Κύτταρα HaCaT – Διερεύνηση της βιολογίας και των παθήσεων του δέρματος

Γενετικά χαρακτηριστικά και προέλευση των κυττάρων HaCaT

Τα κύτταρα HaCaT είναι μια αυθόρμητα αθανατοποιημένη σειρά ανθρώπινων κερατινοκυττάρων που προέρχεται από το δέρμα ενηλίκων και αντιπροσωπεύει μια μοναδική εξελικτική πορεία. Αυτά τα κύτταρα παρουσιάζουν μεταλλάξεις και στα δύο αλληλόμορφα του γονιδίου p53, κάτι που είναι τυπικό για μεταλλάξεις που προκαλούνται από την υπεριώδη ακτινοβολία [3,4]. Επιπλέον, τα κύτταρα HaCaT θεωρείται ότι δημιουργήθηκαν από μεταλλάξεις του γονιδίου p53, που καταστέλλει τους όγκους, ακολουθούμενες από την απώλεια γονιδίων γήρανσης [5].

Το γονίδιο καταστολής όγκων p53, γνωστό για τον ρόλο του στην επιδιόρθωση του DNA και ως φύλακας του γονιδιώματος, προκαλεί την αντίδραση του ανθρώπινου δέρματος στη βλάβη του DNA [4]. Έχει παρατηρηθεί ότι τα κύτταρα HaCaT έχουν χάσει εν μέρει τον μηχανισμό προστασίας τους έναντι της βλάβης του DNA λόγω της in vivo μετάλλαξης του γονιδίου p53, καθιστώντας τα ευαίσθητα στη συσσώρευση κυτταρογενετικών αλλαγών σε απόκριση σε αυξημένες θερμοκρασίες καλλιέργειας. Ένας άλλος μηχανισμός αθανατοποίησης των κυττάρων HaCaT περιλαμβάνει την αυξημένη δραστικότητα του ενζύμου τελομεράσης [7]. Στα φυσιολογικά κύτταρα, τα τελομερή συντομεύονται συνεχώς με κάθε κυτταρική διαίρεση έως ότου επιτευχθεί η κυτταρική γήρανση. Η τελομεράση είναι ένα εξειδικευμένο κυτταρικό ενζυμικό σύμπλεγμα με δραστηριότητα αντίστροφης μεταγραφάσης που διατηρεί σταθερό το μήκος των τελομερών. Αντίθετα, τα κύτταρα HaCaT παρουσιάζουν σημαντικά αυξημένη δραστηριότητα τελομεράσης, με αποτέλεσμα το μήκος των τελομερών να διατηρείται σε καλά επίπεδα. Αυτές οι παρατηρήσεις επιβεβαιώνουν τον ρόλο της τελομεράσης στη διαδικασία αθανατοποίησης των κυττάρων HaCaT.

Έχουν εντοπιστεί τρεις συγκεκριμένες χρωμοσωμικές μετατοπίσεις που έχουν ως αποτέλεσμα την απώλεια ενός αντιγράφου των βραχιόνων των χρωμοσωμάτων 3p, 4p και 9p, την απόκτηση του 9q και τον σχηματισμό ισοχρωμοσωμάτων. Η απώλεια του βραχέος βραχίονα του χρωμοσώματος 3p μπορεί να οδηγήσει στην απώλεια γονιδίων γήρανσης και στην αθανατοποίηση των κυττάρων HaCaT [8]. Τα κύτταρα HaCaT είναι υποδιπλοειδή και διαθέτουν διακριτά και σταθερά χρωμοσώματα-δείκτες που αντιπροσωπεύουν τη μονοκλωνική τους προέλευση. Τα χαρακτηριστικά και η κεφαλή της κυτταρικής σειράς HaCaT επιβεβαιώθηκαν με τη χρήση δακτυλικών αποτυπωμάτων DNA με υπερμεταβλητούς δείκτες μινι-δορυφόρων [3-6].

Πώς να συλλέξετε κύτταρα HaCaT σε 5 απλά βήματα

4. Αφαιρέστε το μέσο καλλιέργειας και ξεπλύνετε τα προσκολλημένα κύτταρα χρησιμοποιώντας 3-5 mL PBS χωρίς ασβέστιο και μαγνήσιο για φιάλες T25 ή 5-10 mL για φιάλες T75.
5. Προσθέστε 1-2 mL φρεσκοπαρασκευασμένου διαλύματος EDTA 0,05% ανά φιάλη T25 ή 2,5 mL ανά φιάλη T75, διασφαλίζοντας ότι καλύπτεται ολόκληρο το στρώμα κυττάρων, και επωάστε στους 37°C για 10 λεπτά.
6. Προσθέστε 1 mL φρεσκοπαρασκευασμένου διαλύματος τρυψίνης/EDTA (0,05%/0,025%) ανά φιάλη T25 ή 2,5 mL ανά φιάλη T75, φροντίζοντας και πάλι να καλυφθεί πλήρως το φύλλο κυττάρων. Τα κύτταρα θα πρέπει να αποκολληθούν εντός 1-2 λεπτών.
7. Διακόψτε τη δράση της τρυψίνης προσθέτοντας ένα μέσο κυτταρικής καλλιέργειας που περιέχει FBS.
8. Διανείμετε τα κύτταρα σε νέες φιάλες που περιέχουν φρέσκο μέσο κυτταρικής καλλιέργειας.

Εφαρμογές των κυττάρων HaCaT

Τα κύτταρα HaCaT αποτελούν ένα πολύτιμο εργαλείο για τη μελέτη των κερατινοκυττάρων [9]. Αυτά τα αθάνατα κύτταρα λειτουργούν ως προνεοπλασματικά κύτταρα και μπορούν να προσφέρουν πληροφορίες σχετικά με τις αλλαγές που εμπλέκονται στον κακοήθη και νεοπλασματικό μετασχηματισμό [10]. Οι μονοστρωματικές καλλιέργειες κυττάρων HaCaT είναι απαραίτητες για εφαρμογές ανάλυσης κυτταρικής τοξικότητας και επούλωσης πληγών in vitro. Τα κύτταρα HaCaT μπορούν επίσης να χρησιμοποιηθούν για την αξιολόγηση της δερματικής τοξικότητας που προκαλείται από διάφορους παράγοντες και νεοπλασματικές ή φλεγμονώδεις διεργασίες. Μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την ανάλυση διαφορετικών μηχανισμών δερματικών αλλεργικών αντιδράσεων, των επιδράσεων των αντιδραστικών ειδών οξυγόνου και της ακτινοβολίας από την υπεριώδη ακτινοβολία (UV). Μετά από διέγερση, τα κύτταρα HaCaT μπορούν να διαφοροποιηθούν και να εκφράσουν συγκεκριμένους δείκτες διαφοροποίησης, όπως η ινβολουκρίνη, το K14 και το K10. Τα κύτταρα HaCaT χρησιμοποιούνται επίσης συνήθως ως μοντέλο για τη μελέτη της παθοφυσιολογίας της επιδερμικής ομοιόστασης [6].

Προτεινόμενα βίντεο: Εξερευνώντας τον κόσμο των κυττάρων HaCaT

«Μετανάστευση κυττάρων HaCaT»: Αυτό το βίντεο παρουσιάζει τη διαδικασία της κυτταρικής μετανάστευσης στα κύτταρα HaCaT. Η μετανάστευση των κυττάρων είναι μια ουσιαστική διαδικασία για διάφορες βιολογικές διεργασίες, όπως η επούλωση τραυμάτων και η μετάσταση του καρκίνου. Το βίντεο παρουσιάζει την κίνηση των κυττάρων HaCaT κάτω από μικροσκόπιο, παρέχοντας μια οπτική αναπαράσταση του τρόπου με τον οποίο μεταναστεύουν αυτά τα κύτταρα. Η δραστηριότητα των κυττάρων παρατηρείται καθώς μετακινούνται από τη μία θέση στην άλλη, και το βίντεο παρέχει μια σαφή απεικόνιση των αλλαγών που συμβαίνουν στα κύτταρα κατά τη διάρκεια αυτής της διαδικασίας.

«Δοκιμή γρατσουνιάς που πραγματοποιήθηκε σε κύτταρα HaCaT»: Αυτό το βίντεο παρουσιάζει μια δοκιμή γρατσουνιάς που πραγματοποιήθηκε σε κύτταρα HaCaT. Η δοκιμή γρατσουνιάς είναι μια ευρέως χρησιμοποιούμενη τεχνική για τη μελέτη της κυτταρικής μετανάστευσης και, σε αυτή την περίπτωση, χρησιμοποιείται για την ανάλυση της μετανάστευσης των κυττάρων HaCaT. Το βίντεο παρουσιάζει τη διαδικασία δημιουργίας μιας γρατσουνιάς στην επιφάνεια ενός πιάτου κυτταρικής καλλιέργειας, η οποία στη συνέχεια παρατηρείται κάτω από μικροσκόπιο καθώς τα κύτταρα HaCaT μεταναστεύουν και κλείνουν το κενό με την πάροδο του χρόνου.

«Κυτταρική ανάπτυξη κερατινοκυττάρων HaCaT για πειράματα επούλωσης πληγών»: Αυτό το βίντεο παρουσιάζει τη διαδικασία της κυτταρικής ανάπτυξης κερατινοκυττάρων HaCaT για πειράματα επούλωσης πληγών. Τα κερατινοκύτταρα HaCaT είναι μια κυτταρική σειρά που χρησιμοποιείται συχνά σε μελέτες επούλωσης πληγών.

«Διαφοροποίηση κυττάρων HaCaT»: Αυτό το βίντεο παρουσιάζει τα απαραίτητα βήματα για τη διαφοροποίηση των κυττάρων HaCaT. Τα κύτταρα HaCaT μπορούν να διαφοροποιηθούν σε διαφορετικούς τύπους δερματικών κυττάρων. Το βίντεο παρουσιάζει τις αλλαγές στα κύτταρα HaCaT καθώς διαφοροποιούνται, απεικονίζοντας οπτικά τους διάφορους δείκτες και τα χαρακτηριστικά της διαφοροποίησης. Η διαδικασία διαφοροποίησης είναι κρίσιμη για την κανονική λειτουργία του δέρματος και το βίντεο επισημαίνει τα διαφορετικά στάδια διαφοροποίησης που υφίστανται τα κύτταρα HaCaT.

Αναφορές

1. Angel P και Karin M: Ο ρόλος των Jun, Fos και του συμπλέγματος AP-1 στον πολλαπλασιασμό και τη μεταμόρφωση των κυττάρων. Biochim Biophys Acta 1072:129-157, 1991 Argyris TS: Η ρύθμιση της υπερπλαστικής ανάπτυξης της επιδερμίδας. Crit Rev Toxicol 9:151-200, 1981
2. Baden HP, Kubilus J, Kvedar JC, Steinberg ML, Wolman SR: Απομόνωση και χαρακτηρισμός μιας αυθόρμητα αναδυόμενης μακρόβιας σειράς ανθρώπινων κερατινοκυττάρων (NM-1). In Vitro Cell Dev Biol 23(3):205-13, 1987
3. Lehmann TA, Modali R, Boukamp P, Stanek J, Bennett WP, Welsh JA, Metcalf RA, Stampfer MR, Fusenig NE, Rogan EM, Harriss CC: Μεταλλάξεις του p53 σε ανθρώπινες αθανατοποιημένες σειρές επιθηλιακών κυττάρων. Carcinogenesis 14:833-839, 1993
4. Ziegler A-M, Leffell DJ, Kunala S, Sharma HW, Gailani M, Simon JA, Halperin AJ, Baden HP, Shapiro PE, Bale AE, Brash DE: Σημεία υψηλής συχνότητας μεταλλάξεων λόγω ηλιακής ακτινοβολίας στο γονίδιο p53 του μη μελανωματικού καρκίνου του δέρματος. Proc Natl Acad Sci USA 90:4216-4220, 1993
5. Fusenig NE, Boukamp P. Πολλαπλά στάδια και γενετικές μεταλλάξεις στην αθανατοποίηση, τον κακοήθη μετασχηματισμό και την εξέλιξη του όγκου των κερατινοκυττάρων του ανθρώπινου δέρματος. Mol Carcinog. 1998;23(3):144-158.
6. Harle-Bachor C, Boukamp P: Δραστηριότητα τελομεράσης στο αναγεννητικό βασικό στρώμα της επιδερμίδας στο ανθρώπινο δέρμα και σε αθάνατα και καρκινικά κερατινοκύτταρα του δέρματος. Proc Natl Acad Sci USA 93:6476-81, 1996
7. Colombo I, Sangiovanni E, Maggio R, et al. Τα κύτταρα HaCaT ως αξιόπιστο μοντέλο διαφοροποίησης in vitro για την ανάλυση της φλεγμονώδους/επανορθωτικής απόκρισης των ανθρώπινων κερατινοκυττάρων. Mediators Inflamm. 2017;2017:7435621.
8. Boukamp, P. et al. Φυσιολογική κερατινοποίηση σε μια αυθόρμητα αθανατοποιημένη ανευπλοειδή ανθρώπινη κυτταρική σειρά κερατινοκυττάρων. J. Cell Biol. 106, 1996, 761–771.
9. Gibbs, Graham: Ανάλυση ποιοτικών δεδομένων. Το κιτ ποιοτικής έρευνας Sage. Λονδίνο: Sage 978-0-7619-4980-0.
10. Hedrick TE, Bickman L, Rog DJ. 1993. Σχεδιασμός εφαρμοσμένης έρευνας: ένας πρακτικός οδηγός. Sage: Λονδίνο
11. Boukamp P. Petrussevska R. T. Breitkreutz D. Hornung J. Markham A. Fusenig N. E. Φυσιολογική κερατινοποίηση σε μια αυθόρμητα αθανατοποιημένη ανευπλοειδή ανθρώπινη κυτταρική σειρά κερατινοκυττάρων.  Cell Biol. (1988);106:761–771.