλλαγές που εμπλέκονται στον κακοήθη και νεοπλασματικό μετασχηματισμό [10]. Οι καλλιέργειες μονοστρωματικών κυττάρων HaCaT είναι απαραίτητες για εφαρμογές ανάλυσης της κυτταρικής τοξικότητας και της in vitro επούλωσης πληγών. Τα κύτταρα HaCaT μπορούν επίσης να χρησιμοποιηθούν για την αξιολόγηση της τοξικότητας του δέρματος που προκαλείται από διάφορους παράγοντες και νεοπλασματικές ή φλεγμονώδεις διεργασίες. Μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την ανάλυση διαφόρων μηχανισμών δερματικών αλλεργικών αντιδράσεων, των επιδράσεων των δραστικών ειδών οξυγόνου και της ακτινοβολίας από υπεριώδη ακτινοβολία. Κατόπιν διέγερσης, τα κύτταρα HaCaT μπορούν να διαφοροποιηθούν και να εκφράσουν ειδικούς δείκτες διαφοροποίησης, όπως η ινβολουκρίνη, η Κ14 και η Κ10. Τα κύτταρα HaCaT χρησιμοποιούνται επίσης συνήθως ως μοντέλο για τη μελέτη της παθοφυσιολογίας της επιδερμικής ομοιόστασης [6].

Τα κύτταρα HaCaT διατηρούν την ικανότητά τους να αναδημιουργούν μια δομημένη επιδερμίδα in vivo μετά τη μεταμόσχευση, με αποτέλεσμα μια στρωματοποιημένη επιδερμική δομή που μπορεί να επανέλθει μεταξύ βασικής και διαφοροποιημένης κατάστασης με αλλαγές στη συγκέντρωση ασβεστίου στο μέσο. Τα κύτταρα αυτά επιτρέπουν επίσης τον χαρακτηρισμό διαφόρων βιολογικών διεργασιών, όπως η χρήση τους ως πρότυπου συστήματος βιταμίνης D και ο μεταβολισμός στο δέρμα. Επειδή τα κύτταρα HaCaT δεν είναι γενετικά τροποποιημένα, παρουσιάζουν μια αμερόληπτη άποψη του ευρέος φάσματος των αρχικών γενετικών γεγονότων στο ανθρώπινο δέρμα.

5. Προτεινόμενα βίντεο: HaCaT: Εξερευνώντας τον κόσμο των κυττάρων HaCaT

"Μετανάστευση των κυττάρων HaCaT": Αυτό το βίντεο παρουσιάζει τη διαδικασία της κυτταρικής μετανάστευσης στα κύτταρα HaCaT. Η μετανάστευση των κυττάρων είναι μια ουσιαστική διαδικασία για διάφορες βιολογικές διεργασίες, όπως η επούλωση πληγών και η μετάσταση του καρκίνου. Το βίντεο παρουσιάζει την κίνηση των κυττάρων HaCaT κάτω από ένα μικροσκόπιο, παρέχοντας μια οπτική αναπαράσταση του τρόπου μετανάστευσης αυτών των κυττάρων. Η δραστηριότητα των κυττάρων παρατηρείται καθώς μετακινούνται από τη μία θέση στην άλλη και το βίντεο παρέχει μια σαφή απεικόνιση των αλλαγών που συμβαίνουν στα κύτταρα κατά τη διάρκεια αυτής της διαδικασίας.

"Δοκιμασία ξυσίματος που πραγματοποιήθηκε σε κύτταρα HaCaT": Αυτό το βίντεο παρουσιάζει μια δοκιμασία Scratch Assay που πραγματοποιείται σε κύτταρα HaCaT. Το Scratch Assay είναι μια ευρέως χρησιμοποιούμενη τεχνική για τη μελέτη της μετανάστευσης των κυττάρων και σε αυτή την περίπτωση χρησιμοποιείται για την ανάλυση της μετανάστευσης των κυττάρων HaCaT. Το βίντεο παρουσιάζει τη διαδικασία δημιουργίας μιας γρατσουνιάς στην επιφάνεια ενός πιάτου κυτταροκαλλιέργειας, η οποία στη συνέχεια παρατηρείται στο μικροσκόπιο καθώς τα κύτταρα HaCaT μεταναστεύουν και κλείνουν το κενό με την πάροδο του χρόνου.

"Κυτταρική ανάπτυξη κερατινοκυττάρων HaCaT για πειράματα επούλωσης πληγών": Αυτό το βίντεο παρουσιάζει τη διαδικασία της κυτταρικής ανάπτυξης κερατινοκυττάρων HaCaT για πειράματα επούλωσης πληγών. Τα κερατινοκύτταρα HaCaT είναι μια συχνά χρησιμοποιούμενη κυτταρική σειρά σε μελέτες επούλωσης τραυμάτων.

"Διαφοροποίηση κυττάρων HaCaT": Αυτό το βίντεο παρουσιάζει τα απαραίτητα βήματα για τη διαφοροποίηση των κυττάρων HaCaT. Τα κύτταρα HaCaT μπορούν να διαφοροποιηθούν σε διαφορετικούς τύπους δερματικών κυττάρων. Το βίντεο παρουσιάζει τις αλλαγές στα κύτταρα HaCaT καθώς διαφοροποιούνται, αναπαριστώντας οπτικά τους διάφορους δείκτες και τα χαρακτηριστικά της διαφοροποίησης. Η διαδικασία διαφοροποίησης είναι κρίσιμη για τη φυσιολογική λειτουργία του δέρματος και το βίντεο αναδεικνύει τα διάφορα στάδια διαφοροποίησης που υφίστανται τα κύτταρα HaCaT.

Αναφορές

1. Angel P και Karin M: Ο ρόλος των Jun, Fos και του συμπλόκου AP-1 στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και μετασχηματισμό. Biochim Biophys Acta 1072:129-157, 1991 Argyris TS: The regulation of epidermal hyperplastic growth. Crit Rev Toxicol 9:151-200, 1981
2. Baden HP, Kubilus J, Kvedar JC, Steinberg ML, Wolman SR: Απομόνωση και χαρακτηρισμός μιας αυθόρμητα προκύπτουσας μακρόβιας σειράς ανθρώπινων κερατινοκυττάρων (NM-1). In Vitro Cell Dev Biol 23(3):205-13, 1987
3. Lehmann TA, Modali R, Boukamp P, Stanek J, Bennett WP, Welsh JA, Metcalf RA, Stampfer MR, Fusenig NE, Rogan EM, Harriss CC: p53 mutations in human immortalized epithelial cell lines. Καρκινογένεση 14:833-839, 1993
4. Ziegler A-M, Leffell DJ, Kunala S, Sharma HW, Gailani M, Simon JA, Halperin AJ, Baden HP, Shapiro PE, Bale AE, Brash DE: Hotspots μετάλλαξης λόγω ηλιακού φωτός στο γονίδιο p53 του μη μελανωματικού καρκίνου του δέρματος. Proc Natl Acad Sci USA 90:4216-4220, 1993
5. Fusenig NE, Boukamp P. Multiple stages and genetic alterations in immortalization, malignant transformation, and tumor progression of human skin keratinocytes. Mol Carcinog. 1998;23(3):144-158.
6. Harle-Bachor C, Boukamp P: Δραστηριότητα τελομεράσης στην αναγεννητική βασική στιβάδα της επιδερμίδας στο ανθρώπινο δέρμα και σε αθάνατα και καρκινογενή κερατινοκύτταρα του δέρματος. Proc Natl Acad Sci USA 93:6476-81, 1996
7. Colombo I, Sangiovanni E, Maggio R, et al. HaCaT cells as a reliable in vitro differentiation model to dissect the inflammatory/repair response of human keratinocytes. Mediators Inflamm. 2017;2017:7435621.
8. Boukamp, P. et al. Normal keratinization in a spontaneously immortalized aneuploid human keratinocyte cell line. J. Cell Biol. 106, 1996, 761-771.
9. Gibbs, Graham: Graham Gibbs: Ανάλυση ποιοτικών δεδομένων. The Sage qualitative research kit. Λονδίνο: Sage 978-0-7619-4980-0.
10. Hedrick TE, Bickman L, Rog DJ. 1993. Σχεδιασμός εφαρμοσμένης έρευνας: ένας πρακτικός οδηγός. Sage: London
11. Boukamp P. Petrussevska R. T. Breitkreutz D. Hornung J. Markham A. Fusenig N. E. Normal keratinization in a spontaneously immortalized aneuploid human keratinocyte cell line. Cell Biol.(1988);106:761-771.